微生物纳米线的诱导表达和纯化方法

技术领域

本发明涉及一种微生物纳米线的诱导表达和纯化方法，属于蛋白质工程技术领域。

背景技术

微生物纳米线(microbial nanowires)，也被称为蛋白质纳米线(proteinnanowires)，最初发现于硫还原地杆菌Geobacter sulfurreducens，是一种类似鞭毛的微生物附属结构。微生物纳米线具有导电性、长度可达数十微米，能够将电子传递到胞外电子受体，从而使细菌能够在缺乏可溶性、可透过膜的电子受体(例如氧气)的恶劣环境中呼吸，在微生物生命活动中有着独特作用。

微生物纳米线被认为是一类极具应用价值的绿色能源材料，具有良好的生物相容性与生物可降解性，代表着微生物电化学未来重要的发展方向。微生物纳米线优良的导电性能赋予了它相比于其他电子传递方式更高的电子传递效率，而其特殊的结构形态又赋予了它可以使电活性微生物不需要直接接触电子受体就可以实现胞外电子传递的能力。但是，目前微生物纳米线的研究仍处于起步阶段。首先，不同方法诱导微生物表达纳米线的对比研究鲜见报道；其次，微生物纳米线的电子传递机制仍存在争议，生态学功能仍待发掘，实际应用还有待拓展。当前的主要技术瓶颈在于如何提高微生物纳米线的诱导表达和提纯效率，促进其规模应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种微生物纳米线的诱导表达和纯化方法，为微生物纳米线的结构和功能研究及其应用提供基础。

本发明所纯化的是硫还原地杆菌Geobacter sulfurreducens产生的纳米线，由细胞色素OmcS紧密堆叠聚合而成，或者由PilA蛋白组成的IV型菌毛，以此来区别其他微生物产生的纳米线。

本发明所提供的微生物纳米线的诱导表达和纯化方法中，所选用微生物包括所有能产生导电纳米线的微生物(纯菌或者混菌)，包括但不限于Geobacter sulfurreducens；Shewanella oneidensis；Flexistipes sinusarabici DSM 4947；Calditerrivibrionitroreducens DSM 19672；Desulfurivibrio alkaliphilus AHT2；MethanospirillumHungatei和Acidithiobacillus ferrooxidans等。

本发明所提供的微生物纳米线的诱导表达方法为如下1)-3)中的任一种：

1)在电子受体不足和亚适温度下诱导微生物产生微生物纳米线；

2)在不存在可溶性电子受体的情况下诱导微生物产生微生物纳米线；

3)在微生物电化学系统中使用电极作为唯一电子受体来诱导微生物产生微生物纳米线；

所述微生物为能产生导电纳米线的纯菌或者混菌，所述混菌包括厌氧污泥、富集Geobacter属的混菌、以及微生物电化学系统预驯化菌等；

所述微生物可为Geobacter sulfurreducens、Shewanella oneidensis，具体可为Geobacter sulfurreducens；

所述1)具体可为：以40mM富马酸盐作为电子受体在25℃亚适温度下诱导Geobacter sulfurreducens产生纳米线；

所述2)具体可为：使用柠檬酸铁或者其他结晶度差的铁锰氧化物作为电子受体诱导Geobacter sulfurreducens产生纳米线；

所述3)中，所述微生物电化学系统可为微生物燃料电池或微生物电解池；

所述电极可为石墨、生物炭电极、碳布、碳毡和碳刷；或自制电极，如石墨烯基电极和贵金属基电极等。

自制生物炭电极的步骤如下：

将新鲜甘蔗切成2×2cm，厚度为1-2mm，并在60℃的烘箱中干燥过夜；

然后将其在管式炉中在N

将炭化后甘蔗炭加工成所需的尺寸(1×1cm)并与钛线连接以制备成所需电极。

本发明还提供一种微生物纳米线的纯化方法。

本发明所提供的微生物纳米线的纯化方法，包括如下步骤：

(1)收集表达纳米线的微生物，使其悬浮于150mM乙醇胺缓冲液中；

(2)剪切纳米线，离心去除细胞；

(3)上清液中的纳米线用5-30％硫酸铵(基于硫酸铵在水中的饱和度)沉淀过夜，然后离心；

(4)将沉淀物重悬浮在乙醇胺缓冲液中，离心去除杂质；

(5)收集上清液中的纳米线用5-30％硫酸铵沉淀，然后离心；

(6)将沉淀物中的纳米线重悬浮在乙醇胺缓冲液中，然后用去离子水进行透析后，保存在4℃下，即可。

对于由方法1)产生的微生物纳米线，步骤(1)的操作为：将生长良好的Geobactersulfurreducens菌液13000g离心，收集细胞，使其充分悬浮于150mM乙醇胺缓冲液(pH＝10.5)中；

