CD73基因人源化的非人动物的构建方法及应用
文献发布时间:2023-06-19 13:48:08
技术领域
本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域,具体地说,涉及一种CD73基因人源化的非人动物及其构建方法和在生物医药领域的应用。
背景技术
免疫疗法通过激活免疫系统攻击并杀死癌细胞,是近年来肿瘤研究的一个重要领域。目前和肿瘤免疫治疗相关的一些药物已经用于治疗癌症,已有药品上市并应用在多个适应症,如靶向T细胞共刺激分子CTLA-4、PD-1及其配体的单克隆抗体已经取得确切疗效,但病人的平均应答率较低。考虑到肿瘤的发生是多环节多因素的共同作用结果,单一的免疫治疗策略治疗效果有限,并且大量患者会对治疗产生耐药性,在临床中结合两种或多种免疫治疗手段进行是肿瘤治疗的一个趋势。开发更多可以用于提高免疫系统对肿瘤识别及杀伤能力的药物一直是免疫学研究的热点之一。
CD73是由NT5E基因(又名CD73基因)编码的胞外-5'-核苷酸酶,蛋白分子量70KD,广泛表达于人体内皮细胞、淋巴细胞,如Tregs(抑制性T细胞)等细胞表面,由葡糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定在细胞表面形成同源二聚体,但也可被切割并游离于循环系统。CD73上游的CD37将具有免疫激活作用的ATP转化腺苷单磷酸(AMP),所产生的AMP被CD73转化为腺苷,腺苷会结合下游的腺苷受体,继而通过腺苷信号抑制免疫反应,抑制LCK、MAPK、PKC等一系列与免疫激活相关的信号通路,从而发挥免疫抑制作用,是人体的一种自我保护机制。
肿瘤微环境(Tumor micro-environment,TME)由多种细胞、胞间质、酶、细胞因子、代谢产物等构成,有显著的低氧、低pH以及高压的特点,与正常组织差异巨大。CD73是一种典型的缺氧诱导因子(HIF)靶基因,肿瘤低氧环境诱导HIF-1上调,进而导致CD73在肿瘤微环境中表达显著增加,进一步催化产生腺苷,从而抑制免疫系统,促进肿瘤的发生和发展。研究发现CD73在多种肿瘤中表达升高,CD73高表达的非小细胞肺癌患者预后不良,表明肿瘤细胞可能利用了CD73机制发生免疫逃逸。临床前研究表明,靶向CD73能够产生良好的抗肿瘤作用(Stagg J,et al.Anti-CD73 antibody therapy inhibits breast tumorgrowth and metastasis.Proc Natl Acad Sci U S A(2010)107:1547–52.)。另外,PD-1/PD-L1单抗、放化疗等治疗方案可能引起肿瘤微环境CD73表达升高,继而通过腺苷信号抑制免疫反应(即,出现获得性耐药),将CD73阻断治疗与其它免疫分子调节剂联合(如CTLA-4抗体、PD-1抗体)有助于获得更好的疗效,是一种极具吸引力的选择(Beavis PA,etal.Oncoimmunology.2015;4(11):e1046675.)。
由于靶点机理明确,且临床前研究结果显著,目前全球已有十多家企业在开发CD73抗体药物,已有多个项目已进入临床早期阶段,如BMS的CD73抑制型单抗BMS-986179处于I期临床研究,适应症是晚期实体瘤;AZ/MedImmune公司开发的CD73抑制型单抗oleclumab在复发性卵巢癌上已进入II期临床研究。此外,还有一些针对该靶点的小分子化合物,如谷歌2017年11月斥资1.07亿美元领投的一家名为Arcus Biosciences的生物技术创新公司,这家公司主打产品之一就是靶向CD73的小分子药物AB680,目前已完成前期临床研究、等待临床审批。考虑到目前尚未有针对该靶点的药物上市,现有药物远不能满足临床需求,预计随着研究的深入,未来会有更多的公司投入到该靶点的药物研发中。
实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。目前已有的与CD73相关的动物模型主要是基因敲除小鼠,主要是用于CD73、腺苷生物学功能(基因型、功能、调控)及相关疾病机制研究。例如,HayoCastrop等人(2004)为了研究确定腺苷的形成是否依赖于细胞外核苷酸水解,通过破坏CD73基因的2号和3号外显子制备了CD73缺失小鼠,与野生型小鼠相比,该小鼠在行为和生育方面正常,但在Henle灌注时肾小球小动脉收缩能力显著降低,得出结论认为在肾小球上产生腺苷很大程度上取决于CD73介导的AMP的去磷酸化;Patrycja Koszalka等人(2004)为了研究细胞外在血管稳态中形成的腺苷的作用,制备了缺失2号外显子的CD73敲除小鼠,证实了CD73细胞外形成的腺苷可以调节冠状血管张力,抑制血小板活化。Linda F.Thompson等人(2004年)为了研究CD73在基础条件或缺氧期间是否可功能性的调节血管渗透,制备了CD73基因3号外显子缺失的小鼠,确认了CD73是体内心血管渗透的关键调节因子。(HayoCastrop,et al.J Clin Invest.2004Sep;114(5):634-42.;Koszalka P,etal.Circulation Research.2004;95:814–821;Cornelia Blume,et al.PLoS One.2012;7(5):e37100.)(Thompson LF,et al.JExp Med 2004:1395–1405)尽管后续还有人利用这些小鼠进行了更多研究,例如Cornelia Blume等人(2012年)发现Patrycja Koszalka等人制备的CD73缺失小鼠肾功能降低,且不经诱导即会出现自身免疫性炎症。综上可见,现有模型主要是用于CD73、腺苷生物学功能(基因型、功能、调控)及相关疾病机制研究。
CD73通过形成同源二聚体发挥作用,每个单体包含N-末端结构域和C-末端结构域的结合位点,两个功能域通过短螺旋连接,两个单体通过非共价键连接并通过C-末端丝氨酸残基与GPI连接后锚定在质膜上。在成熟形式中,N-末端结构域中的26个氨基酸的信号肽协调催化二价锌、钴等金属离子,而C-末端结构域主要是AMP的结合位点。在CD73靶点相关药物研发过程中,由于人和鼠存在种属差异,抗体与靶点蛋白结合时的精确度有时达到蛋白中的单一氨基酸的变化(Joseph Conlon J,et al.Immunol.2013May 15;190(10):5216–5225),因此,无法用普通小鼠来筛选和评价靶向人源CD73药物的药效。目前研究抗体药物药效广泛使用的体内模型是人源肿瘤异体移植小鼠模型,但该类模型在特定靶点研究中的靶向性和特异性不强,因此这类模型研究药效的结果准确性不高。
基因人源化动物模型,即,利用基因编辑技术,用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因,可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值,如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型,更重要的是,由于人类基因片段的插入,动物体内可表达或部分表达人源蛋白,可作为仅能识别人蛋白氨基酸序列的药物的靶点,为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。然而,由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异,加上基因(即遗传因子)的复杂性,如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战(Scheer N,Snaith M,Wolf CR,Seibler J.Generation and utility ofgenetically humanized mouse models,Drug Discov Today;18(23-24):1200-11,2013)。
发明内容
本发明的第一方面,提供了一种CD73基因人源化的非人动物的构建方法,所述的非人动物体内表达人或人源化CD73蛋白。
优选的,所述的非人动物的内源CD73蛋白表达降低或缺失。
优选的,所述的人源化CD73蛋白包含人CD73蛋白的全部或部分。进一步优选包含人CD73基因的1号至9号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的人源化CD73蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种:
a)SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的全部或部分;
b)与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列同一性至少为60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%;
c)与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸;或,
d)与SEQ ID NO:4所示的,包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的,所述的非人动物基因组包含人或人源化CD73基因。
优选的,所述的非人动物基因组包含人CD73基因的1号至9号外显子的全部或部分。进一步优选的,包含人CD73基因的1号至9号外显子中的一种或两种以上外显子的组合。
在本发明的一个具体实施方式中,包含人CD73基因的1号外显子、2号外显子、3号外显子、4号外显子、5号外显子、6号外显子、7号外显子、8号外显子和9号外显子。
优选的,包含1号外显子的全部或部分、2号至8号外显子的全部和9号外显子的全部或部分,优选还包含1-2号内含子和/或8-9号内含子,其中,1号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列,例如至少包含100、150、200、250、300、310、330、335、336、337、338、339、340、350、370、390、396bp的核苷酸序列,进一步优选的,包含339或396bp的核苷酸序列;1号外显子的部分包含从1号外显子的起始密码子至1号外显子的最后一个核苷酸,9号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列,例如至少包含50、100、150、160、161、162、163、164、165、170、190、200、500、700、900、1000、1500、1700、1900、1944bp的核苷酸序列,进一步优选的,包含164或1944bp的核苷酸序列;9号外显子的部分包含从9号外显子的第一个核苷酸至终止密码子。
在本发明的一个具体实施方式中,包含人CD73基因的CDS序列的全部或部分或人CD73的全长核苷酸序列的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的非人动物包含SEQ ID NO:9或17。
优选的,所述的非人动物包含编码人CD73蛋白的全部或部分核苷酸序列。进一步优选包含编码SEQ ID NO:4的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的人源化CD73基因包含下列组中的一种:
A)SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17所示核苷酸序列的全部或部分;
B)与SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17所示核苷酸序列同一性至少为60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%;
C)与SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸;或,
D)与SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17所示的,包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸残基的核苷酸序列。
优选的,所述的人源化CD73基因还包含编码2A肽的核苷酸序列,优选为编码P2A或T2A的核苷酸序列。进一步优选包含SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。
优选的,所述的人源化CD73基因还包含编码SEQ ID NO:11的核苷酸序列。
优选的,所述的人源化CD73基因还包含转录终止序列。进一步优选为3’UTR、polyA、WPRE、STOP或lox2中的一种或两种以上的组合。更进一步优选包含STOP序列如SEQID NO:20所示和/或3’UTR序列如SEQ ID NO:22所示核苷酸序列。
优选的,所述的人源化CD73基因还包含Neo盒。
优选的,所述的人源化CD73基因还包括内源调控序列。更优选包括内源启动子核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的人源化CD73基因按照从5’至3’的顺序,包含下列组中的一种:
A)编码SEQ ID NO:11的核苷酸序列、编码2A肽的核苷酸序列、人CD73基因的CDS序列和转录终止序列;
B)编码SEQ ID NO:11的核苷酸序列、编码2A肽的核苷酸序列、人CD73基因的CDS序列、转录终止序列和Neo盒;
C)人CD73基因的CDS序列和/或人CD73的全长核苷酸序列的部分和转录终止序列;
D)人CD73基因的CDS序列和/或人CD73的全长核苷酸序列的部分、转录终止序列和Neo盒;
E)内源调控序列、编码SEQ ID NO:11的核苷酸序列、编码2A肽的核苷酸序列、人CD73基因的CDS序列和转录终止序列;
F)内源调控序列、编码SEQ ID NO:11的核苷酸序列、编码2A肽的核苷酸序列、人CD73基因的CDS序列、转录终止序列和Neo盒;
G)内源调控序列、人CD73基因的CDS序列和/或人CD73的全长核苷酸序列的部分和转录终止序列;
H)内源调控序列、人CD73基因的CDS序列和/或人CD73的全长核苷酸序列的部分、转录终止序列和Neo盒;或,
I)编码2A肽的核苷酸序列和人CD73的全长核苷酸序列的部分。
优选的,所述的人源化CD73基因包含SEQ ID NO:23。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的人源化CD73基因包含下列组中的一种:
(i)包含SEQ ID NO:12、13或18所示核苷酸序列的全部或部分;
(ii)包含与SEQ ID NO:12、13或18所示核苷酸序列的同一性至少为60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%;
(iii)包含与SEQ ID NO:12、13或18所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸;或,
(iv)包含与SEQ ID NO:12、13或18所示的核苷酸序列所示的,包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的人源化CD73基因转录的mRNA包含下列组中的一种:
(i)包含SEQ ID NO:19所示核苷酸序列的全部或部分;
(ii)包含与SEQ ID NO:19所示核苷酸序列的同一性至少为60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%;
(iii)包含与SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸;或,
(iv)包含与SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列所示的,包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的,所述的非人动物基因组中还包含其他基因修饰,进一步优选的,所述的其他基因包含PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、BTLA、CD27、CD28、CD47、CD137、CD154、OX40、SIRPα、TIGIT、TIM-3、CD40和GITR基因中的至少一种。
优选的,所述的构建方法包括用包含人或人源化CD73基因的核苷酸序列导入非人动物CD73基因座。进一步优选用包含人CD73基因的1号至9号外显子的全部或部分导入非人动物CD73基因座。
在本发明的一个具体实施方式中,用包含人CD73基因的1号外显子、2号外显子、3号外显子、4号外显子、5号外显子、6号外显子、7号外显子、8号外显子和9号外显子导入至非人动物CD73基因座。
