一种羊抗人IgM抗体的纯化方法
文献发布时间:2023-06-19 13:30:50
技术领域
本发明属于生物技术领域,特别涉及一种羊抗人IgM抗体的纯化方法。
背景技术
现有羊抗人IgM抗体开发免疫方案获得的抗血清特异性较低,活性较差,多使用弗氏佐剂进行动物免疫制备抗血清。
将羊抗人IgM抗血清纯化成抗体的方法较为复杂,步骤较多,分离纯化得到的羊抗人IgM抗体纯度不高,且对羊抗人IgM抗体的结构有一定的破坏。
现有方法得率不高,不利于大规模生产。
发明内容
本发明提供了一种羊抗人IgM抗体的纯化方法,以解决现有技术中的问题。
为了实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
一种羊抗人IgM抗体的制备及其纯化方法,包括以下步骤:
A、抗血清的制备方法
A1、准备工作:40-50kg健康绵羊。
(1)、卡介苗液:10ml生理盐水溶解50mg卡介苗;
(2)、初免试剂:1ml抗原(3mg/ml)+ 1ml自制完全佐剂乳化;
(3)、加强免疫试剂:0.5ml抗原(3mg/ml)+ 0.5ml生理盐水+ 1ml自制不完全佐剂乳化;
A2、基础免疫:绵羊颈部两侧和双腹股沟淋巴结内注射50mg卡介苗液;
A3、初免(基础免疫10天后):在肿胀的淋巴结内注入自制完全佐剂乳化的抗原3mg;
A4、二免(初免后3周):在肿胀的淋巴结附近及背部皮下注入自制不完全佐剂乳化的抗原1.5mg;
A5、三免(二免后3周):在肿胀的淋巴结附近及背部皮下注入自制不完全佐剂乳化的抗原1.5mg;
A6、采血:免疫10天后采血测定效价。达到血清效价质量标准后,可进行静脉或动脉采血。若免疫至6免后,血清效价未达到2^19,建议处死。
A7、采血时使用单采浆机采血得到羊血浆,在羊血浆中加入CaCl
进一步的,所述羊抗人IgM血清吸收源为无人IgM的人血清。
进一步的,所述羊抗人IgM血清吸收源的制备方法包括以下步骤:
B1、原料制备:将冷冻保存的人阴性血清在20-25℃流水融化,滤纸过滤去除杂质;
B2、在层析柱中填装鼠抗人IgM(M2910)-CNBr免疫亲和层析填料,使用5-10倍柱体积的10mM PBS(pH 7.4)清洗填料;
B3、平衡:使用5倍柱体积的平衡缓冲液10mM PBS(pH 7.4)平衡层析柱,平衡结束后调整蛋白紫外检测仪A
B4、上样:每mL填料处理10mL人血清,上样速度为4-6mL/min,蛋白紫外检测仪显示值大于0.5时,开始收集流穿液,当蛋白紫外检测仪显示值小于0.5时,停止收集流穿液,将第一遍收集的流穿液再循环上样一次,使抗体充分结合,所得第二遍流穿液即为羊抗人IgM血清吸收源。
进一步的,C、羊抗人IgM抗体的纯化方法,包括以下步骤:
C1、将冷冻保存的羊抗人IgM血清和羊抗人IgM血清吸收源在20-25℃流水融化,脱脂棉过滤去除杂质;
C2、将过滤后的羊抗人IgM血清及其吸收源按体积比5:1的比例混合,100rpm/min搅拌3h,脱脂棉过滤去除杂质;
C3、向步骤C2过滤后的血清中加入等体积的10mM PBS(pH 7.4),搅拌混匀;
C4、在搅拌状态下,每毫升样品中匀速加入1ml的100%饱和硫酸铵溶液(pH 7.0),流速20ml/min;100rpm/min的搅拌速度搅拌10min,静置30min;
C5、9000rpm 4℃离心10min,弃上清,沉淀用10mM PBS(pH 7.4)复溶,复溶后的体积为步骤C2中加入的羊抗人IgM血清体积的1/4倍;
C6、将复溶后的抗体透析至10mM PB+50mM NaCl(pH 7.4)中,透析比为1:50,透析2次,透析时间控制在12-24h之间,透析完成后再次离心,9000rpm 4℃离心10min,弃沉淀,上清用0.22um滤器过滤,保留滤液,弃滤渣;
C7、在层析柱中填装DEAE阴离子交换层析填料,使用5-10倍柱体积的0.1M NaOH过柱,对填料进行活化;
C8、平衡:使用5倍柱体积的10mM PB+50mM NaCl(pH 7.4)平衡层析柱,平衡结束后调整,准备上样;
C9、上样:取与层析柱等体积的步骤C6中得到的滤液上样,蛋白紫外检测仪显示值大于0.3时,开始收集流穿液,当蛋白紫外检测仪显示值小于0.3时,停止收集流穿液,流穿即为羊抗人IgM抗体。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
1、使用自制佐剂及免疫方法进行动物免疫,获得效价为传统免疫方案2倍的高效价抗血清。
2、将羊抗人IgM血清与吸收源按照体积比5:1的比例混合,获得只与人IgM结合的专一特异性血清原料。
3、硫酸铵沉淀法和DEAE纯化法结合使用,抗体得率为90%,且消除了羊抗人IgM抗体的基质效应干扰。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作更进一步的说明。
实施例1
A、抗血清的制备方法,包括以下步骤:
A1、准备工作:40-50kg健康绵羊。
(1)、卡介苗液:10ml生理盐水溶解50mg卡介苗;
(2)、初免试剂:1ml抗原(3mg/ml)+ 1ml自制完全佐剂乳化;