对于由方法2)产生的微生物纳米线，步骤(1)的操作为：13000g离心菌液，收集细胞，使其充分悬浮于150mM乙醇胺缓冲液(pH＝10.5)中；

对于由方法3)产生的微生物纳米线，步骤(1)的操作为：当微生物电化学系统产电达到最高值时，收集阳极生物膜并悬浮到150mM乙醇胺缓冲液中(pH＝10.5)；

步骤(2)中，剪切纳米线即从微生物表面剪切纳米线，剪切纳米线的方法可为机械法或震荡法，

所述机械法可通过组织捣碎匀浆机JJ-2B实现，更具体可为在组织捣碎匀浆机JJ-2B中以最高速(16000r/min)剪切纳米线60s，

所述震荡法可通过涡旋振荡器实现，更具体可为使用涡旋振荡器剧烈振荡分离纳米线120s；

步骤(2)中，所述离心力具体可为13,000g离心力去除细胞；

步骤(3)中，所述离心力具体可为13,000g离心力；

步骤(4)中，将沉淀物使用涡旋振荡器剧烈震荡离心管10s重新悬浮在乙醇胺缓冲液中；

所述离心力为以23,000g离心力去除杂质；

步骤(5)中，所述离心力具体可为13,000g离心力；

步骤(6)中，纳米线使用涡旋振荡器剧烈震荡离心管10s重悬在乙醇胺缓冲液。

提纯后的微生物纳米线通过透射电子显微镜进行表征，样品制样方法为使用磷钨酸或者醋酸双氧铀等负染。

微生物纳米线经过剪切提纯后，尺寸、形貌结构保持良好，分散均匀。

本发明的效果：本发明采用机械或者震荡的方式剪切微生物纳米线，然后通过乙醇胺悬浮和硫酸铵沉淀的方法反复纯化，最终获得的微生物纳米线尺寸均一、形貌结构保持良好。

附图说明

图1为生长良好的硫还原地杆菌Geobacter sulfurreducens；

图2为硫还原地杆菌Geobacter sulfurreducens表达的微生物纳米线；

图3为微生物燃料电池工作原理图，R:电阻；e

图4为混菌在电极上形成的生物膜大量表达微生物纳米线；

图5为柠檬酸铁作为唯一电子受体诱导混菌表达微生物纳米线；

图6为提纯后的硫还原地杆菌Geobacter sulfurreducens纳米线；

图7(A)为剪切时间过长导致微生物纳米线过短；(B)为重悬浮未完全分散的微生物纳米线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、三种方法诱导微生物纳米线表达

第一种：使用富马酸盐(40mM)作为电子受体在厌氧瓶里面诱导Geobactersulfurreducens表达微生物纳米线。

1、配制培养基(1.5g/L氯化铵、0.775g/L二水磷酸二氢钠、0.1g/L氯化钾、2.5g/L碳酸氢钠、1.23g/L乙酸钠、1g/L酵母、6.4g/L富马酸二钠、0.5g/L半胱氨酸、10mL/L微量元素溶液、10mL/L维生素溶液)，加入厌氧瓶中，使用高纯氮曝气除氧1h；

2、密封厌氧瓶，然后在高压灭菌锅121℃灭菌20min；

3、在厌氧培养箱内接种Geobacter sulfurreducens，其中乙酸盐(15mM)作为电子供体，而富马酸盐(40mM)作为电子受体；

4、在严格的厌氧条件下在化学恒温器中于25℃下培养Geobactersulfurreducens，如图1所示，生长良好的Geobacter sulfurreducens菌呈现粉红色。如图2所示，Geobacter sulfurreducens菌表达的微生物纳米线。

第二种：在微生物电化学系统中使用电极作为唯一电子受体诱导纯菌Geobactersulfurreducens或者混菌表达微生物纳米线。

1、搭建微生物电化学反应器(如图3所示)。

其中电极使用自制生物炭电极作为唯一的电子受体；

自制生物炭电极步骤如下：

将新鲜甘蔗切成2×2cm，厚度为1-2mm，并在60℃的烘箱中干燥过夜；

然后将其在管式炉中在N

将炭化后甘蔗炭加工成所需的尺寸(1×1cm)并与钛线连接以制备成所需电极；

2、加入电解液(2g/L乙酸钠、12.5mL/L微量元素溶液、5mL/L维生素溶液、50mM PBS缓冲液)，使用高纯氮曝气除氧30min，然后在高压灭菌锅121℃灭菌20min；