优选用包含1号外显子的全部或部分、2号至8号外显子的全部和9号外显子的全部或部分,优选还包含1-2号内含子和/或8-9号内含子,导入非人动物CD73基因座,其中,1号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列,例如至少包含100、150、200、250、300、310、330、335、336、337、338、339、340、350、370、390、396bp的核苷酸序列,进一步优选的,包含339或396bp的核苷酸序列;1号外显子的部分包含从1号外显子的起始密码子至1号外显子的最后一个核苷酸,9号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列,例如至少包含50、100、150、160、161、162、163、164、165、170、190、200、500、700、900、1000、1500、1700、1900、1944bp的核苷酸序列,进一步优选的,包含164或1944bp的核苷酸序列;9号外显子的部分包含从9号外显子的第一个核苷酸至终止密码子。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的构建方法包括用包含人CD73基因的CDS序列的全部或部分或人CD73的全长核苷酸序列的全部或部分导入非人动物CD73基因座。
优选的,所述的构建方法包括用包含人CD73基因的cDNA序列导入非人动物CD73基因座。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的构建方法包括用包含SEQ ID NO:9、12、13、17或18的核苷酸序列导入非人动物CD73基因座。
优选的,所述的构建方法包括用包含编码人CD73蛋白的全部或部分核苷酸序列导入非人动物CD73基因座。进一步优选用包含编码SEQ ID NO:4的核苷酸序列导入非人动物CD73基因座。
优选的,人或人源化CD73基因的核苷酸序列可操作的连接至非人动物内源调控元件。进一步优选连接至非人动物启动子。
优选的,所述的导入的位置位于CD73基因的内源调控元件之后。优选的,所述的内源调控元件为内源启动子。
优选的,导入的位置位于非人动物CD73基因的1号至9号外显子上。进一步优选位于CD73基因的起始密码子至终止密码子上或者非人动物CD73基因的的全长核苷酸序列。
优选的,导入的位置位于非人动物CD73基因的2号至9号外显子上。进一步优选位于2号外显子和/或2-3号内含子上。
优选的,本申请中所述的导入包括但不限于插入、替换或转基因。
优选的,所述的非人动物是纯合或者杂合的。
优选的,所述非人动物的基因组中至少一个染色体上包含人源化CD73基因。
优选的,所述的非人动物中至少一个细胞表达人或人源化CD73蛋白。
优选的,使用基因编辑技术进行非人动物的构建,所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、规律成簇间隔短回文重复(CRISPR/Cas9)技术、锌指核酸酶(ZFN)技术、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)技术、归巢核酸内切酶(兆碱基大范围核酶)或其他分子生物学技术。
优选的,使用靶向载体进行非人动物的构建,其中,所述的靶向载体包含人CD73基因的部分。进一步优选包含人CD73基因的1号至9号外显子的全部或部分。更进一步优选包含人CD73基因的1号至9号外显子中的一种或两种以上外显子的组合。
在本发明的一个具体实施方式中,包含人CD73基因的1号外显子、2号外显子、3号外显子、4号外显子、5号外显子、6号外显子、7号外显子、8号外显子和9号外显子。
优选包含1号外显子的全部或部分、2号至8号外显子的全部和9号外显子的全部或部分,更优选还包含1-2号内含子和/或8-9号内含子,其中,1号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列,例如至少包含100、150、200、250、300、310、330、335、336、337、338、339、340、350、370、390、396bp的核苷酸序列,进一步优选的,包含339或396bp的核苷酸序列;1号外显子的部分包含从1号外显子的起始密码子至1号外显子的最后一个核苷酸,9号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列,例如至少包含50、100、150、160、161、162、163、164、165、170、190、200、500、700、900、1000、1500、1700、1900、1944bp的核苷酸序列,进一步优选的,包含164或1944bp的核苷酸序列;9号外显子的部分包含从9号外显子的第一个核苷酸至终止密码子。
在本发明的一个具体实施方式中,包含人CD73基因的CDS序列的全部或部分或人CD73的全长核苷酸序列的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中,包含编码SEQ ID NO:4的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中,包含SEQ ID NO:9、12、13、17或18。
优选的,所述的靶向载体还包含5’臂(5’同源臂)和/或3’臂(3’同源臂)。所述5’臂选自非人动物CD73基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。优选的,所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000075.6至少具有90%同源性的核苷酸。进一步优选的,所述5’臂序列与SEQ ID NO:5、7或15至少具有90%同源性。所述3’臂选自非人动物CD73基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。优选的,所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000075.6至少具有90%同源性的核苷酸。进一步优选的,所述3’臂序列与SEQ ID NO:6、8或16至少具有90%同源性。
优选的,所述5’臂为与待改变的转换区5’端同源的DNA片段。
优选的,所述3’臂为与待改变的转换区3’端同源的DNA片段。
优选的,所述的待改变的转换区位于非人动物CD73基因的1号至9号外显子上。
在本发明的一个具体实施方式中,位于非人动物CD73基因的2号外显子和/或2-3号内含子上。
在本发明的一个具体实施方式中,位于非人动物CD73基因的起始密码子至终止密码子上。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的构建方法包括将上述靶向载体导入非人动物细胞中,培养该细胞(优选为胚胎干细胞),然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内,允许其发育,鉴定筛选获得CD73基因人源化的非人动物。
优选的,为提高重组效率,还可以使用靶向CD73基因的sgRNA与上述靶向载体一起进行非人动物的构建。其中,所述的sgRNA靶向非人动物CD73基因,同时所述sgRNA的序列在待改变的CD73基因上的靶序列上。
优选的,所述sgRNA的靶位点位于CD73基因的1号外显子至9号外显子序列上。进一步优选的,所述sgRNA的靶位点位于CD73基因的2号外显子、2-3号内含子和/或3号外显子序列上。
在本发明的一个具体实施方式中,所述sgRNA的靶位点位于CD73基因的2号外显子和2-3号内含子上。
优选的,所述的sgRNA的靶位点序列如SEQ ID NO:26-41任一项所示。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的构建方法包括将上述靶向载体、靶向CD73基因的sgRNA及Cas9导入非人动物细胞中,培养该细胞(优选为胚胎干细胞),然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内,允许其发育,鉴定筛选获得CD73基因人源化的非人动物。
优选的,所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的,所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的,所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的,所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的,所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的,所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的,所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的,所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdc
本发明的第二方面,提供了一种CD73基因人源化的非人动物,所述的非人动物基因组包含人或人源化CD73基因。
优选的,所述的非人动物基因组包含人CD73基因的1号至9号外显子的全部或部分。进一步优选的,包含人CD73基因的1号至9号外显子中的一种或两种以上外显子的组合。
在本发明的一个具体实施方式中,包含人CD73基因的1号外显子、2号外显子、3号外显子、4号外显子、5号外显子、6号外显子、7号外显子、8号外显子和9号外显子。
优选的,包含1号外显子的全部或部分、2号至8号外显子的全部和9号外显子的全部或部分,优选还包含1-2号内含子和/或8-9号内含子,其中,1号外显子的部分包含从1号外显子的起始密码子至1号外显子的最后一个核苷酸,9号外显子的部分包含从9号外显子的第一个核苷酸至终止密码子。
在本发明的一个具体实施方式中,包含人CD73基因的CDS序列的全部或部分或人CD73的全长核苷酸序列的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的非人动物包含SEQ ID NO:9或17。
优选的,所述的非人动物包含编码人CD73蛋白的全部或部分核苷酸序列。进一步优选包含编码SEQ ID NO:4的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的人源化CD73基因包含下列组中的一种:
A)SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17所示核苷酸序列的全部或部分;
B)与SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17所示核苷酸序列同一性至少为60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%;
C)与SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸;或,
D)与SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17所示的,包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸残基的核苷酸序列。
优选的,所述的人源化CD73基因还包含2A肽,优选为P2A或T2A。进一步优选包含SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。
优选的,所述的人源化CD73基因还包含编码SEQ ID NO:11的核苷酸序列。
优选的,所述的人源化CD73基因还包含转录终止序列。进一步优选为3’UTR、polyA、WPRE或lox2中的一种或两种以上的组合。更进一步优选包含SEQ ID NO:20和/或SEQID NO:22所示核苷酸序列。
优选的,所述的人源化CD73基因还包含Neo盒。
优选的,所述的人源化CD73基因还包括内源调控序列。更优选包括内源启动子核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的人源化CD73基因按照从5’至3’的顺序,包含下列组中的一种:
A)编码SEQ ID NO:11的核苷酸序列、编码2A肽的核苷酸序列、人CD73基因的CDS序列和转录终止序列;
B)编码SEQ ID NO:11的核苷酸序列、编码2A肽的核苷酸序列、人CD73基因的CDS序列、转录终止序列和Neo盒;
C)人CD73基因的CDS序列和/或人CD73的全长核苷酸序列的部分和转录终止序列;
D)人CD73基因的CDS序列和/或人CD73的全长核苷酸序列的部分、转录终止序列和Neo盒;
E)内源调控序列、编码SEQ ID NO:11的核苷酸序列、编码2A肽的核苷酸序列、人CD73基因的CDS序列和转录终止序列;
F)内源调控序列、编码SEQ ID NO:11的核苷酸序列、编码2A肽的核苷酸序列、人CD73基因的CDS序列、转录终止序列和Neo盒;
G)内源调控序列、人CD73基因的CDS序列和/或人CD73的全长核苷酸序列的部分和转录终止序列;
H)内源调控序列、人CD73基因的CDS序列和/或人CD73的全长核苷酸序列的部分、转录终止序列和Neo盒;或,
I)编码2A肽的核苷酸序列和人CD73的全长核苷酸序列的部分。
优选的,所述的人源化CD73基因包含SEQ ID NO:23。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的人源化CD73基因包含下列组中的一种:
(i)包含SEQ ID NO:12、13或18所示核苷酸序列的全部或部分;
(ii)包含与SEQ ID NO:12、13或18所示核苷酸序列的同一性至少为60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%;
(iii)包含与SEQ ID NO:12、13或18所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸;或,
(iv)包含与SEQ ID NO:12、13或18所示的核苷酸序列所示的,包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的人源化CD73基因转录的mRNA包含下列组中的一种:
(i)包含SEQ ID NO:19所示核苷酸序列的全部或部分;
(ii)包含与SEQ ID NO:19所示核苷酸序列的同一性至少为60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%;
(iii)包含与SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸;或,
(iv)包含与SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列所示的,包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的,所述的非人动物体内表达人或人源化CD73蛋白。
优选的,所述的非人动物的内源CD73蛋白表达降低或缺失。
优选的,所述的人源化CD73蛋白包含人CD73蛋白的全部或部分。进一步优选包含人CD73基因的1号至9号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的人源化CD73蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种:
a)SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的全部或部分;
b)与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列同一性至少为60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%;
c)与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸;或,
d)与SEQ ID NO:4所示的,包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的,所述的非人动物基因组中还包含其他基因修饰,进一步优选的,所述的其他基因包含PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、BTLA、CD27、CD28、CD47、CD137、CD154、OX40、SIRPα、TIGIT、TIM-3、CD40和GITR基因中的至少一种。
