一种熟地黄多糖的制备方法、产品及其应用

技术领域

本发明属于药物提取技术领域，具体涉及一种熟地黄多糖的制备方法、产品及其应用。

背景技术

地黄为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的新鲜或干燥块根，始载于《神农本草经》列为上品，可鲜用，也可炮制后服用，分为鲜地黄、干地黄和熟地黄，其中，鲜地黄用于热病伤阴，舌绛烦渴，温毒发斑，吐血，衄血，咽喉肿痛；干地黄用于热入营血，温毒发斑，吐血，衄血，热病伤阴，知绛烦渴，津伤便秘，咽喉肿痛；熟地黄是生地黄的炮制品，具有益精添髓、滋阴补血等作用，用于血虚萎黄，心悸怔忡，月经不调，崩漏下血，肝肾阴虚，腰膝酸软，骨蒸潮热，盗汗遗精，内热消渴，眩晕，耳鸣，颏发早白。

研究表明，地黄中包含丰富的多糖类成分，是地黄发挥药效作用的重要活性成分。地黄多糖有提高机体免疫力，抗肿瘤，抗疲劳、抗焦虑等生物活性。由于多糖类成分具备这些独特的药理活性，近年来已经成为现代医学和食品功能化学共同关注的焦点。由于鲜地黄不易存放，对温度比较敏感，容易被氧化，因此临床应用和活性研究都较少，目前普遍采用将鲜地黄炮制，得到熟地黄，并进一步提取其中的熟地黄多糖。地黄炮制为熟地黄后其补血益精填髓的作用增加，多认为炮制后多糖类成分含量升高。

当前，对于熟地黄多糖的制备研究较多，但是，不同的炮制工艺以及不同的提取方法得到的熟地黄多糖的成分也存在较大差异，因此其功效也不相同；而且，现有熟地黄多糖制备工艺中，对熟地黄多糖的提取率较低，制约了其在实际生产中的应用，因此，若能研发一种制备具有固定组成的熟地黄多糖，且熟地黄多糖得率较高的方法，将会极大的推动熟地黄产业化进程及其应用范围。

发明内容

为克服现有技术的上述问题，本发明提供了一种熟地黄多糖的制备方法、产品及其应用。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了一种熟地黄多糖的制备方法，包括以下步骤：首先对熟地黄进行酶解，所得酶解液经超声提取、醇沉得到熟地黄总多糖，之后采用三氯乙酸-乙醚法去除所得熟地黄总多糖中的蛋白，将得到的熟地黄粗多糖经离子交换色谱柱分离，再经凝胶柱串联色谱分离，得到所述熟地黄多糖。

优选的，所述熟地黄的制备方法为：取鲜地黄，切成厚度为0.5～1.0cm的薄片，加入6～16倍体积的水，浸泡2～3h，之后加入鲜地黄2倍体积的黄酒，静置8～10h，然后在0.10～0.15MPa下蒸制4～5h，取出，放入50℃烘箱中干燥24h，即得所述熟地黄。

优选的，所述酶解具体方法为：首先向熟地黄中加水，并加入由果胶酶、木瓜蛋白酶及木质素过氧化物酶组成的复合酶对熟地黄进行酶解，之后再加入胰蛋白酶酶解。

优选的，所述复合酶中果胶酶、木瓜蛋白酶及木质素过氧化物酶的质量比为2∶2∶1，复合酶与熟地黄的质量比为0.12∶1，水与熟地黄的体积比为(5～8)∶1。

优选的，所述复合酶对熟地黄进行酶解时的pH在4～5之间，在50℃下酶解1h。

优选的，所述胰蛋白酶与熟地黄的质量比为0.05∶1，胰蛋白酶加入前调节pH为7.5～8.5之间，在37℃下酶解1h，之后加热至95℃灭酶。

优选的，所述超声提取温度为50℃，功率为80W，时间为1h。

优选的，所述醇沉采用乙醇，溶液中乙醇浓度为90wt％；所述三氯乙酸-乙醚法采用的萃取液由三氯乙酸和乙醚按体积比1:8配制得到。

优选的，所述离子交换色谱柱分离的色谱条件为：色谱柱：DEAE-Sepharose FF柱；流速：50mL/h；梯度洗脱程序：0～20min水，20～40min 0.2M NaCl，40～60min0.5M NaCl，60～80min 2M NaCl；所述凝胶柱串联色谱的填料为Superdex-200。

