一种用于检测pH和精氨酸的橙红色荧光碳点的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于荧光碳点技术领域，具体涉及一种用于检测pH和精氨酸的橙红色荧光碳点的制备方法及其应用。

背景技术

细胞内 pH 值与细胞增殖、凋亡、内吞作用、信号转导和酶活性等生物过程有显着关系。细胞内 pH 值的波动可能导致细胞功能异常并引发多种疾病（包括类风湿性关节炎、癌症和阿尔茨海默病）。因此，监测细胞、组织和生物体的pH值分布和波动在生理和病理研究中具有重要意义。因此，对细胞内pH实时监测是至关重要的，并引起了广泛的关注。

精氨酸作为生物系统的重要组成部分，参与体内鸟氨酸循环并促进尿素的形成。人体内产生的氨然后通过鸟氨酸循环转化为无毒的尿素，然后通过尿液排出体外，从而降低血液中的氨浓度。精氨酸在细胞分裂、创伤恢复和免疫系统或疾病的功能中起着重要作用。因此，它引起了研究人员的广泛关注。当人体缺乏精氨酸时，就会引发不同程度的健康问题。许多人类疾病与精氨酸的衍生分子有关，确定体液中精氨酸的存在对于诊断人类疾病很重要。

碳点由于优异的发光性能、良好的化学稳定性、生物相容性及表面功能可调节性等特点，在生物成像、环境监测及纳米材料等诸多领域具有良好的应用前景。目前合成的碳点大多发出蓝绿色荧光，这限制了其在生物医学和光电器件中的应用。因此，设计合成长波发射荧光碳点用以构建pH和精氨酸的生物传感平台具有极其重要的研究意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种长波发射荧光碳点用以构建pH和精氨酸的生物传感平台。

本发明采用如下技术方案：

一种用于检测pH和精氨酸的橙红色荧光碳点的制备方法，包括如下步骤：

第一步，按比例称取中性红和甲硫氨酸溶解在水中，超声得到均匀的混合溶液；

第二步，将第一步得到的混合溶液转移至水热反应釜中，在150-200℃下反应2-6h，待反应停止后，静置冷却至室温，离心去除不溶物，取上清液，通过500-1000 Da的透析袋，在玻璃容器中透析处理至少三天，即得到纯净的碳点水溶液；

第三步，将上述碳点水溶液冷冻干燥后，得到橙红色荧光发射的碳点。

进一步地，第一步中所述中性红、甲硫氨酸和水的质量比为3-8:8-13:20000。

所述橙红色荧光碳点用于pH和精氨酸的检测。

所述橙红色荧光碳点用于细胞内pH和精氨酸的检测。

所述橙红色荧光碳点用于斑马鱼内pH和精氨酸的检测。

本发明制备的橙红色荧光发射的碳点对pH和精氨酸具有专一性识别作用。原因如下：

CDs对 pH 的响应机制主要归因于CDs 表面特殊结构（吡咯N、氨基N和吡啶N）的质子化和去质子化。如图10所示，随着pH值的增加，CDs的zeta电位从9.08 mV降低到-17.6mV，这证明pH响应可归因于质子化和去质子化。 在实验开始时，由于吡啶的碱度大于吡咯的碱度，CDs 表面的吡啶N被质子化。随着pH值逐渐降低，吡咯N也被质子化。我们推测CDs对pH 的反应机制是CDs 表面的含氮基团与氢离子的结合。

如图11所示，加入精氨酸后，碳点的紫外可见吸收光谱发生了变化，在460 nm处出现新的吸收峰。且加入精氨酸前后碳点的荧光寿命没有变化。因此，我们推测该猝灭机制为静态猝灭。

本发明的有益效果如下：

1. 本发明操作步骤简单，不需经过表面钝化剂处理或修饰即可得到橙红色荧光发射的碳点。

2. 本发明所制得的碳点在水溶液中具有良好的溶解度和分散性。

3. 本发明制备得到的橙红色荧光发射的碳点对pH和精氨酸具有专一性识别作用，用于pH和精氨酸的检测，选择性好，灵敏度高。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的橙红色荧光碳点的红外光谱图。

图2为本发明实施例1制备的橙红色荧光碳点的紫外吸收光谱及荧光激发-发射光谱。

图3为实施例1制备的碳量子点荧光发射曲线随激发波长变化的光谱图。

图4为不同pH存在时碳点的3D荧光变化图。

图5为不同浓度精氨酸存在时碳点的3D荧光变化图。

图6为本发明实施例1制备的橙红色荧光碳点在不同pH时的激光共聚焦图，所述的细胞为Hela细胞。

图7为本发明实施例1制备的橙红色荧光碳点被精氨酸猝灭的激光共聚焦图，所述的细胞为Hela细胞。

图8为本发明实施例1制备的橙红色荧光碳点在不同pH时的激光共聚焦图，所述的鱼为斑马鱼。

图9为本发明实施例1制备的橙红色荧光碳点被精氨酸猝灭的激光共聚焦图，所述的鱼为斑马鱼。

图10为本发明CDs的zeta电位随着pH的变化图。

图11为本发明碳点加入精氨酸前后紫外可见吸收光谱变化图。

具体实施方式

下面结合附图以及具体实施例对本发明做出进一步说明，实施例给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