优选的,所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的,所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的,所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的,所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的,所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的,所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的,所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的,所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdc
本发明第三方面,提供了一种靶向载体,所述的靶向载体包含人CD73基因的部分。
优选的,所述的靶向载体包含人CD73基因的1号至9号外显子的全部或部分。进一步优选包含人CD73基因的1号至9号外显子中的一种或两种以上外显子的组合。
在本发明的一个具体实施方式中,包含人CD73基因的1号外显子、2号外显子、3号外显子、4号外显子、5号外显子、6号外显子、7号外显子、8号外显子和9号外显子。
优选包含1号外显子的全部或部分、2号至8号外显子的全部和9号外显子的全部或部分,更优选还包含1-2号内含子和/或8-9号内含子,其中,1号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列,例如至少包含100、150、200、250、300、310、330、335、336、337、338、339、340、350、370、390、396bp的核苷酸序列,进一步优选的,包含339或396bp的核苷酸序列;1号外显子的部分包含从1号外显子的起始密码子至1号外显子的最后一个核苷酸,9号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列,例如至少包含50、100、150、160、161、162、163、164、165、170、190、200、500、700、900、1000、1500、1700、1900、1944bp的核苷酸序列,进一步优选的,包含164或1944bp的核苷酸序列;9号外显子的部分包含从9号外显子的第一个核苷酸至终止密码子。
在本发明的一个具体实施方式中,包含人CD73基因的CDS序列的全部或部分或人CD73的全长核苷酸序列的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中,包含编码SEQ ID NO:4的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中,包含SEQ ID NO:9、12、13、17或18。
优选的,所述的靶向载体还包含5’臂(5’同源臂)和/或3’臂(3’同源臂)。所述5’臂选自非人动物CD73基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。优选的,所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000075.6至少具有90%同源性的核苷酸。进一步优选的,所述5’臂序列与SEQ ID NO:5、7或15至少具有90%同源性。所述3’臂选自非人动物CD73基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。优选的,所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000075.6至少具有90%同源性的核苷酸。进一步优选的,所述3’臂序列与SEQ ID NO:6、8或16至少具有90%同源性。
优选的,所述的靶向载体还包含标记基因。进一步优选的,所述标记基因为负筛选标记的编码基因。更进一步优选的,所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的,所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的靶向载体中还包括特异性重组系统。进一步优选的,所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统为具有两个Frt重组位点,分别连接在抗性基因的两侧。
优选的,所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
优选的,所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的,所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的,所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的,所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的,所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的,所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的,所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdc
本发明的第四方面,提供了一种sgRNA,所述的sgRNA靶向非人动物CD73基因,同时所述sgRNA的序列在待改变的CD73基因上的靶序列上。
优选的,所述sgRNA的靶位点位于CD73基因的1号外显子至9号外显子序列上。进一步优选的,所述sgRNA的靶位点位于CD73基因的2号外显子、2-3号内含子和/或3号外显子序列上。
在本发明的一个具体实施方式中,所述sgRNA的靶位点位于CD73基因的2号外显子和2-3号内含子上。
优选的,所述的sgRNA的靶位点序列如SEQ ID NO:26-41任一项所示。
本发明的第五方面,提供了一种编码上述sgRNA的DNA分子。优选的,所述的DNA分子双链分别为上述sgRNA的上下游序列,或者加入酶切位点后的正反向寡核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的DNA分子双链分别为SEQ ID NO:32和SEQID NO:42。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的DNA分子双链分别为SEQ ID NO:39和SEQID NO:45。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的DNA分子双链分别为SEQ ID NO:43和SEQID NO:44。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的DNA分子双链分别为SEQ ID NO:46和SEQID NO:47。
本发明的第六方面,提供了一种sgRNA载体,所述的sgRNA载体包含上述sgRNA。
本发明的第七方面,提供了一种包含上述靶向载体、上述sgRNA、上述DNA分子或上述sgRNA载体的细胞。
本发明的第八方面,提供了一种上述靶向载体、上述sgRNA、上述DNA分子、上述sgRNA载体或上述的细胞在CD73基因修饰中的应用。优选包含在敲除、插入或替换CD73基因中的应用。
本发明的第九方面,提供了一种人源化CD73基因,所述的人源化CD73基因包含人CD73基因的部分。
优选的,所述的人源化CD73基因包含人CD73基因的1号至9号外显子的全部或部分。进一步优选的,包含人CD73基因的1号至9号外显子中的一种或两种以上外显子的组合。
在本发明的一个具体实施方式中,包含人CD73基因的1号外显子、2号外显子、3号外显子、4号外显子、5号外显子、6号外显子、7号外显子、8号外显子和9号外显子。
优选的,包含1号外显子的全部或部分、2号至8号外显子的全部和9号外显子的全部或部分,更优选还包含1-2号内含子和/或8-9号内含子,其中,1号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列,例如至少包含100、150、200、250、300、310、330、335、336、337、338、339、340、350、370、390、396bp的核苷酸序列,进一步优选的,包含339或396bp的核苷酸序列;1号外显子的部分包含从1号外显子的起始密码子至1号外显子的最后一个核苷酸,9号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列,例如至少包含50、100、150、160、161、162、163、164、165、170、190、200、500、700、900、1000、1500、1700、1900、1944bp的核苷酸序列,进一步优选的,包含164或1944bp的核苷酸序列;9号外显子的部分包含从9号外显子的第一个核苷酸至终止密码子。
在本发明的一个具体实施方式中,包含人CD73基因的CDS序列的全部或部分或人CD73的全长核苷酸序列的全部或部分。
优选的,所述的人源化CD73基因包含编码人CD73蛋白的全部或部分核苷酸序列。进一步优选包含编码SEQ ID NO:4的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的人源化CD73基因包含下列组中的一种:
A)SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17所示核苷酸序列的全部或部分;
B)与SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17所示核苷酸序列同一性至少为60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%;
C)与SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸;或,
D)与SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17所示的,包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸残基的核苷酸序列。
优选的,所述的人源化CD73基因还包含编码2A肽的核苷酸序列,优选为编码P2A或T2A的核苷酸序列。进一步优选包含SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。
优选的,所述的人源化CD73基因还包含编码SEQ ID NO:11的核苷酸序列。
优选的,所述的人源化CD73基因还包含转录终止序列,优选为3’UTR、polyA、WPRE、STOP或lox2中的一种或两种以上的组合。进一步优选包含STOP序列如SEQ ID NO:20和/或3’UTR序列如SEQ ID NO:22所示核苷酸序列。
优选的,所述的人源化CD73基因还包含Neo盒。
优选的,所述的人源化CD73基因还包括内源调控序列。进一步优选包括内源启动子核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的人源化CD73基因按照从5’至3’的顺序,包含下列组中的一种:
A)编码SEQ ID NO:11的核苷酸序列、编码2A肽的核苷酸序列、人CD73基因的CDS序列和转录终止序列;
B)编码SEQ ID NO:11的核苷酸序列、编码2A肽的核苷酸序列、人CD73基因的CDS序列、转录终止序列和Neo盒;
C)人CD73基因的CDS序列和/或人CD73的全长核苷酸序列的部分和转录终止序列;
D)人CD73基因的CDS序列和/或人CD73的全长核苷酸序列的部分、转录终止序列和Neo盒;
E)内源调控序列、编码SEQ ID NO:11的核苷酸序列、2A肽、人CD73基因的CDS序列和转录终止序列;
F)内源调控序列、编码SEQ ID NO:11的核苷酸序列、2A肽、人CD73基因的CDS序列、转录终止序列和Neo盒;
G)内源调控序列、人CD73基因的CDS序列和/或人CD73的全长核苷酸序列的部分和转录终止序列;
H)内源调控序列、人CD73基因的CDS序列和/或人CD73的全长核苷酸序列的部分、转录终止序列和Neo盒;或,
I)编码2A肽的核苷酸序列和人CD73的全长核苷酸序列的部分。
优选的,所述的人源化CD73基因包含SEQ ID NO:23。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的人源化CD73基因包含下列组中的一种:
(i)包含SEQ ID NO:12、13或18所示核苷酸序列的全部或部分;
(ii)包含与SEQ ID NO:12、13或18所示核苷酸序列的同一性至少为60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%;
(iii)包含与SEQ ID NO:12、13或18所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸;或,
(iv)包含与SEQ ID NO:12、13或18所示的核苷酸序列所示的,包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的人源化CD73基因转录的mRNA包含下列组中的一种:
(i)包含SEQ ID NO:19所示核苷酸序列的全部或部分;
(ii)包含与SEQ ID NO:19所示核苷酸序列的同一性至少为60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%;
(iii)包含与SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸;或,
(iv)包含与SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列所示的,包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
本发明的第十方面,提供了一种人源化CD73蛋白,所述的人源化CD73蛋白包含人CD73蛋白的部分。
优选的,所述的人源化CD73蛋白包含人CD73基因的1号至9号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分。进一步优选的,所述的人源化CD73蛋白由上述的人源化CD73基因编码。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的人源化CD73蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种:
a)SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的全部或部分;
b)与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列同一性至少为60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%;
c)与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸;或,
d)与SEQ ID NO:4所示的,包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
本发明的第十一方面,提供了一种多基因修饰的非人动物,所述的非人动物为上述的非人动物或上述的构建方法获得的非人动物,且所述的非人动物基因组中包含基因PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、BTLA、CD27、CD28、CD47、CD137、CD154、OX40、SIRPα、TIGIT、TIM-3、CD40和GITR中的至少一种的修饰。
本发明的第十二方面,提供了一种多基因修饰的非人动物的构建方法,包括如下步骤:
(一)提供上述的非人动物或上述的构建方法获得的非人动物;
(二)将步骤(一)提供的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑,并进行筛选,得到多基因修饰的非人动物。