本发明还提供了一种根据上述制备方法制备得到的熟地黄多糖。

本发明同时提供了上述熟地黄多糖在制备心肌保护药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种熟地黄多糖的制备方法，制备得到具有固定组成的熟地黄多糖，为熟地黄多糖的质量控制及规范化生产提供依据，拓宽了地黄多糖的应用范围。

本发明制备得到的熟地黄多糖具有心肌保护作用，可用于心肌保护药物的制备。

采用本发明提供的方法制备熟地黄多糖，产品得率高，适于工业化生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1制备的熟地黄多糖的HPGPC图谱；

图2为实施例1制备的熟地黄多糖的红外光谱图；

图3为实施例1制备的熟地黄多糖的HH-COSY图谱；

图4为实施例1制备的熟地黄多糖的HSQC图谱；

图5为实施例1制备的熟地黄多糖的HMBC图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。

另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明实施例所用鲜地黄选自河南焦作的怀地黄新鲜块根。

以下实施例所采用的木质素过氧化物酶购自上海源叶生物科技有限公司，货号为S27534-10mg；果胶酶购自：河北源乐生物科技有限公司；木瓜蛋白酶购自：河北颖泉生物科技有限公司，酶活力为10万U/g；胰蛋白酶购自：山东阔泉生物科技有限公司，酶活力为5万iu/g。

实施例1

熟地黄多糖的制备，包括以下步骤：

(1)取鲜地黄，切成厚度为0.5～1.0cm的薄片，加10倍体积的水，浸泡2.5h，之后加入鲜地黄2倍体积的黄酒，静置9h，然后在0.15MPa下蒸制5h，取出，放入50℃烘箱中干燥24h，即得熟地黄；

(2)取步骤(1)得到的熟地黄5kg，切碎，加入6倍体积的蒸馏水，再加入由果胶酶、木瓜蛋白酶及木质素过氧化物酶按照质量比为2∶2∶1组成的复合酶600g，调节pH至4.5，搅拌均匀，在50℃恒温下酶解1h，之后将温度降至37℃，调节pH为8，加入250g胰蛋白酶，搅拌均匀，继续恒温酶解1h，然后加热至95℃灭酶得到酶解液；

(3)将步骤(2)得到的酶解液转移至超声波提取机中，设定温度为50℃、功率为80W，超声时间1h，过滤，旋转薄膜蒸仪浓缩，得流浸膏，加入1L蒸馏水分散溶解，然后加入95％工业乙醇至90wt％醇浓度，静置24h，离心，得沉淀，挥干乙醇，得醇沉熟地黄总多糖；

(4)将三氯乙酸和乙醚按照体积比为1∶8配制得到萃取液，向步骤(3)得到的醇沉熟地黄总多糖中加入8倍体积的蒸馏水，之后加入所得溶液5倍体积的萃取液萃取，置摇床震摇20min，转移至分液漏斗中，静置，取上层液体，离心1min除去残余蛋白质沉淀，重复3次，得到除蛋白后的熟地黄粗多糖溶液，减压浓缩干燥，得熟地黄总多糖1.8kg；

(5)采用DEAE-Sepharose FF柱，并与流分收集器和蠕动泵相连。依次用蒸馏水、0.2、0.4和2mol/L NaCl以50mL/h的流速洗脱，梯度洗脱程序：0～20min水，20～40min 0.2MNaCl，40～60min 0.5M NaCl，60～80min 2M NaCl，10mL试管收集洗脱液标号，用苯酚-硫酸法在490nm处测吸光度值，绘制散点图，收集30～60min峰的洗脱液，浓缩，3500Da透析袋透析，冷冻干燥，得到洗脱部位Fr.B，134g。

取Fr.B多糖组分100mg，蒸馏水3mL溶解，离心机离心(12000rpm)10min，上清液通过葡聚糖凝胶Superdex-200柱进一步分离纯化，示差检测器在线检测收集100-140min峰，合并溶液通过旋转蒸发仪进行浓缩，冷冻干燥，得到的组分即为熟地黄多糖，为24mg。

采用离子色谱法测定熟地黄多糖的单糖组成，步骤如下：

(1)以鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、岩藻糖、盐酸氨基葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸混合单糖标准品作为对照。

(2)分别取4mg多糖样品，加入1mL的2M三氟乙酸溶液(TFA)，用氮气密封混合物，120℃水解3h。精密吸取200μL酸水解液于1.5mL EP管中，用氮气吹干。向EP管中加入1mL蒸馏水，并涡旋溶解。上清液以12000rpm离心5min，用离子色谱仪(ICS5000)进行检测分析。色谱条件为：DionexCarbopacTMPA20色谱柱(3×150mm)，柱温30℃，进样量5μL，流速：0.3mL/min，流动相：A：H