(3)、加强免疫试剂:0.5ml抗原(3mg/ml)+ 0.5ml生理盐水+ 1ml自制不完全佐剂乳化;
A2、基础免疫:绵羊颈部两侧和双腹股沟淋巴结内注射50mg卡介苗液;
A3、初免(基础免疫10天后):在肿胀的淋巴结内注入自制完全佐剂乳化的抗原3mg;
A4、二免(初免后3周):在肿胀的淋巴结附近及背部皮下注入自制不完全佐剂乳化的抗原1.5mg;
A5、三免(二免后3周):在肿胀的淋巴结附近及背部皮下注入自制不完全佐剂乳化的抗原1.5mg;
A6、采血:免疫10天后采血测定效价。达到血清效价质量标准后,可进行静脉或动脉采血。若免疫至6免后,血清效价未达到2^19,建议处死。
A7、采血时使用单采浆机采血得到羊血浆,在羊血浆中加入CaCl
具体地讲,其中:不完全佐剂的制备方法,包括以下步骤:
a1、准备工作:选取合适体积的烧杯和量筒,清洗干净后,完全擦除水分,
a2、搅拌:使用量筒按照3:1的体积比,分别量取石蜡油和乳化剂 Span 80倒入烧杯中,快速(200rpm/min)搅拌混匀1h,搅拌时避免产生气泡,为了避免产生气泡,搅拌时,漩涡不要见容器底部;
a3、 4℃静置12h后如无分层,0.22μm滤膜过滤后,将滤液分装保存,保存温度为2-8℃。
4℃静置12h后若出现分层,其原因为石蜡油和乳化剂 Span 80未能混合均一,将其搅拌混合均一即可。
具体地讲,其中:完全佐剂的制备方法,包括以下步骤:
b1、准备工作:选取合适体积的烧杯、量筒、研钵,清洗干净后,使用厨房用纸将水分完全擦除,
b2、研磨:准确分别量取2g冻干卡介苗和冻干聚肌胞干粉,于研钵中研磨,直至无颗粒状固体,
b3、搅拌:使用量筒量取300ml石蜡油和100ml 乳化剂 Span 80倒入烧杯中,快速(200rpm/min)搅拌混匀1h,搅拌时避免产生气泡,为了避免产生气泡,搅拌时,漩涡不要见容器底部;然后4℃静置12h,如无分层,0.22μm滤膜过滤后,在滤液中加入上述研磨后冻干粉,搅拌(200rpm/min)混匀30min,分装入库,分装时需持续搅拌。
4℃静置12h后若出现分层,其原因为石蜡油和乳化剂 Span 80未能混合均一,将其搅拌混合均一即可。
作为一个优选方案,所述羊抗人IgM血清吸收源为无人IgM的人血清,所述羊抗人IgM血清吸收源的制备方法包括以下步骤:
B1、原料制备:将冷冻保存的人阴性血清在20-25℃流水融化,滤纸过滤去除杂质;
B2、在层析柱中填装鼠抗人IgM(M2910)-CNBr免疫亲和层析填料,使用5-10倍柱体积的10mM PBS(pH 7.4)清洗填料;
B3、平衡:使用5倍柱体积的平衡缓冲液10mM PBS(pH 7.4)平衡层析柱,平衡结束后调整蛋白紫外检测仪A
B4、上样:每mL填料处理10mL人血清,上样速度为4-6mL/min,蛋白紫外检测仪显示值大于0.5时,开始收集流穿液,当蛋白紫外检测仪显示值小于0.5时,停止收集流穿液,将第一遍收集的流穿液再循环上样一次,使抗体充分结合,所得第二遍流穿液即为羊抗人IgM血清吸收源。
C、羊抗人IgM抗体的纯化方法,包括以下步骤:
C1、将冷冻保存的羊抗人IgM血清和羊抗人IgM血清吸收源在20-25℃流水融化,脱脂棉过滤去除杂质;
C2、将过滤后的羊抗人IgM血清及其吸收源按体积比5:1的比例混合,100rpm/min搅拌3h,脱脂棉过滤去除杂质;
C3、向步骤C2过滤后的血清中加入等体积的10mM PBS(pH 7.4),搅拌混匀;
C4、在搅拌状态下,每毫升样品中匀速加入1ml的100%饱和硫酸铵溶液(pH 7.0),流速20ml/min;100rpm/min的搅拌速度搅拌10min,静置30min;
C5、9000rpm 4℃离心10min,弃上清,沉淀用10mM PBS(pH 7.4)复溶,复溶后的体积为步骤C2中加入的羊抗人IgM血清体积的1/4倍;
C6、将复溶后的抗体透析至10mM PB+50mM NaCl(pH 7.4)中,透析比为1:50,透析2次,透析时间控制在12-24h之间,透析完成后再次离心,9000rpm 4℃离心10min,弃沉淀,上清用0.22um滤器过滤,保留滤液,弃滤渣;
C7、在层析柱中填装DEAE阴离子交换层析填料,使用5-10倍柱体积的0.1M NaOH过柱,对填料进行活化;
C8、平衡:使用5倍柱体积的10mM PB+50mM NaCl(pH 7.4)平衡层析柱,平衡结束后调整,准备上样;
C9、上样:取与层析柱等体积的步骤C6中得到的滤液上样,蛋白紫外检测仪显示值大于0.3时,开始收集流穿液,当蛋白紫外检测仪显示值小于0.3时,停止收集流穿液,流穿即为羊抗人IgM抗体。
本发明的关键保护点:
1、抗血清制备方案;
2、抗体纯化方案中吸收源成分:无人IgM的人血清。
3、纯化方案中DEAE纯化方法。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出:对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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