优选的,所述的其他基因修饰的非人动物包括基因PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、BTLA、CD27、CD28、CD47、CD137、CD154、OX40、SIRPα、TIGIT、TIM-3、CD40和GITR中的至少一种的人源化的非人动物。
优选的,所述的多基因修饰的非人动物的基因组中人源化的多个基因中的每一个基因均可以是纯合或杂合的。
本发明的第十三方面,提供了一种上述构建方法获得的非人动物或其子代。
本发明的第十四方面,提供了一种动物的荷瘤或炎症模型,所述的荷瘤或炎症模型来源于上述的非人动物或上述的构建方法获得的非人动物。
本发明的第十五方面,提供了一种动物的荷瘤或炎症模型的构建方法,所述的构建方法包括采用上述构建方法获得CD73基因人源化的非人动物或多基因修饰的非人动物的步骤。
本发明的第十六方面,提供了一种上述的非人动物或上述的构建方法获得的非人动物在制备荷瘤或炎症动物模型中的应用。
本发明的第十七方面,提供了一种细胞或细胞系或原代细胞培养物,所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述的非人动物或上述的构建方法获得的非人动物,或上述的荷瘤或炎症模型。优选的,所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物不能发育为动物个体。
本发明的第十八方面,提供了一种组织或器官或其培养物,所述组织或器官或其培养物来源于上述的非人动物或上述的构建方法获得的非人动物,或上述的荷瘤或炎症模型。优选的,所述的组织或器官或其培养物不能发育为动物个体。
本发明的第十九方面,提供了一种荷瘤后的瘤组织,所述的瘤组织来源于上述的非人动物或上述的构建方法获得的非人动物,或上述的荷瘤或炎症模型。优选的,所述的荷瘤后的瘤组织不能发育为动物个体。
本发明的第二十方面,提供了一种CD73基因人源化的细胞,所述的细胞包含人或人源化CD73基因。优选包含上述的人源化CD73基因。
优选的,所述的细胞表达人或人源化CD73蛋白。进一步优选为本发明上述的人源化CD73蛋白。优选的,所述的细胞不能发育为动物个体。
本发明的第二十一方面,提供了一种CD73基因缺失的细胞,所述的细胞缺失CD73基因的1号至9号外显子的全部或部分。优选的,缺失2号外显子的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中,缺失编码SEQ ID NO:2第180-189位的核苷酸序列。
在本发明的另一个具体实施方式中,缺失CD73基因的从起始密码子开始至终止密码子为止的核苷酸序列。
优选的,所述的细胞不能发育为动物个体。
本发明的第二十二方面,提供了一种CD73基因缺失的非人动物,所述的非人动物缺失CD73基因的1号至9号外显子的全部或部分。优选的,缺失2号外显子的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中,缺失编码SEQ ID NO:2第180-189位的核苷酸序列。
在本发明的另一个具体实施方式中,缺失CD73基因的从起始密码子开始至终止密码子为止的核苷酸序列。
本发明的第二十三方面,提供一种CD73基因缺失的非人动物或者细胞的构建方法,所述的构建方法采用上述sgRNA。
本发明的第二十四方面,提供了一种包含上述的人源化CD73基因的构建体。
优选的,所述的构建体表达人或人源化CD73蛋白,所述的人源化CD73蛋白如上述的人源化CD73蛋白。
本发明的第二十五方面,提供了一种包含上述构建体的细胞。
优选的,所述的细胞不能发育为动物个体。
本发明的第二十六方面,提供了一种包含上述细胞的组织。
优选的,所述的组织不能发育为动物个体。
本发明的第二十七方面,提供了来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的人源化CD73基因、上述的人源化CD73蛋白、上述的荷瘤或炎症模型、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官或其培养物、上述的荷瘤后的瘤组织、上述的细胞、上述的构建体、上述的细胞或上述的组织在涉及人类细胞的免疫过程的产品开发,制造抗体,或者作为药理学、免疫学、微生物学、医学研究的模型系统中的应用;或者在生产和利用动物实验疾病模型,用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用;或者在筛选、验证、评价或研究CD73通路功能、人CD73通路信号机理、靶向人的抗体、靶向人的药物、药效,免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物,筛选和评估人用药及药效研究方面的应用。
优选的,所述应用不是疾病的治疗和/或诊断方法。
本发明的第二十八方面,提供了一种人CD73特异性调节剂的筛选方法,所述的筛选方法包括向个体施加调节剂;其中,所述的个体选自上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物或者上述的荷瘤或炎症模型。
优选的,所述的筛选方法还包括向个体植入肿瘤细胞。
优选的,所述的调节剂选自CAR-T、药物;优选的,所述的药物为抗体。
优选的,所述的筛选方法还包括检测肿瘤抑制性。
优选的,所述的调节剂为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。
优选的,所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率。
优选的,所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。
优选的,所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化,所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。
优选的,所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。
优选的,所述的筛选方法不是治疗方法。该方法用来筛选或评价药物,对候选药物的药效进行检测和比较,以确定哪些候选药物可以作为药物,哪些不能作为药物,或者,比较不同药物的药效敏感程度,即治疗效果不是必然的,只是一种可能性。
本发明的第二十九方面,提供了一种干预方案的评价方法,所述的评价方法包括向个体植入肿瘤细胞,向植入肿瘤细胞的个体施加干预方案,对施加干预方案后的个体进行肿瘤抑制效果检测和评价;其中,所述的个体选自上述的非人动物,上述的构建方法获得的非人动物,上述的非人动物或其子代,或者上述的荷瘤或炎症模型。
优选的,所述的干预方案选自CAR-T、药物治疗。进一步优选的,所述的药物为抗原结合蛋白。所述的抗体结合蛋白为抗体。
优选的,所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。
优选的,所述干预方案的评价方法不是治疗方法。该评价方法对干预方案的效果进行检测和评价,以确定该干预方案是否有治疗效果,即治疗效果不是必然的,只是一种可能性。
本发明的第三十方面,提供了一种来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的荷瘤或炎症模型在制备人CD73特异性调节剂中的用途。
本发明的第三十一方面,提供了一种来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的荷瘤或炎症模型在制备治疗肿瘤或自身免疫疾病的药物中的用途。
本发明所述的CD73基因人源化的非人动物,其体内可正常表达人或人源化CD73蛋白,可用于针对人CD73通路靶位点的药物筛选、药效评估、自身免疫疾病和肿瘤治疗,可以加快新药研发过程、节约时间和成本。
本发明所述的“免疫相关疾病”包括但不限于过敏、哮喘、皮炎、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。
本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、脑癌、非小细胞肺癌、宫颈癌、食道癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中,所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病;所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤,包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症;所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。
本发明所述的“全部或部分”,“全部”为整体,“部分”为整体中的局部,或者组成整体的个体。
本发明所述的“人源化CD73蛋白”,包含来源于人CD73蛋白的部分和非人CD73蛋白的部分。其中,所述的“人源化CD73蛋白”包含连续或间隔的5-574个氨基酸序列与人CD73蛋白的氨基酸序列一致。
本发明所述的“人源化CD73基因”,包含来源于人CD73基因的部分和非人CD73基因的部分。其中,所述的“人源化CD73基因”包含连续或间隔的20-46000bp个核苷酸序列与人CD73基因的核苷酸序列一致,优选为连续或间隔的20-1725、20-45928bp个,更优选为20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1725、1800、1900、2000、2500、3000、5000、10000、20000、30000、40000、45000或45928bp个核苷酸序列与人CD73基因的核苷酸序列一致。
本发明所述的“1号至9号外显子”或“1号至9号外显子的全部”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列,即1号外显子、1-2号内含子、2号外显子、2-3号内含子、3号外显子、3-4号内含子、4号外显子、4-5号内含子、5号外显子、5-6号内含子、6号外显子、6-7号内含子、7号外显子、7-8号内含子、8号外显子、8-9号内含子和9号外显子。
本发明所述的“1-2号内含子”表示1号外显子与2号外显子之间的内含子。
本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置,狭义上讲代表某一基因上的一段DNA片段,即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“CD73基因座”表示CD73基因1号至9号外显子上的任选一段的DNA片段。在本发明的一个具体实施方式中,被导入的CD73基因座可以是CD73基因1号至9号外显子上的任选一段的DNA片段。
本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、hnRNA、miRNAs、scRNA、snRNA、siRNA、sgRNA、tRNA。
本发明所述“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性,但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗(treating)”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。
本发明所述“同源性”,是指在使用氨基酸序列或核苷酸序列的方面,本领域技术人员在保证与已知序列相似结构或功能的前提下,可以根据实际工作需要对序列进行调整,使使用序列与现有技术获得的序列相比,具有(包括但不限于)1%,2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%,12%,13%,14%,15%,16%,17%,18%,19%,20%,21%,22%,23%,24%,25%,26%,27%,28%,29%,30%,31%,32%,33%,34%,35%,36%,37%,38%,39%,40%,41%,42%,43%,44%,45%,46%,47%,48%,49%,50%,51%,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,70%,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99.1%,99.2%,99.3%,99.4%,99.5%,99.6%,99.7%,99.8%,99.9%的同一性。
本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度,以区分另外的小鼠和人序列。
在一个方面,所述非人动物是哺乳动物。在一个方面,所述非人动物是小型哺乳动物,例如跳鼠科。在一个实施方式中,所述基因人源化的非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中,所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中,所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中,所述基因修饰的动物来自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中,所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中,所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中,所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中,所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中,所述非人动物是小鼠。
在一个特定实施方式中,所述非人动物是啮齿动物,其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠。
除非特别说明,本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如:Molecular Cloning A Laboratory Manual,2ndEd.,ed.By Sambrook,FritschandManiatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press:1989);DNA Cloning,Volumes I and II(D.N.Glovered.,1985);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.,1984);Mullisetal.U.S.Pat.No.4,683,195;Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984);Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984);Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,AlanR.Liss,Inc.,1987);Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986);B.Perbal,A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984);the series,Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelsonand M.Simon,eds.inchief,Academic Press,Inc.,New York),specifically,Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185,″Gene Expression Technology″(D.Goeddel,ed.);Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller andM.P.Caloseds.,1987,Cold Spring Harbor Laboratory);Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker,eds.,Academic Press,London,1987);Handbook Of Experimental Immunology,Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.,1986);and Manipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986)。