测试发现，本实施例制备得到的熟地黄多糖由鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)和半乳糖醛酸(GalA)组成，摩尔百分比分别为3.9％、31.8％、45.0％、9.5％、9.8％。

采用高效凝胶渗透色谱(HPGPC)测定多糖的分子量(如图1所示)，优化条件为：岛津LC-10A高效液相色谱仪，RI-502示差检测器，串联凝胶色谱柱(8×300mm)；流动相为0.05M NaCl溶液，流速：0.6mL/min，柱温：40℃；进样量：20μL。以不同分子量葡聚糖标准品建立回归曲线，计算分子量。葡聚糖标准品(1152、5000、11600、23800、48600、80900、148000、273000)分别用流动相临用前配制成浓度5mg/mL溶液，以分子量的lg值为横坐标，以保留时间RT为纵坐标作标准曲线，lgMp-RT校正曲线方程为：Y＝-0.1933X+12.336(R

通过甲基化和糖醛酸还原分析，以及红外光谱、1H NMR谱、13C NMR谱、DEPT135一维图谱和二维图谱，对多糖的糖苷键信号进行归属；熟地黄多糖的红外光谱图如图2所示，HH-COSY图谱如图3所示，HSQC图谱如图4所示，HMBC图谱如图5所示。

该多糖的主链存在L1：→2,4)-α-L-Rha-(1→4)-α-D-GalpA-(1→的链接方式；支链结构中存在有L2：α-D-Galp-(1→6)-α-D-Galp-(1→，糖苷键L3：→6)-α-D-Galp-(1→5-α-L-Araf-(1→，L4：→5)-α-L-Araf-(1→3,5)-α-L-Araf-(1→的链接方式，支链R1：α-D-Galp-(1→6)-α-D-Galp-(1→5)-α-L-Araf-(1→3,5)-α-L-Araf-(1→；并且含有L5：→3,6)-β-D-Galp-(1→5)-α-L-Araf-(1→，L7：→5)-α-L-Araf-(1→2,4)-α-L-Rha-(1→，支链R2：α-L-Araf-(1→3,6)-β-D-Galp-(1→5)-α-L-Araf-(1→；以及存在L6：→4)-β-D-Galp-(1→5)-α-L-Araf-(1→，L8：→3,5)-α-L-Araf-(1→2,4)-α-L-Rha-(1→，支链：R3：α-L-Araf-(1→4)-β-D-Galp-(1→5)-α-L-Araf-(1→；综合表明，该多糖的结构：主链连接方式为→2,4)-α-L-Rha-(1→4)-α-D-GalpA-(1→的糖苷键，而支链R1、R2、R3通过→2,4)-α-L-Rha-(1→的O-2键连接在主链上。

解析结果如下：

表1熟地黄多糖的甲基化糖醇乙酰酯(PMAA)结果分析

表2熟地黄多糖的氢，碳信号归属

实施例2

熟地黄多糖的制备，包括以下步骤：

(1)取鲜地黄，切成厚度为0.5～1.0cm的薄片，加10倍体积的水，浸泡2.5h，之后加入鲜地黄2倍体积的黄酒，静置9h，然后在0.15MPa下蒸制5h，取出，放入50℃烘箱中干燥24h，即得熟地黄；

(2)取步骤(1)得到的熟地黄5kg，切碎，加入6倍体积的蒸馏水，再加入由果胶酶、木瓜蛋白酶及木质素过氧化物酶按照质量比为2∶2∶1组成的复合酶600g，调节pH至4.5，搅拌均匀，在50℃恒温下酶解1h，之后将温度降至37℃，调节pH为8，加入250g胰蛋白酶，搅拌均匀，继续恒温酶解1h，然后加热至95℃灭酶得到酶解液；

(3)将步骤(2)得到的酶解液转移至超声波提取机中，设定温度为50℃、功率为80W，超声时间1h，过滤，旋转薄膜蒸仪浓缩，得流浸膏，加入1L蒸馏水分散溶解，然后加入95％工业乙醇至90wt％醇浓度，静置24h，离心，得沉淀，挥干乙醇，得醇沉熟地黄总多糖；

(4)将三氯乙酸、乙醚和乙酸乙酯按照体积比为1∶8∶2配制得到萃取液，向步骤(3)得到的醇沉熟地黄总多糖中加入8倍体积的蒸馏水，之后加入所得溶液5倍体积的萃取液萃取，置摇床震摇20min，转移至分液漏斗中，静置，取上层液体，离心1min除去残余蛋白质沉淀，重复3次，得到除蛋白后的熟地黄粗多糖溶液，减压浓缩干燥，得熟地黄总多糖1.91kg；

