一种用于新冠病毒E484K/Q、K417N/T变异快速检测的引物组合物和试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于新冠病毒E484K/Q、K417N/T 变异快速检测的引物组合物和试剂盒。

背景技术

新型冠状病毒是冠状病毒科、单股正链RNA病毒。与以往的病毒感染不同， 新型冠状病毒感染初期在患者体内大量复制，但并不会引起宿主明显的炎症反应， 因此患者根本无法意识到自己已被感染，然而此时的患者已经具有传染性，从而 导致周围的人也被感染，造成疫情大规模肆虐。目前新型冠状病毒疫苗的广泛使 用，对于疫情的成功防控发挥了重要的作用，然而目前的疫苗仍处于不断完善阶 段，即使接种了疫苗也不能保证不会再被新型冠状病毒感染，而且针对新型冠状 病毒的特效药缺乏。因此，对新型冠状病毒进行准确、快速的检测，及时切断传 染源仍然是目前疫情防控的最主要手段之一。

新型冠状病毒是一种RNA病毒，极易发生变异，刺突糖蛋白(S蛋白)是 新型冠状病毒与宿主受体(ACE2)结合的关键蛋白，其变异对于病毒的传播速 度和免疫逃逸有重要的影响，当前发生于S蛋白的重要变异有N501Y、D614G、 P681H、E484K、K417N、L452R和P681R等。目前新型冠状病毒的变异株主要 分为三大类：关注的变异株(variant of concern,VOC)、感兴趣的变异株(variant of interest，VOI)或正调查的变异株(variant underinvestigation，VUI)、监控的 变异株(variant under monitoring，VUM)。据报道，新型冠状病毒的VOC变异 株传播速度显著增快，例如英国Alpha变异株(B.1.1.7)传染性增加56％，南非 Beta变异株(B.1.351)传染性也显著增加，巴西Gamma变异株传染性增加1.4-2.2 倍，印度Delta变异株(B.1.617.2)传染性提高100％，秘鲁Lambda变异株(C.37) 传染性和疫苗的抵抗力可能变强。其中目前传染速度最快的VOC是Delta变异 株(B.1.617.2，印度变异株)，Delta变异株感染具有感染者病毒载量高、传播速 度快(10天左右传播5代)、患者病情进展迅速、核酸转阴时间长等新特点，因 此，准确的检测出新型冠状病毒并对其进行准确分型，及时了解新型冠状病毒的 动态变化，对于新冠肺炎的诊断、疫情的防控和相关政策的制定具有重要意义。 世界卫生组织专家称：Delta变异株正成为全球主要流行的变异毒株，而目前市 场上少有可以进行相关突变快速检测的试剂盒。

发明内容

为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种用于新冠病毒E484K/Q、 K417N/T变异快速检测的引物组合物和试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面是提供一种用于新冠病毒E484K/Q、K417N/T变异快速 检测的引物组合物，其包括检测E484K/Q的引物体系和检测K417N/T的引物体 系；

该检测E484K/Q的引物体系包括序列为SEQ ID NO.2～6或SEQ ID NO.2～5、 8的引物以及序列为SEQ ID NO.7的探针；

该检测K417N/T的引物体系包括序列为SEQ ID NO.10～14或SEQ ID NO. 10～13、16的引物以及序列为SEQ ID NO.15的探针。

进一步地，设计检测E484K/Q的引物体系所针对的靶片段的序列如SEQ ID NO.1所示；设计检测K417N/T的引物体系所针对的靶片段的序列如SEQ ID NO. 9所示。

本发明的第二方面是提供一种用于新冠病毒E484K/Q、K417N/T变异快速 检测的试剂盒，其包括上述引物组合物。

进一步地，上述试剂盒还包括反应缓冲液、酶溶液、SYBR Green荧光染料 和去离子水。

进一步地，上述试剂盒在检测E484K/Q或K417N/T变异时，所采用的扩增 体系的总体积为25μL，包括：2×反应缓冲液12.5μL，引物F3 1μL，引物B31μL， 引物FIP 1μL，引物BIP1μL，引物LF/LB1μL，探针1μL，酶溶液1μL，SYBR Green荧光染料1μL，模板2μL，去离子水将终体积补足至25μL。

进一步地，在上述扩增体系中，引物F3和B3的终浓度为0.2μmol/L，引物 FIP和BIP的终浓度为1.6μmol/L，引物LF/LB的终浓度为0.8μmol/L，探针的终 浓度为0.8μmol/L；酶溶液的浓度8U。