本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到,对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明,不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
附图说明
以下,结合附图来详细说明本发明的实施例,其中:
图1:小鼠和人CD73基因对比示意图(非按比例)。
图2:CD73基因人源化小鼠的CD73基因示意图一(非按比例)。
图3:制备CD73基因人源化小鼠所采用的打靶策略示意图一(非按比例)。
图4:Southern Blot结果,其中,ZL001至ZL018为小鼠编号,M为Marker、WT为野生型对照,H
图5:F1代小鼠鼠尾PCR鉴定体细胞基因型,其中,1F1001至1F1011为鼠尾编号,WT为野生型对照,M为Marker,H
图6:CD73基因人源化的小鼠FRT重组过程示意图(非按比例);
图7:制备CD73基因人源化小鼠所采用的打靶策略示意图二(非按比例)。
图8:sgRNA活性检测结果,其中Con为阴性对照,PC为阳性对照。
图9:F0代小鼠体细胞的基因型鉴定结果,其中,F0-01至F0-14为小鼠编号,WT为野生型对照,M为Marker,H
图10:F1代小鼠体细胞的基因型鉴定结果,其中,2F1-01至2F1-11为小鼠编号,PC为阳性对照,WT为野生型对照,M为Marker,H
图11:Southern blot检测结果,其中,2F1-01至2F1-11为小鼠编号,WT为野生型对照。
图12:CD73基因人源化小鼠的CD73基因示意图二(非按比例)。
图13:制备CD73基因人源化小鼠所采用的打靶策略示意图三(非按比例)。
图14:F1代小鼠体细胞的基因型鉴定结果,其中,3F1-01至3F1-11为小鼠编号,M为Marker,H
图15:RT-PCR检测结果示意图,其中,+/+为野生型对照,H/H为CD73基因人源化纯合小鼠,H
图16:脾脏中白细胞亚群占比的流式检测结果;
图17:脾脏中T细胞亚群占比的流式检测结果;
图18:淋巴结中白细胞亚群占比的流式检测结果;
图19:淋巴结中T细胞亚群占比的流式检测结果;
图20:外周血中白细胞亚群占比的流式检测结果;
图21:外周血中T细胞亚群占比的流式检测结果;
图22:血常规检测结果;
图23:血生化检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
在下述每一实施例中,设备和材料是从以下所指出的几家公司获得:
C57BL/6小鼠和Flp工具鼠均购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心;
AIO试剂盒来源北京百奥赛图基因生物技术有限公司,货号BCG-DX-004;
APC anti-mouse CD73 Antibody(mCD73 APC)购自Biolegend,货号为127209;
PerCP/Cy55 Anti-mouse TCR Beta Chain Antibody(mTcRβPerCP)购自Biolegend,货号为109228;
PE anti-human CD73(Ecto-5'-nucleotidase)Antibody(hCD73 PE)购自Biolegend,货号为344003;
FITC anti-mouse CD19 Antibody(hCD19 FITC)购自Biolegend,货号为115506;
PE anti-human CD73 Antibody(hCD73 PE)购自Biolegend,货号为344003;
PE/Cy
Brilliant Violet 510
APC anti-mouse CD73 Antibody(mCD73 APC)购自Biolegend,货号为127209。
本发明计划对非人动物(如小鼠)进行改造,使该非人动物体内包含编码人CD73蛋白的基因序列的全部或部分,以使其体内表达人或人源化CD73蛋白。可通过各种基因编辑系统和制备方法得到表达人CD73蛋白的非人哺乳动物,包括但不限于利用胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES)的基因打靶技术、锌指核酸酶(ZFN)技术、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)技术、归巢核酸内切酶(兆碱基大范围核酶)、规律成簇间隔短回文重复(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR)技术或其他分子生物学技术。本发明实施例主要以ES细胞的基因同源重组技术为例,阐述如何通过构建特异靶向小鼠CD73基因靶向载体实现序列替换得到所述人源化小鼠。
实施例1CD73基因人源化小鼠
小鼠CD73基因(NCBI Gene ID:23959,Primary source:MGI:99782,UniProt ID:Q61503,基于转录本NM_011851.4(SEQ ID NO:1)及其编码蛋白NP_035981.1(SEQ ID NO:2)和人CD73基因(NCBI Gene ID:4907,Primary source:HGNC:8021,UniProt ID:P21589,基于转录本NM_002526.4(SEQ ID NO:3)及其编码蛋白NP_002517.1(SEQ ID NO:4))对比示意图如图1所示。
鉴于人或小鼠CD73具有多种亚型或转录本,本文所述的方法可应用于其它亚型或转录本。
为了达到本发明的目的,可在内源小鼠CD73基因座引入编码人CD73蛋白的基因序列,使得该小鼠表达人或人源化CD73蛋白。用基因编辑技术对小鼠细胞进行修饰,例如,在内源小鼠CD73基因座2号外显子上插入可编码人CD73蛋白的序列。为了让人CD73蛋白在小鼠体内可以更稳定、更好的表达,保留小鼠promoter(启动子),在人CD73编码序列前插入P2A(如SEQ ID NO:10所示)。最终得到的改造后的人源化小鼠CD73基因示意图如图2,该小鼠通过内源性启动子调控人源CD73序列的表达,体内表达的CD73蛋白为人CD73蛋白;并进一步的设计了如图3所示的打靶策略。由于所插入的重组序列后存在终止密码子等转录终止序列,同时删除了小鼠的编码区部分序列,使人源化鼠CD73基因上的鼠编码区不能正常转录和翻译。
如图3所示的打靶策略示意图中,显示了靶向载体上含有小鼠CD73上游同源臂和下游同源臂序列,以及包含P2A、人CD73序列、小鼠3`UTR和STOP序列的A-1片段(SEQ ID NO:13)。其中,上述上游同源臂序列(5’同源臂,SEQ ID NO:7)与NCBI登录号为NC_000075.6的第88348101-88352454位核苷酸序列相同,下游同源臂序列(3’同源臂,SEQ ID NO:8)与NCBI登录号为NC_000075.6的第88354132-88358698位核苷酸序列相同;人CD73序列(SEQID NO:9)与NCBI登录号为NM_002526.4的第58-1782位核苷酸序列相同;STOP序列如SEQ IDNO:20所示,小鼠3’UTR序列如SEQ ID NO:22所示。A-1片段上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因,即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo,并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点,组成Neo盒(Neo cassette)。其中,P2A、人CD73序列、小鼠3`UTR和STOP序列和Neo盒序列在A-1片段上以5’到3’方向顺序排列,含有人CD73基因的序列和上游同源臂序列直接相连;Neo盒下游和鼠基因座的连接设计为5’-GCGGAACCCTTCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAA
此外,还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA))。
靶向载体构建可采用常规方法进行,如酶切连接等。构建好的靶向载体可通过酶切进行初步验证,再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中,利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选,并利用PCR和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况,筛选出正确的阳性克隆细胞,经PCR鉴定为阳性的克隆再进行Southern Blot检测,PCR检测结果见图4,结果显示有18个克隆为阳性克隆,经测序确定ZL004、ZL007、ZL009、ZL010、ZL011、ZL012、ZL013、ZL014、ZL016及ZL018为阳性克隆且无随机插入。
PCR测定包括下述引物:
Mut F1:5’-GAGTGGTATGTGCAGCTCAGGGAAG-3’(SEQ ID NO:24),
Mut R1:5’-GCTCCAAGAAACGAAAAGGCCGAGA-3’(SEQ ID NO:25);
将筛选出的正确阳性克隆按照本领域已知的技术将阳性克隆细胞(黑色鼠)导入已分离好的囊胚中(白色鼠),得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管,可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠,使用Mut F1引物及Mut R1引物检测,检测结果见图5,结果11只F1代小鼠全部为阳性小鼠,获得阳性得F1小鼠,再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(该过程示意图见图6)后,再通过互相交配即可得到表达人CD73蛋白的CD73基因人源化纯合子小鼠(V1)。
还可以使用其他基因编辑方法获得人源化小鼠,如利用CRISPR/Cas系统进行基因编辑,设计如图7所示的打靶策略,图7中显示了靶向载体上含有小鼠CD73基因上游和下游的同源臂序列,以及包含人CD73核苷酸序列的A-2片段,其中,上游同源臂序列(5’同源臂,SEQ ID NO:5)与NCBI登录号为NC_000075.6第88350685-88352454位核苷酸序列相同,下游同源臂序列(3’同源臂,SEQ ID NO:6)与NCBI登录号为NC_000075.6第88353811-88354943位核苷酸序列相同;其中,A-2片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示,人CD73核苷酸序列为SEQ ID NO:9,与图3中A-1片段人CD73核苷酸序列相同。改造后的人源化小鼠的蛋白序列分别为SEQ ID NO:4。
靶向载体构建可采用常规方法进行,如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后,再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体用于后续实验。
靶序列决定了sgRNA的靶向特异性和诱导Cas9切割目的基因的效率。因此,高效特异的靶序列选择和设计是构建sgRNA表达载体的前提。设计并合成识别靶位点的sgRNA序列。靶位点位于CD73基因2号外显子和2-3号内含子上,各sgRNA在CD73上的靶位点序列如下:
SgRNA1靶位点序列(SEQ ID NO:26):5’-AGCGCAAACATTAAGGCACGGGG-3’;
SgRNA2靶位点序列(SEQ ID NO:27):5’-TTAATGTTTGCGCTCAGAATTGG-3’;
SgRNA3靶位点序列(SEQ ID NO:28):5’-GAGCGCAAACATTAAGGCACGGG-3’;
SgRNA4靶位点序列(SEQ ID NO:29):5’-AATTCTGAGCGCAAACATTAAGG-3’;
SgRNA5靶位点序列(SEQ ID NO:30):5’-CCTCTAGCACATCAGATATCTGG-3’;
SgRNA6靶位点序列(SEQ ID NO:31):5’-TGAGCGCAAACATTAAGGCACGG-3’;
SgRNA7靶位点序列(SEQ ID NO:32):5’-GATTGTTGGATATACTTCAAAGG-3’;
SgRNA8靶位点序列(SEQ ID NO:33):5’-TTGGAAATTTAACGTTTCTGAGG-3’;
SgRNA9靶位点序列(SEQ ID NO:34):5’-CATCACTTGCGGGGAAGTCCTGG-3’;
SgRNA10靶位点序列(SEQ ID NO:35):5’-TGCTGAGTCCATCACTTGCGGGG-3’;
SgRNA11靶位点序列(SEQ ID NO:36):5’-CAGGACTTCCCCGCAAGTGATGG-3’;
SgRNA12靶位点序列(SEQ ID NO:37):5’-GTCTGTAACCCCGATAAGCTTGG-3’;
SgRNA13靶位点序列(SEQ ID NO:38):5’-TTGCATCTGCGGAGTTAGCATGG-3’;
SgRNA14靶位点序列(SEQ ID NO:39):5’-GCCATCGACCATTCGTGCACAGG-3’;
SgRNA15靶位点序列(SEQ ID NO:40):5’-CCCTGTGCACGAATGGTCGATGG-3’;
SgRNA16靶位点序列(SEQ ID NO:41):5’-AGTGGAGCCCTGTGCACGAATGG-3’;
利用UCA试剂盒检测多个sgRNA的活性,从结果可见sgRNA具有不同活性,检测结果见表1和图8。
表1:sgRNA相对活性检测结果
其中,虽然sgRNA2、sgRNA4、sgRNA8活性相对较低,这可能由于靶位点序列的特殊性导致,但根据我们的实验,sgRNA2、sgRNA4、sgRNA8的数值仍显著高于对照组数值,仍可判断sgRNA2、sgRNA4、sgRNA8是具有活性的,活性满足基因打靶实验要求,从中选择sgRNA7和sgRNA14进行后续实验。在其5’端及互补链上分别加上酶切位点得到正向寡核苷酸和反向寡核苷酸(见表2),退火后将退火产物分别连接至pT7-sgRNA质粒(质粒先用BbsI线性化),获得表达载体pT7-CD73-7和pT7-CD73-14。
表2 sgRNA7和sgRNA14正反向寡核苷酸序列
pT7-sgRNA载体由质粒合成公司合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA(SEQ ID NO:21)并依次通过酶切(EcoRI及BamHI)连接至骨架载体(来源Takara,货号3299)上,经专业测序公司测序验证,结果表明获得了目的质粒。
取野生型C57BL/6小鼠受精卵,利用显微注射仪将pT7-CD73-7和pT7-CD73-14质粒的体外转录产物(使用Ambion体外转录试剂盒,按照说明书方法进行转录)、靶向载体与Cas9 mRNA预混好后注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》(安德拉斯·纳吉,化学工业出版社,2006)中的方法进行受精卵的显微注射,注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养,然后移植至受体母鼠的输卵管中发育,将获得的小鼠(F0代)通过杂交和自交,扩大种群数量,建立稳定的CD73人源化小鼠。
可通过与本实施例前述相同的PCR方法鉴定F0代小鼠体细胞的基因型(引物序列相同),部分F0代小鼠的鉴定结果见图9,图中编号为F0-01、F0-02、F0-04、F0-11和F0-13的5只小鼠为阳性小鼠,经测序进一步验证这8只小鼠为阳性小鼠且无随机插入。
WT-F:5’-TTTGATAACGGTGTGGAAGGACTGAT-3’(SEQ ID NO:48)
WT-R:5’-AGACAGCGATGCCCTTCAGAGGATA-3’(SEQ ID NO:49)
WT-F:5’-TTTGATAACGGTGTGGAAGGACTGAT-3’(SEQ ID NO:48)
Mut-R:5’-TACACGGTGAACCAGATAGTGCCC-3’(SEQ ID NO:50)
GT-F:5’-GTGGGCGGAATCCATGTGGTGTATG-3’(SEQ ID NO:51)