(5)采用DEAE-Sepharose FF柱，并与流分收集器和蠕动泵相连。依次用蒸馏水、0.2、0.4和2mol/L NaCl以50mL/h的流速洗脱，梯度洗脱程序：0～20min水，20～40min 0.2MNaCl，40～60min 0.5M NaCl，60～80min 2M NaCl，10mL试管收集洗脱液标号，用苯酚-硫酸法在490nm处测吸光度值，绘制散点图，收集30～60min峰的洗脱液，浓缩，3500Da透析袋透析，冷冻干燥，得到洗脱部位Fr.B，145g。

取Fr.B多糖组分100mg，蒸馏水3mL溶解，离心机离心(12000rpm)10min，上清液通过葡聚糖凝胶Superdex-200柱进一步分离纯化，示差检测器在线检测收集100-140min峰，合并溶液通过旋转蒸发仪进行浓缩，冷冻干燥，得到的组分即为熟地黄多糖，为27mg。

对比例1

同实施例1，区别在于，步骤(1)为取鲜地黄，切成厚度为0.5～1.0cm的薄片，蒸4h，75℃干燥10h，取出，凉晾，反复蒸3次，即得熟地黄；步骤(2)～(5)同实施例1。

采用该对比例的方法，步骤(4)得到熟地黄总多糖1.58kg，步骤(5)得到Fr.B，115g，100mg的Fr.B经葡聚糖凝胶Superdex-200柱进一步分离纯化得到熟地黄多糖21mg。

对比例2

同实施例1，区别在于，步骤(2)的复合酶中不加入木质素过氧化物酶。

采用该对比例的方法，步骤(4)得到熟地黄总多糖1.51kg，步骤(5)得到Fr.B，109g，100mg的Fr.B经葡聚糖凝胶Superdex-200柱进一步分离纯化得到熟地黄多糖18mg。

对比例3

同实施例1，区别在于，将步骤(4)中的乙醚替换为正丁醇。

采用该对比例的方法，步骤(4)得到熟地黄总多糖1.53kg，步骤(5)得到Fr.B，110g，100mg的Fr.B经葡聚糖凝胶Superdex-200柱进一步分离纯化得到熟地黄多糖19mg。

效果验证

仪器与材料：二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)；5920R高速离心机(德国Eppendrof公司)；SW-CJ-2F超净工作台(苏州净化工作台设备有限公司)；Epoch2酶标仪(美国BIOTEK公司)。

大鼠心肌细胞H9c2购自中科院上海细胞库；MTT、LPS购自Sigma公司；青霉素、链霉素、FBS、DMEM购自Gibco公司；大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α酶联免疫吸附测定试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。

熟地黄多糖：采用实施例1的方法制备得到。

实验方法

1.熟地黄多糖对LPS刺激的H9c2细胞活力的影响：含10％胎牛血清和1％青-链霉素DMEM培养基在培养箱中培养H9c2细胞，取对数生长期细胞，以4×10

2.熟地黄多糖对LPS刺激的H9c2细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α的影响：取浓度为4×10

统计分析通过单因素方差(one-way ANOVA)分析进行组间比较。所有数据以Mean±SD表示，P<0.05表示与对照组相比有显著性差异，P<0.01表示有极显著性差异。

表3

注：与LPS组对比，*P＜0.05，**P＜0.01

表4

注：与LPS组对比，#P＜0.05，##P＜0.01

由表3可以看出：与LPS组相比，熟地黄多糖在10～100μg/mL的浓度范围内，对LPS刺激的H9c2细胞活力均有显著的干预作用(P＜0.05)，说明熟地黄多糖具有心肌保护作用。

由表4可以看出：与LPS组相比，10～100μg/mL的浓度范围内，熟地黄多糖可显著降低H9c2细胞中细胞因子的增加(P＜0.01)，减弱LPS引起的炎症损伤；熟地黄多糖的低、中、高剂量可显著降低TNF-α水平(P＜0.01)，低、高剂量可显著降低IL-6水平(P＜0.05)，高剂量可显著降低IL-1β水平(P＜0.05)。

综上所述，本发明制备得到的熟地黄多糖能显著改善脂多糖对H9c2细胞造成的细胞活力降低IL-1β、TNF-α与IL-6水平升高，从而具有心肌保护的作用。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。