一种检测pH和精氨酸的橙红色荧光碳点的制备方法，包括如下步骤：

1) 称取一定质量的中性红和甲硫氨酸溶解在水中，超声得到均匀混合溶液；所述中性红、甲硫氨酸和水的质量比为5.9:11.8:20000；

2) 将上述混合溶液转移至水热反应釜中，在180℃下反应4 h，待反应停止后 静置冷却至室温，离心去除不溶物取上清液，通过500-1000 Da的透析袋，在玻璃容器中透析处理至少三天，即得到纯净的碳点水溶液；

3) 将上述碳点水溶液冷冻干燥后得到橙红色荧光发射的碳点。以罗丹明B为参照物，其相对量子产率为6.5%。

实施例2

一种检测pH和精氨酸的橙红色荧光碳点的制备方法，包括如下步骤：

1) 称取一定质量的中性红和甲硫氨酸溶解在水中，超声得到均匀混合溶液；所述中性红、甲硫氨酸和水的质量比为3:9:20000；

2) 将上述混合溶液转移至水热反应釜中，在160℃下反应6 h，待反应停止后 静置冷却至室温，离心去除不溶物取上清液，通过500-1000 Da的透析袋，在玻璃容器中透析处理至少三天，即得到纯净的碳点水溶液；

3) 将上述碳点水溶液冷冻干燥后得到橙红色荧光发射的碳点。以罗丹明B为参照物，其相对量子产率为3.2%。

实施例3

一种检测pH和精氨酸的橙红色荧光碳点的制备方法，包括如下步骤：

1) 称取一定质量的中性红和甲硫氨酸溶解在水中，超声得到均匀混合溶液；所述中性红、甲硫氨酸和水的质量比为7:12:20000；

2) 将上述混合溶液转移至水热反应釜中，在200℃下反应3 h，待反应停止后 静置冷却至室温，离心去除不溶物取上清液，通过500-1000 Da的透析袋，在玻璃容器中透析处理至少三天，即得到纯净的碳点水溶液；

3) 将上述碳点水溶液冷冻干燥后得到橙红色荧光发射的碳点。以罗丹明B为参照物，其相对量子产率为4.8%。

实施例4

本发明实施例1制备的橙红色荧光碳点表征如图1所示。红外光谱图证明该具有苯环结构且S元素成功掺杂进碳点。

实施例5

本发明实施例1制备的橙红色荧光碳点的光学性质谱图如图2、3所示。该碳点的UV-Vis吸收谱线在275 nm和534 nm左右存在三个吸收峰。在529nm的激发下出现626 nm的发射波长，呈橙红色荧光。图3是在不同激发波长下该碳点的发射光谱图，表明碳点具有激发波长依赖性。

实施例6

本发明实施例1制备的橙红色荧光碳点对pH的传感如图4所示，其线性范围为4.8-8.0。

实施例7

本发明实施例1制备的橙红色荧光碳点对精氨酸的传感如图5所示，其线性范围为2.5-62.5μM，检出限为0.68 μM。

实施例8

实施例1制备的荧光碳点水溶液用于标记的人宫颈癌细胞Hela，如图6所示，细胞形态良好，可见碳点没有细胞毒性，可用于活细胞标记。图6为实施例1制备的碳点在不同pH的PBS缓冲液中的激光共聚焦图，从左到右依次为：明场细胞图，暗场细胞图(橙色)，明场和暗场叠加图。

图7 为实施例1制备的橙红色荧光碳点被精氨酸猝灭的细胞成像图，加入精氨酸后，碳点的荧光被猝灭。说明该橙红色荧光碳点可以用于构建细胞内pH和精氨酸的荧光传感平台。

实施例9

本发明实施例1制备的橙红色荧光碳点的斑马鱼成像图如图8所示。使用斑马鱼在橙红色荧光碳点水溶液(pH＝4，7，10)中孵育2小时，碳点充分分散到斑马鱼体内，从左到右依次为：明场细胞图，暗场细胞图(橙色)，明场和暗场叠加图。

图9 为实施例1制备的橙红色荧光碳点被精氨酸猝灭的斑马鱼成像图，加入精氨酸后，碳点的荧光被猝灭。说明该橙红色荧光碳点可以用于构建生物体内pH和精氨酸的荧光传感平台。