GT-R:5’-GCCCCAGGGCGATGATCTTATTCAC-3’(SEQ ID NO:52)
将F0鉴定为阳性的CD73人源化小鼠与C57BL/6野生型小鼠交配得到F1代小鼠。可使用同样的PCR方法对F1代小鼠进行基因型鉴定,结果见图10,图中显示编号为2F1-01到2F1-11的11只小鼠均为阳性小鼠。对这11只F1代PCR鉴定为阳性的小鼠进行Southern blot检测,确认是否存在随机插入。剪取鼠尾提取基因组DNA,选用BglII酶或NcoI酶消化基因组,转膜,杂交。探针5’Probe、3’Probe分别位于5’同源臂左侧及3’同源臂上,具体探针及目的片段的长度见表3。
表3具体探针及目的片段的长度
探针合成引物如下:
5’Probe-F(SEQ ID NO:53):5’-AGAGACCCTTTAGACCTGGATCAGC-3’
5’Probe-R(SEQ ID NO:54):5’-ACCTAGAAAACTTTGGTGGGACATGA-3’
lox2 Stop Probe(3’)-F(SEQ ID NO:55):5’-AACTGATGAATGGGAGCAGTGGTGG-3’
lox2 Stop Probe(3’)-R(SEQ ID NO:56):5’-GCAGACACTCTATGCCTGTGTGGAG-3’
Southern blot检测结果见图11。综合5’Probe和STOP probe的结果,并进一步经测序验证,编号为2F1-01至2F1-11的11只小鼠均无随机插入,证实这11只小鼠为阳性杂合小鼠且不存在随机插入。这表明使用本方法能构建出可稳定传代,且无随机插入的CD73人源化基因工程小鼠(V1)。
可采用RT-PCR检测CD73基因人源化小鼠体内人源化CD73 mRNA的表达情况。分别选取7周龄野生型C57BL/6小鼠和人源化CD73纯合子小鼠各1只,脱颈安乐死后取膀胱组织,提取细胞总RNA,利用逆转录试剂盒逆转录成cDNA后进行PCR扩增,引物序列如表4所示。
表4 RT-PCR检测引物序列及目的片段长度
检测结果显示(见图15),在野生型C57BL/6小鼠细胞中可检测到鼠CD73 mRNA表达,未检测出人源化CD73 mRNA表达;在人源化CD73纯合子小鼠细胞中检测到人源化CD73mRNA表达,未检测出鼠CD73 mRNA表达。
为了获得上述CD73人源化小鼠,还可以选择将人CD73基因组序列替换到小鼠基因座上,以下通过BAC转基因方法实现对小鼠CD73基因的改造,最终得到的人源化小鼠CD73基因示意图如图12所示,并设计了如图13所示的打靶策略图。图中显示了靶向载体上含有小鼠CD73上游同源臂和下游同源臂序列,以及包含人CD73基因序列的A-3片段。其中,上述上游同源臂序列(5’同源臂,SEQ ID NO:15)与NCBI登录号为NC_000075.6的第88323954-88327685位核苷酸序列相同,下游同源臂序列(3’同源臂,SEQ ID NO:16)与NCBI登录号为NC_000075.6的第88372532-88377482位核苷酸序列相同;人CD73序列(SEQ ID NO:17)与NCBI登录号为NC_000006.12的第85450140-85496067位核苷酸序列相同;A-3片段(如SEQID NO:18所示)上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因,即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo,并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统LOXP重组位点。
此外,还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA))。
靶向载体构建可采用常规方法进行,如酶切连接等。构建好的靶向载体可通过酶切进行初步验证,再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中,利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选,并利用PCR和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况,筛选出正确的阳性克隆细胞,经PCR鉴定为阳性的克隆再进行Southern Blot检测,PCR检测结果见,结果显示为阳性克隆,送测序确认,并选择阳性克隆且无随机插入克隆进行下一步。
PCR测定包括下述引物:
L-GT-F:5’-AAGATGTTTCTTGTCCCGGGTTTCG-3’(SEQ ID NO:57)
L-GT-R:5’-GCAGTAAATGAGAGCTGCGTGAGGG-3’(SEQ ID NO:14)
将筛选出的正确阳性克隆按照本领域已知的技术将阳性克隆细胞(黑色鼠)导入已分离好的囊胚中(白色鼠),得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管,可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠,使用L-GT-F及L-GT-R引物检测,检测结果见图14,结果显示11只小鼠全部为阳性小鼠。再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Cre工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因后,再通过互相交配即可得到表达人CD73蛋白的CD73基因人源化纯合子小鼠(V2)。改造后的人源化小鼠的mRNA序列的编码区和蛋白序列分别为SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:4。
实施例2CD73基因人源化小鼠体内人源化蛋白表达
通过常规检测方法可确认小鼠体内人源化CD73蛋白的表达情况,本实施例中,对实施例1获得的两种CD73基因人源化小鼠,采用流式细胞术进行蛋白表达检测。
选取8周龄野生型C57BL/6小鼠,以及V1版和V2版CD73基因人源化纯合子小鼠各1只,安乐死后取脾脏细胞,分别用抗鼠TCRβ抗体PerCP/Cy5.5 anti-mouse TCRβchainAntibody(mTcRβPerCP)、抗鼠CD19抗体FITC anti-mouse CD19 Antibody(hCD19 FITC)、抗人CD73抗体PE anti-human CD73 Antibody(hCD73 PE)、抗鼠Foxp3抗体PE/CyTM7anti-mouse/rat Foxp3 Antibody(mFoxp3 PE)、抗鼠CD4抗体Brilliant Violet 510
表5流式检测结果
上述结果表明,在C57BL/6小鼠体内检测到鼠CD73蛋白,未检测出人CD73蛋白;在V1版和V2版CD73基因人源化纯合子小鼠体内检测到人CD73蛋白,未检测到鼠CD73蛋白。
进一步对野生型C57BL/6小鼠和V1版CD73人源化纯合子小鼠的脾脏、淋巴结和外周血中的白细胞和T细胞免疫分型情况进行流式检测。脾脏中白细胞亚型和T细胞亚型检测结果分别如图16和图17所示,从图中可以看出,CD73基因人源化纯合子小鼠脾脏样本中B细胞、T细胞、NK细胞、CD4+T细胞、CD8+ T细胞、粒细胞(Granulocyte)、DC细胞、巨噬细胞(Macrophage)和单核细胞(Monocyte)等白细胞亚型与C57BL/6野生型小鼠基本一致(图16),CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和Tregs细胞等T细胞亚型百分比与C57BL/6野生型小鼠一致(图17)。
淋巴结中白细胞亚型和T细胞亚型检测结果分别如图18和图19所示,从图中可以看出,CD73基因人源化纯合子小鼠淋巴结样本中B细胞、T细胞、NK细胞、CD4+T细胞、CD8+ T细胞等白细胞亚型与C57BL/6野生型小鼠一致(图18),CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和Tregs细胞等T细胞亚型百分比与C57BL/6野生型小鼠基本一致(图19)。
外周血中白细胞亚型和T细胞亚型检测结果分别如图20和图21所示,从图中可以看出,CD73基因人源化纯合子小鼠外周血样本中B细胞、T细胞、NK细胞、CD4+T细胞、CD8+ T细胞、、粒细胞(Granulocyte)、DC细胞、巨噬细胞(Macrophage)和单核细胞(Monocyte)等白细胞亚型与C57BL/6野生型小鼠基本一致(图20),CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和Tregs细胞等T细胞亚型百分比与C57BL/6野生型小鼠基本一致(图21)。
上述结果表明CD73基因的人源化改造没有影响小鼠体内白细胞和T细胞的分化、发育和在脾脏、淋巴组织和外周血中的分布。
更进一步分别对野生型C57BL/6小鼠和CD73人源化纯合子小鼠采血,进行血常规和血生化检测,血常规结果如图22所示,CD73基因人源化纯合子小鼠外周血样本中白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)、血红蛋白浓度(HB)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞分布宽度(RDW)、血小板计数(PLT)、平均血小板体积(MPV)、中性粒细胞计数(NE)、淋巴细胞计数(LY)和单核细胞计数(MO)结果与C57BL/6野生型小鼠基本一致;血生化检测结果如图23所示,CD73基因人源化纯合子小鼠外周血样本中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、血清总胆固醇(TC)、肌酐(CR)、血糖(GLU)、甘油三脂(TRIG)、尿素(UREA)和血清白蛋白(ALB)结果与C57BL/6野生型小鼠基本一致。上述结果表明CD73基因的人源化改造没有影响血细胞的组成和形态,也没有改变AST和ALT水平及肝脏健康状态。
实施例3双重人源化或多基因人源化小鼠
利用前述制得的CD73基因人源化小鼠还可以制备包含人源化CD73基因的多人源化小鼠模型。如,显微注射及胚胎移植过程使用的受精卵细胞选择来源于其它基因修饰小鼠的受精卵细胞,如,对PD-1人源化小鼠的受精卵细胞进行基因编辑,可以得到PD-1和CD73双基因人源化小鼠模型。也可将CD73人源化小鼠纯合子或杂合子与其它基因修饰纯合或杂合小鼠交配,对其后代进行筛选,根据孟德尔遗传规律,可有一定几率得到CD73人源化小鼠与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠,再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子。
以双重人源化CTLA4/CD73小鼠为例,由于小鼠CTLA4与CD73基因分别均位于1号和9号染色体上,选择CTLA4人源化小鼠和CD73人源化小鼠交配,通过阳性子代小鼠的筛选,可得到双重人源化CTLA4/CD73基因小鼠。
实施例4评估药效
利用本方法制得的CD73基因人源化小鼠可以用于评估靶向人CD73的调节剂药效。取CD73人源化小鼠纯合子皮下接种小鼠结肠癌细胞MC38-hCD73(表达人CD73的MC38细胞),待肿瘤体积生长到约100mm
以上详细描述了本发明的优选实施方式,但是,本发明并不限于上述实施方式中的具体细节,在本发明的技术构思范围内,可以对本发明的技术方案进行多种简单变型,这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是,在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征,在不矛盾的情况下,可以通过任何合适的方式进行组合,为了避免不必要的重复,本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外,本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合,只要其不违背本发明的思想,其同样应当视为本发明所公开的内容。
序列表
<110> 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司
<120> CD73基因人源化的非人动物的构建方法及应用
<130> 1
<150> CN202010807504.X
<151> 2020-08-12
<160> 63
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3580
<212> DNA/RNA
<213> 小鼠(Mouse)
<400> 1
agtttagtag aggccccggt ggccggtgct cactgggctc agggccagtc cacccgctca 60
acgcgctcta gccagccatg cgtcccgcgg ccgctaaggt acccaagtgg ctgcttctcg 120
cactgagcgc tctactacca cagtggcccg cagccagtgc ctgggagctc acgatcctgc 180
acacaaacga cgtgcacagc cggctagagc agaccagcga tgactccacc aagtgcctca 240
acgccagcct gtgtgtgggc ggcgtggccc ggctctttac caaggtgcag cagatccgca 300
aggaagaacc caacgtgctg tttttggatg ccggagacca gtaccagggc accatctggt 360
tcaccgttta caaaggcctt gaagtggcac acttcatgaa catcctgggc tacgatgcta 420
tggcactggg aaatcatgaa tttgataacg gtgtggaagg actgattgat cccctcctca 480
gaaacgttaa atttccaatt ctgagcgcaa acattaaggc acgggggcct ctagcacatc 540
agatatctgg actttttctg ccatctaaag ttctctctgt tggcggtgag gttgtgggga 600
ttgttggata tacttcaaag gaaacccctt tcctctcaaa tccagggaca aatttagtct 660
ttgaagatga aatctctgca ttgcagcctg aagtagataa actaaagacg ctaaatgtga 720
ataagatcat cgccctgggg cactctggtt ttgagatgga caaacttatc gctcagaaag 780
ttcgaggtgt ggacatcgtg gtgggaggac actccaacac ctttctctac acaggaaatc 840
caccttccaa agaagtgcct gcggggaagt acccattcat agtcaccgca gatgatggac 900
ggcaggtgcc tgtggtccag gcctatgcct ttggcaaata cctgggctac ctgaaggttg 960
agtttgatga taaaggcaat gttatcactt cctatggaaa tcccattctt ctcaacagca 1020
gcattcctga agatgcgacc atcaaagcag acattaacca atggaggata aaattagata 1080
attattctac ccaggaactc gggagaacga tcgtctacct ggatggctcc actcagacgt 1140
gccgcttcag ggaatgcaac atgggaaacc tgatctgtga tgccatgatt aacaacaacc 1200
tcagacaccc agatgaaatg ttttggaacc acgtgtccat gtgcattgta aacggaggtg 1260
gcatccggtc ccccattgat gagaagaaca atggtaccat cacctgggag aacctggctg 1320
ctgtgctgcc ctttggaggg acatttgacc tcgtccaatt aaaagggtcc accctgaaga 1380
aggcttttga gcacagcgtg catcgctatg gccagtccac cggagagttc ctgcaagtgg 1440
gtggaatcca tgtggtgtac gatattaacc gaaagccctg gaacagagtg gtccaattag 1500