3、接种混菌(使用微生物电化学系统预驯化菌)，其中2g/L乙酸盐作为电子供体；

4.使用电压数据采集系统监测微生物电化学系统电压变化。如图4所示，混菌在电极上形成的生物膜大量表达微生物纳米线。

第三种：使用柠檬酸铁作为电子受体诱导Geobacter sulfurreducens或者混菌(厌氧污泥)表达微生物纳米线。

1、配制培养基(2g/L乙酸钠、12.2g/L柠檬酸铁、12.5mL/L微量元素溶液、5mL/L维生素溶液、50mM PBS缓冲液)，加入厌氧瓶中，使用高纯氮曝气除氧1h；

2、密封厌氧瓶，然后在高压灭菌锅121℃灭菌20min；

3、接种厌氧污泥，其中乙酸盐作为电子供体，柠檬酸铁作为唯一电子受体。如图4所示，使用柠檬酸铁作为唯一电子受体从混菌里面诱导表达微生物纳米线。

实施例2：微生物纳米线的提纯方法

收集表达微生物纳米线的微生物，三种方式对应三种诱导微生物表达纳米线的方法：

第一种：使用离心机将生长良好的Geobacter sulfurreducens菌液13000g离心，并收集细胞，使其充分悬浮于150mM乙醇胺缓冲液(pH＝10.5)中；

第二种：当微生物电化学系统产电达到最高值时，收集阳极生物膜并悬浮到150mM乙醇胺缓冲液中(pH＝10.5)；

第三种：使用离心机13000g离心菌液，并收集细胞，使其充分悬浮于150mM乙醇胺缓冲液(pH＝10.5)中；

剪切纳米线(在组织捣碎匀浆机JJ-2B中以最高速16000r/min从细胞中剪切纳米线60s，或者使用涡旋振荡器剧烈振荡分离纳米线120s)，以13,000g离心去除细胞；

上清液中的纳米线用10％硫酸铵(基于硫酸铵在水中的饱和度)沉淀过夜，然后以13,000g离心；

将沉淀物重新悬浮在乙醇胺缓冲液中，并以23,000g的离心力去除其他碎片；

收集纳米线，再用10％硫酸铵沉淀，然后以13,000g离心；

将最终纳米线重悬在乙醇胺缓冲液中，用去离子水进行透析后，保存在4℃下。图6为提纯后的微生物纳米线。

实施例3：微生物纳米线提纯参数优化

3.1纳米线剪切时间优化：

剪切时间短(30-60s)：组织捣碎匀浆机JJ-2B中以最高速16000r/min剪切纳米线30s，或者使用涡旋振荡器剧烈振荡分离纳米线60s，以至纳米线无法从微生物表面剪切下来，导致提纯产量降低，具体步骤如下：

1、使用离心机将生长良好的Geobacter sulfurreducens菌液以13000g离心力离心，并收集细胞，使其充分悬浮于150mM乙醇胺缓冲液(pH＝10.5)中；

2、剪切纳米线(在组织捣碎匀浆机JJ-2B中以最高速16000r/min从细胞中剪切纳米线30s，或者使用涡旋振荡器剧烈振荡分离纳米线60s)，以13,000g离心去除细胞；

3、上清液中的纳米线用饱和度10％硫酸铵沉淀过夜，然后以13,000g离心；

4、将沉淀物重新悬浮在乙醇胺缓冲液中，并以23,000g的离心力去除其他碎片；

5、收集纳米线，再用饱和度10％硫酸铵沉淀，然后以13,000g离心，无法得到沉淀。

剪切时间适中(60-120s)：组织捣碎匀浆机JJ-2B中以最高速16000r/min剪切纳米线60s，或者使用涡旋振荡器剧烈振荡分离纳米线120s，纯化得到的纳米线如图6所示，具体步骤如下：

1、使用离心机将生长良好的Geobacter sulfurreducens菌液以13000g离心力离心，并收集细胞，使其充分悬浮于150mM乙醇胺缓冲液(pH＝10.5)中；

2、剪切纳米线(在组织捣碎匀浆机JJ-2B中以最高速16000r/min从细胞中剪切纳米线60s，或者使用涡旋振荡器剧烈振荡分离纳米线120s)，以13,000g离心去除细胞；