进一步地，上述试剂盒在检测E484K/Q或K417N/T变异时，所采用的LAMP 反应程序为：58℃-68℃，70min(每个循环1min，扩增70个循环)。

进一步地，上述试剂盒在检测E484K/Q或K417N/T变异时，结果判读的标 准为：CT值<50或50min内出扩增曲线，即判断为阳性。

本发明的第三方面是提供一种采用上述试剂盒的用于新冠病毒E484K/Q、 K417N/T变异快速检测的方法。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明提供的引物组合物和试剂盒灵敏度高、特异性高，不受退火温度的限 制，易于实现多靶标的同步检测，此外，无需复杂、昂贵的辅助设备，在30-60min 内即可准确检测出Delta变异株，目前市场上少有可以进行相关突变快速检测的 试剂盒，具有良好的应用前景。

附图说明

图1是本发明一实施例中验证E484K/Q(图A)和K417N/T(图B)LAMP 检测体系的灵敏度的结果；其中，图中的扩增曲线从右向左，对应的模拟样本浓 度分别为：2×10

图2是本发明一实施例中验证E484K/Q(图A)和K417N/T(图B)LAMP 检测体系的特异性的结果。

具体实施方式

本发明基于LAMP技术开发了一种针对Delta变异株的特征性新突变 (E484K/Q和K417N/T)进行快速检测和鉴定的引物组合物及试剂盒。

下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理 解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使 用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

实施例1

本实施例提供了一种用于新冠病毒株B.1.617.2中的E484K/Q、K417N/T变 异快速检测的引物组合物，该引物组合物包括发明人设计的特异性LAMP引物 和PNA探针以对扩增体系中的非特异性模板(野生型核酸)进行封闭，提高 LAMP检测体系的特异性。

该引物组合物包括针对E484K/Q变异的LAMP引物和探针(如下表1)， E484K/Q变异靶片段(401bp，野生型)为：

ATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTAT AGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACC TGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTC AACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTT

表1针对E484K/Q变异的LAMP引物和探针信息

该引物组合物包括针对K417N/T变异的LAMP引物和探针(如下表2)， K417N/T变异靶片段(401bp，野生型)为：

GTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTAT TCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTC TCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGT AATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGA

表2针对K417N/T变异的LAMP引物和探针信息

实施例2

本实施例提供了一种用于新冠病毒株B.1.617.2中的E484K/Q、K417N/T变 异快速检测的试剂盒，其包括实施例1中的LAMP引物和探针。

采用该试剂盒检测E484K/Q或K417N/T变异时，所采用的扩增体系的总体 积为25μL，包括：2×反应缓冲液(RM)12.5μL，引物F3 1μL(终浓度0.2μmol/L)， 引物B31μL(终浓度0.2μmol/L)，引物FIP 1μL(终浓度1.6μmol/L)，引物BIP 1μL(终 浓度1.6μmol/L)，引物LF/LB1μL(终浓度0.8μmol/L)，PNA1μL(终浓度0.8μmol/L)， 酶溶液1μL(8U)，SYBR Green荧光染料1μL，模板2μL，去离子水将终体积补 足至25μL；

所采用的LAMP反应程序为：58℃-68℃,70min(每个循环1min，扩增70 个循环)；所用的设备为实时PCR仪；

结果判断：CT值<50或50min内出扩增曲线，即判断为阳性。

验证实施例

本实施例对实施例2提供的试剂盒(均以表1和表2中的引物体系1为例) 进行性能检测，具体的检测过程和结果如下：

1.灵敏度：制作梯度浓度的模拟样本，具体浓度为2×10

2.特异性：采用所建立的LAMP体系对临床常见的呼吸道病原甲型流感病 毒RNA、乙型流感病毒RNA、鼻病毒RNA、呼吸道合胞病毒RNA、肠道病毒 RNA和野生型新型冠状病毒模拟样本RNA进行扩增，仅阳性对照样本出现了扩 增曲线，其他样本均为出现任何扩增，表明所建立的E484K/Q和K417N/T LAMP 检测体系具有良好的特异性(如图2)。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不 限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等 同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所 作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 复旦大学附属华山医院北院

<120> 一种用于新冠病毒E484K/Q、K417N/T变异快速检测的引物组合物和试剂盒

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

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