aagttctctg caccaagtgt cgagtgccca tctatgagcc tcttgaaatg gataaagtgt 1560
ataaagtgac cctcccaagc tatctggcca acggtggaga tggattccag atgataaaag 1620
atgaattact aaagcatgac tctggtgatc aagatatcag cgtggtttct gaatacatct 1680
caaaaatgaa agtagtttac ccagccgttg aagggcggat caagttctct gcagcaagtc 1740
attaccaggg aagctttcct ttagtaattc tttcattttg ggcaatgatc cttattttgt 1800
accaataaca gggagtctcc ttgtccttga tgtcaaacta catttttctt ccagtgatat 1860
tcatatctgc ctctggagac ctggctttgt aacagcactc atcatcctca aggttcctag 1920
cagatgttct tcacaaggaa gagactgtaa catcatttgt tggggccagc aactcagtga 1980
gcagatagaa agtcacagtg aaccaacagg gtccttctgg cagggagtgg gtaaggggaa 2040
acaactagat gtagcttgca tagccacata acacatctgg ttaccatttc cctttctatt 2100
catttctaat ccatcaaaca attgatgttt acatacaact tcatcatcgc cagctctggt 2160
ggcacatgcc tgtggtcacg gcacttggca gggaggagag gatggctgca agttctaggc 2220
cagcctgaca tatgtagagt ttcaggccag tcagctagat atcaagactc acacacacaa 2280
acaaacatta taatttacaa gtagattttt gtagacaagt cttatgataa gctaagcaga 2340
aagggtcgac ttgttcaagg tcagacatct ccaaataata catctaagat ctgtacctga 2400
gtctttttac ctcaagtcca acctctcgcc tactgtcaag tctcctctct tcctgcggtt 2460
ggtctcagac aacaaatctg tttctgcctt ccatagtacc ctttcttttg ggctcttgtt 2520
gtctctcagg tttgagagag tagctactgg acaggattct ttcctacaac accatgtgcc 2580
tttggtgagt catagacaaa ctgtatacag cagataatag attagtccag ggactgcaaa 2640
aggcagtcag ggacaggcag gaaagggaaa ggagaatatg accaggactt acagaagaga 2700
gtagatgggt tccataaaca ctagttaagg agcagaacat ggctccaaag cacaacactg 2760
gttcttatta actcctgtgc gactccaaaa gccctgcctc tctccttcct tcttcctcac 2820
atggaggtgc catgagagaa cttcctaaaa taaactgtaa ttctcaacct gcacctgtcc 2880
tgtccaagat gccaacacgg ctctcattca agtcacacat gtacaatcca atattctgga 2940
aggcaagagt gaatttaaga agtggtatac ataaatgttt gaagtcactg agactcaaat 3000
cccacacaac cactgtaagg catactcagg tcaagacatg agaagaccag caggacagtg 3060
agccctatgg gaggcccaag agatacccag actgatgaaa tgatctgtgc ccacagaaca 3120
ccagaccaag acagtcctgt gaccaagtga gcatagtcag cactgtacag tagttaagaa 3180
tccttaacta taaaccagca gctagatgtc tggacaggga acatgttggt ttcctagtgt 3240
ttacgaatat taaggactct tgacccaaac cgtttaaaat tccaatcctt ttatgaagtt 3300
tgttgcagtg aaacaatgcc ttcagttctt tttgaatgtg tagattagtt ataaacagaa 3360
atgtcagtaa gactgtaaaa aaaaatgaag aaaggtgcat atgaggtata tttttatgct 3420
tggcgagtaa ataaggagaa atcttatagc ataattttta aagaacattt gtataatttt 3480
tctaaatatg tgtatatgta tattttatgc agcagtattg agaaatgacc ttggactatc 3540
ttgtaattgt aaattccaaa aataaagctg aagatatagt 3580
<210> 2
<211> 576
<212> PRT
<213> 小鼠(Mouse)
<400> 2
Met Arg Pro Ala Ala Ala Lys Val Pro Lys Trp Leu Leu Leu Ala Leu
1 5 10 15
Ser Ala Leu Leu Pro Gln Trp Pro Ala Ala Ser Ala Trp Glu Leu Thr
20 25 30
Ile Leu His Thr Asn Asp Val His Ser Arg Leu Glu Gln Thr Ser Asp
35 40 45
Asp Ser Thr Lys Cys Leu Asn Ala Ser Leu Cys Val Gly Gly Val Ala
50 55 60
Arg Leu Phe Thr Lys Val Gln Gln Ile Arg Lys Glu Glu Pro Asn Val
65 70 75 80
Leu Phe Leu Asp Ala Gly Asp Gln Tyr Gln Gly Thr Ile Trp Phe Thr
85 90 95
Val Tyr Lys Gly Leu Glu Val Ala His Phe Met Asn Ile Leu Gly Tyr
100 105 110
Asp Ala Met Ala Leu Gly Asn His Glu Phe Asp Asn Gly Val Glu Gly
115 120 125
Leu Ile Asp Pro Leu Leu Arg Asn Val Lys Phe Pro Ile Leu Ser Ala
130 135 140
Asn Ile Lys Ala Arg Gly Pro Leu Ala His Gln Ile Ser Gly Leu Phe
145 150 155 160
Leu Pro Ser Lys Val Leu Ser Val Gly Gly Glu Val Val Gly Ile Val
165 170 175
Gly Tyr Thr Ser Lys Glu Thr Pro Phe Leu Ser Asn Pro Gly Thr Asn
180 185 190
Leu Val Phe Glu Asp Glu Ile Ser Ala Leu Gln Pro Glu Val Asp Lys
195 200 205
Leu Lys Thr Leu Asn Val Asn Lys Ile Ile Ala Leu Gly His Ser Gly
210 215 220
Phe Glu Met Asp Lys Leu Ile Ala Gln Lys Val Arg Gly Val Asp Ile
225 230 235 240
Val Val Gly Gly His Ser Asn Thr Phe Leu Tyr Thr Gly Asn Pro Pro
245 250 255
Ser Lys Glu Val Pro Ala Gly Lys Tyr Pro Phe Ile Val Thr Ala Asp
260 265 270
Asp Gly Arg Gln Val Pro Val Val Gln Ala Tyr Ala Phe Gly Lys Tyr
275 280 285
Leu Gly Tyr Leu Lys Val Glu Phe Asp Asp Lys Gly Asn Val Ile Thr
290 295 300
Ser Tyr Gly Asn Pro Ile Leu Leu Asn Ser Ser Ile Pro Glu Asp Ala
305 310 315 320
Thr Ile Lys Ala Asp Ile Asn Gln Trp Arg Ile Lys Leu Asp Asn Tyr
325 330 335
Ser Thr Gln Glu Leu Gly Arg Thr Ile Val Tyr Leu Asp Gly Ser Thr
340 345 350
Gln Thr Cys Arg Phe Arg Glu Cys Asn Met Gly Asn Leu Ile Cys Asp
355 360 365
Ala Met Ile Asn Asn Asn Leu Arg His Pro Asp Glu Met Phe Trp Asn
370 375 380
His Val Ser Met Cys Ile Val Asn Gly Gly Gly Ile Arg Ser Pro Ile
385 390 395 400
Asp Glu Lys Asn Asn Gly Thr Ile Thr Trp Glu Asn Leu Ala Ala Val
405 410 415
Leu Pro Phe Gly Gly Thr Phe Asp Leu Val Gln Leu Lys Gly Ser Thr
420 425 430
Leu Lys Lys Ala Phe Glu His Ser Val His Arg Tyr Gly Gln Ser Thr
435 440 445
Gly Glu Phe Leu Gln Val Gly Gly Ile His Val Val Tyr Asp Ile Asn
450 455 460
Arg Lys Pro Trp Asn Arg Val Val Gln Leu Glu Val Leu Cys Thr Lys
465 470 475 480
Cys Arg Val Pro Ile Tyr Glu Pro Leu Glu Met Asp Lys Val Tyr Lys
485 490 495
Val Thr Leu Pro Ser Tyr Leu Ala Asn Gly Gly Asp Gly Phe Gln Met
500 505 510
Ile Lys Asp Glu Leu Leu Lys His Asp Ser Gly Asp Gln Asp Ile Ser
515 520 525
Val Val Ser Glu Tyr Ile Ser Lys Met Lys Val Val Tyr Pro Ala Val
530 535 540
Glu Gly Arg Ile Lys Phe Ser Ala Ala Ser His Tyr Gln Gly Ser Phe
545 550 555 560
Pro Leu Val Ile Leu Ser Phe Trp Ala Met Ile Leu Ile Leu Tyr Gln
565 570 575
<210> 3
<211> 3562
<212> DNA/RNA
<213> 人(human)
<400> 3
actcgccggc actcgcccgg ctcgcccgct ttcgcaccca gttcacgcgc cacagctatg 60
tgtccccgag ccgcgcgggc gcccgcgacg ctactcctcg ccctgggcgc ggtgctgtgg 120
cctgcggctg gcgcctggga gcttacgatt ttgcacacca acgacgtgca cagccggctg 180
gagcagacca gcgaggactc cagcaagtgc gtcaacgcca gccgctgcat gggtggcgtg 240
gctcggctct tcaccaaggt tcagcagatc cgccgcgccg aacccaacgt gctgctgctg 300
gacgccggcg accagtacca gggcactatc tggttcaccg tgtacaaggg cgccgaggtg 360
gcgcacttca tgaacgccct gcgctacgat gccatggcac tgggaaatca tgaatttgat 420
aatggtgtgg aaggactgat cgagccactc ctcaaagagg ccaaatttcc aattctgagt 480
gcaaacatta aagcaaaggg gccactagca tctcaaatat caggacttta tttgccatat 540
aaagttcttc ctgttggtga tgaagttgtg ggaatcgttg gatacacttc caaagaaacc 600
ccttttctct caaatccagg gacaaattta gtgtttgaag atgaaatcac tgcattacaa 660
cctgaagtag ataagttaaa aactctaaat gtgaacaaaa ttattgcact gggacattcg 720
ggttttgaaa tggataaact catcgctcag aaagtgaggg gtgtggacgt cgtggtggga 780
ggacactcca acacatttct ttacacaggc aatccacctt ccaaagaggt gcctgctggg 840
aagtacccat tcatagtcac ttctgatgat gggcggaagg ttcctgtagt ccaggcctat 900
gcttttggca aatacctagg ctatctgaag atcgagtttg atgaaagagg aaacgtcatc 960
tcttcccatg gaaatcccat tcttctaaac agcagcattc ctgaagatcc aagcataaaa 1020
gcagacatta acaaatggag gataaaattg gataattatt ctacccagga attagggaaa 1080
acaattgtct atctggatgg ctcctctcaa tcatgccgct ttagagaatg caacatgggc 1140
aacctgattt gtgatgcaat gattaacaac aacctgagac acacggatga aatgttctgg 1200
aaccacgtat ccatgtgcat tttaaatgga ggtggtatcc ggtcgcccat tgatgaacgc 1260
aacaatggca caattacctg ggagaacctg gctgctgtat tgccctttgg aggcacattt 1320
gacctagtcc agttaaaagg ttccaccctg aagaaggcct ttgagcatag cgtgcaccgc 1380
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cccagttatg accctctcaa aatggacgag gtatataagg tgatcctccc aaacttcctg 1560
gccaatggtg gagatgggtt ccagatgata aaagatgaat tattaagaca tgactctggt 1620
gaccaagata tcaacgtggt ttctacatat atctccaaaa tgaaagtaat ttatccagca 1680
gttgaaggtc ggatcaagtt ttccacagga agtcactgcc atggaagctt ttctttaata 1740
tttctttcac tttgggcagt gatctttgtt ttataccaat agccaaaaat tctccttgcc 1800