3、上清液中的纳米线用饱和度10％硫酸铵沉淀过夜，然后以13,000g离心；将沉淀物重新悬浮在乙醇胺缓冲液中，并以23,000g的离心力去除其他碎片；

4、收集纳米线，再用饱和度10％硫酸铵沉淀，然后以13,000g离心；

5、将最终纳米线重悬在乙醇胺缓冲液中，用去离子水进行透析后，保存在4℃下。

剪切时间长(90-180s)：组织捣碎匀浆机JJ-2B中以最高速16000r/min剪切纳米线90s，或者使用涡旋振荡器剧烈振荡分离纳米线180s，剪切时间过长则会导致纳米线被剪的过短，不利于其进一步纯化应用，如图7A所示，具体步骤如下：

1、使用离心机将生长良好的Geobacter sulfurreducens菌液以13000g离心力离心，并收集细胞，使其充分悬浮于150mM乙醇胺缓冲液(pH＝10.5)中；

2、剪切纳米线(在组织捣碎匀浆机JJ-2B中以最高速16000r/min从细胞中剪切纳米线90s，或者使用涡旋振荡器剧烈振荡分离纳米线180s)，以13,000g离心去除细胞；

3、上清液中的纳米线用饱和度10％硫酸铵沉淀过夜，然后以13,000g离心；

4、将沉淀物重新悬浮在乙醇胺缓冲液中，并以23,000g的离心力去除其他碎片；收集纳米线，再用饱和度10％硫酸铵沉淀，然后以13,000g离心；

5、将最终纳米线重悬在乙醇胺缓冲液中，用去离子水进行透析后，保存在4℃下。

最终优化时间：在组织捣碎匀浆机JJ-2B中以最高速剪切纳米线60s，或者使用涡旋振荡器剧烈振荡分离纳米线120s。

3.2纳米线重悬浮优化：

重悬浮未分散：如图7B所示，仅离心管上下颠倒晃动10次，微生物纳米线未完全分散，导致出现团聚现象，具体步骤如下：

1、使用离心机将生长良好的Geobacter sulfurreducens菌液以13000g离心力离心，并收集细胞，离心管上下颠倒晃动10次使其悬浮于150mM乙醇胺缓冲液(pH＝10.5)中；

2、剪切纳米线(在组织捣碎匀浆机JJ-2B中以最高速16000r/min从细胞中剪切纳米线60s)，以13,000g离心去除细胞；

3、上清液中的纳米线用饱和度10％硫酸铵沉淀过夜，然后以13,000g离心；将沉淀物上下颠倒晃动离心管10次重新悬浮在乙醇胺缓冲液中，并以23,000g的离心力去除其他碎片；

4、收集纳米线，再用饱和度10％硫酸铵沉淀，然后以13,000g离心；

5、将最终纳米线重悬在乙醇胺缓冲液中，用去离子水进行透析后，保存在4℃下。

重悬浮分散：如图6所示，使用涡旋振荡器剧烈震荡离心管10s，微生物纳米线完全分散，具体步骤如下：

1、使用离心机将生长良好的Geobacter sulfurreducens菌液以13000g离心力离心，并收集细胞，使用涡旋振荡器剧烈震荡离心管10s使其悬浮于150mM乙醇胺缓冲液(pH＝10.5)中；

2、剪切纳米线(在组织捣碎匀浆机JJ-2B中以最高速16000r/min从细胞中剪切纳米线60s)，以13,000g离心去除细胞；

3、上清液中的纳米线用饱和度10％硫酸铵沉淀过夜，然后以13,000g离心；

4、将沉淀物使用涡旋振荡器剧烈震荡离心管10s重新悬浮在乙醇胺缓冲液中，并以23,000g的离心力去除其他碎片；

5、收集纳米线，再用饱和度10％硫酸铵沉淀，然后以13,000g离心；

6、将最终纳米线使用涡旋振荡器剧烈震荡离心管10s重悬在乙醇胺缓冲液中，用去离子水进行透析后，保存在4℃下。

最终重悬浮优化方案：纳米线重悬浮时使用涡旋振荡器剧烈震荡10s，使纳米线充分分散。

提纯后微生物纳米线与原始纳米线对比：

如图2、4、5所示，通过不同方法成功诱导了微生物产生纳米线。

如图6所示，微生物纳米线经过剪切提纯后，尺寸、形貌结构保持良好，分散均匀，表明了成功纯化微生物纳米线。