tttaatgtgt gaaactgcat tttttcaagt gagattcaaa tctgcctttt aggacctggc 1860
tttgtgacag caaaaaccat ctttacaggc tcctagaagc tgaaggttag agcattataa 1920
aatgaagaga cagacatgat tactcagggt cagcaaccta gtgagttaga aaaaaaatta 1980
acatagggcc ctataaggag aaagccaact atgttaagtt tacgtgtcca aattttaatg 2040
aaattttact aacaatttta aaccatattt ttcttcttca tatccatttc taatccatca 2100
aacagcttat gtttacataa aattttatca ttcacaagga agttttaagc acactgtctc 2160
atttgatatc cacaacttat ttttggtagg aaagagagat gtttttccca cctgtcagat 2220
gaaaaaactg aagctcaaaa agggttgact tgaccataca gctaatgctg acagatccaa 2280
gacctagacc taggtctttt gaactcaagt ccagcattct caactatatc aagttactgt 2340
tcagaatact taatatctcc tctcttcata attatcaata gccccaagct catggatgac 2400
aaatctctgc tttatttctt gtctctattt tttcacttta tagctcctgt tataatagca 2460
agtttaatgg tataaacaca ggataccatc ctctcttgca acacccatgt gcctttgatg 2520
agtcaggtag caagctgtag tagataatga gaaaggccag aggctgcaaa agacagtcaa 2580
aggacacgag agaaaggaag gggaagaaca ggactccagg actgttttat attatagaaa 2640
agcaagagct aaagagcatt tacacatgtt aaacagatac ttgttaagca tagtgcctga 2700
cacacggcat tagctgttat tttatgagat tccatcagct ctgcctctgt cctctttctt 2760
ctaacatgaa ggtatcatga gaagagaacc ttctaacata agctgtaatt ctaaacctgc 2820
acttgtccct ctccagcaag aggctagcac tgaattcatt ctactcatac tacacaccca 2880
gttatggaat gtccagagtt ctcgaagaaa ataaatgact ttaggaagag gtatacattt 2940
tttaagtcgc tctgcctcca aatctgaaca gtcactgtaa atcattctta agcccagata 3000
tgagaacttc tgctggaaag tgggaccctc tgagtgggtg gtcagaaaat acccatgctg 3060
atgaaatgac ctatgcccaa agaacaaata cttaacgtgg gagtggaacc acatgagcct 3120
gctcagctct gcataagtaa ttcaagaaat gggaggcttc accttaaaaa cagtgtgcaa 3180
atggcagcta gaggttttga taggaagtat gtttgtttct tagtgtttac aaatattaag 3240
tactcttgat acaaaatata cttttaaact tcataacctt tttataaaag ttgttgcagc 3300
aaaataatag cctcggttct atgcatatat ggattagcta taaaaaatgt caataagatt 3360
gtacaaggaa aattagagaa agtcacattt agggtttatt ttttacactt ggccagtaaa 3420
atagggtaaa tcctattaga attttttaaa gaactttttt taagtttcct aaatctgtgt 3480
gtgtattgtg aagtggtata agaaatgact ttgaaccact ttgcaattgt agattcccaa 3540
caataaaatt gaagataagc tc 3562
<210> 4
<211> 574
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 4
Met Cys Pro Arg Ala Ala Arg Ala Pro Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu
1 5 10 15
Gly Ala Val Leu Trp Pro Ala Ala Gly Ala Trp Glu Leu Thr Ile Leu
20 25 30
His Thr Asn Asp Val His Ser Arg Leu Glu Gln Thr Ser Glu Asp Ser
35 40 45
Ser Lys Cys Val Asn Ala Ser Arg Cys Met Gly Gly Val Ala Arg Leu
50 55 60
Phe Thr Lys Val Gln Gln Ile Arg Arg Ala Glu Pro Asn Val Leu Leu
65 70 75 80
Leu Asp Ala Gly Asp Gln Tyr Gln Gly Thr Ile Trp Phe Thr Val Tyr
85 90 95
Lys Gly Ala Glu Val Ala His Phe Met Asn Ala Leu Arg Tyr Asp Ala
100 105 110
Met Ala Leu Gly Asn His Glu Phe Asp Asn Gly Val Glu Gly Leu Ile
115 120 125
Glu Pro Leu Leu Lys Glu Ala Lys Phe Pro Ile Leu Ser Ala Asn Ile
130 135 140
Lys Ala Lys Gly Pro Leu Ala Ser Gln Ile Ser Gly Leu Tyr Leu Pro
145 150 155 160
Tyr Lys Val Leu Pro Val Gly Asp Glu Val Val Gly Ile Val Gly Tyr
165 170 175
Thr Ser Lys Glu Thr Pro Phe Leu Ser Asn Pro Gly Thr Asn Leu Val
180 185 190
Phe Glu Asp Glu Ile Thr Ala Leu Gln Pro Glu Val Asp Lys Leu Lys
195 200 205
Thr Leu Asn Val Asn Lys Ile Ile Ala Leu Gly His Ser Gly Phe Glu
210 215 220
Met Asp Lys Leu Ile Ala Gln Lys Val Arg Gly Val Asp Val Val Val
225 230 235 240
Gly Gly His Ser Asn Thr Phe Leu Tyr Thr Gly Asn Pro Pro Ser Lys
245 250 255
Glu Val Pro Ala Gly Lys Tyr Pro Phe Ile Val Thr Ser Asp Asp Gly
260 265 270
Arg Lys Val Pro Val Val Gln Ala Tyr Ala Phe Gly Lys Tyr Leu Gly
275 280 285
Tyr Leu Lys Ile Glu Phe Asp Glu Arg Gly Asn Val Ile Ser Ser His
290 295 300
Gly Asn Pro Ile Leu Leu Asn Ser Ser Ile Pro Glu Asp Pro Ser Ile
305 310 315 320
Lys Ala Asp Ile Asn Lys Trp Arg Ile Lys Leu Asp Asn Tyr Ser Thr
325 330 335
Gln Glu Leu Gly Lys Thr Ile Val Tyr Leu Asp Gly Ser Ser Gln Ser
340 345 350
Cys Arg Phe Arg Glu Cys Asn Met Gly Asn Leu Ile Cys Asp Ala Met
355 360 365
Ile Asn Asn Asn Leu Arg His Thr Asp Glu Met Phe Trp Asn His Val
370 375 380
Ser Met Cys Ile Leu Asn Gly Gly Gly Ile Arg Ser Pro Ile Asp Glu
385 390 395 400
Arg Asn Asn Gly Thr Ile Thr Trp Glu Asn Leu Ala Ala Val Leu Pro
405 410 415
Phe Gly Gly Thr Phe Asp Leu Val Gln Leu Lys Gly Ser Thr Leu Lys
420 425 430
Lys Ala Phe Glu His Ser Val His Arg Tyr Gly Gln Ser Thr Gly Glu
435 440 445
Phe Leu Gln Val Gly Gly Ile His Val Val Tyr Asp Leu Ser Arg Lys
450 455 460
Pro Gly Asp Arg Val Val Lys Leu Asp Val Leu Cys Thr Lys Cys Arg
465 470 475 480
Val Pro Ser Tyr Asp Pro Leu Lys Met Asp Glu Val Tyr Lys Val Ile
485 490 495
Leu Pro Asn Phe Leu Ala Asn Gly Gly Asp Gly Phe Gln Met Ile Lys
500 505 510
Asp Glu Leu Leu Arg His Asp Ser Gly Asp Gln Asp Ile Asn Val Val
515 520 525
Ser Thr Tyr Ile Ser Lys Met Lys Val Ile Tyr Pro Ala Val Glu Gly
530 535 540
Arg Ile Lys Phe Ser Thr Gly Ser His Cys His Gly Ser Phe Ser Leu
545 550 555 560
Ile Phe Leu Ser Leu Trp Ala Val Ile Phe Val Leu Tyr Gln
565 570
<210> 5
<211> 1770
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cagatgagga aagtgaagga gactgaggtt gcactgataa cctcagtgga tttaggtacc 60
gaggaagtaa aatgacctta gcagccaaac caagtgggcg actgcccaga gctggggtta 120
tgcaggaggc cgcacgagga agggacagac agggctttct gaagaaatct gctgtgactc 180
tgagggtggg aatatcatac agatggtact caacgccacc cctgctctac ctgaagtcct 240
gtgcacagag taaatccaga acctgctgag gtatcttgtt cacctcacca gcaagtcctt 300
ccttagtcta agctgctgtg gatggggctg tctgagagct tccttttaaa gtcttcgact 360
tggagaacga caaaagaatt ctaggacaag gcaggtgtac agtgtacact ttacaagtgt 420
aaagcagggc tgtagtagat tagtttatga ggaagaaagt tccattaaaa tgtaagcatg 480
ggagagaaca agtgcttagg aggagggtac acactcttgg gttcgggctg ctcaaaataa 540
gagatgtcct tgtcattgca acagccacac atactggttt tggtggcttc tgaagctgca 600
gctccaaagg tagctaagga aacttttccc ttttttggta aatgagatca tagggtggtt 660
cttatgtgca ctggctagga ttacagctgg cacggtaaaa ctcgagatca caggagctat 720
aggggaacat taagctatct ttactgtaaa caaagtttta gttttagttg ggagacttcc 780
agaaaatacc taggaaagga taaaagcaag ccttaagcac agttcattgc tattttaaca 840
tttctatttg ataacaaaaa ttttcctata taaaaggcct attgtccctc tgtctgcaac 900
cttcacagcc aactttgttc attgggctga aattcttgat tctcagctgg cagaaggctt 960
cctccagacg ccaaagcaag tgacttcttt ctctttccac gtacctgtaa tgttctcatg 1020
gctttctatc ctgctcgggg tacaggggtg atcaatgccc agtctaacag agacttctgt 1080
caggcctgat tcgcctagat gaattggaga agtccttgag tatagcagtt gtgaggactt 1140
gagatgtgac ccaagggaag caatgaaagg gggttctggg ggtgtctgca ttctggtctg 1200
ggcctgacct gtgggctaac tcccgaaaac aatgaagatg agctgggtag gccctggtaa 1260
aggtggtctg tgagccatct ggctggaggg ggctgggaca gggagtccca aatgcacaca 1320
ttcacagcag cttcactgga tgaggcgccc agggcaacaa tgctgtacct acctgtgatc 1380
tacgtgtctc tgggctcagc ccaaggggcc cctttggagg taaggagaac actagaacat 1440
gtatgtggtc aggtgtcata gaggccagcc cattttggtg ccactgggct aacatgatat 1500
actttaaaat atgcttttat tggaaaattc cagatactta attctttttt tttctttttt 1560
cttttctgtt ttacttaggc actgggaaat catgaatttg ataacggtgt ggaaggactg 1620
attgatcccc tcctcagaaa cgttaaattt ccaattctga gcgcaaacat taaggcacgg 1680
gggcctctag cacatcagat atctggactt tttctgccat ctaaagttct ctctgttggc 1740
ggtgaggttg tggggattgt tggatatact 1770
<210> 6
<211> 1133
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cacgaatggt cgatggctgt gtctccctta gtctgctgtt tggagaaact ctttttacac 60
tgggctttgc agacttccct cttgaaacct ctttatgaga cttttgcatt tgggacactt 120
tcattttagt gccggttctt agaaactaac ctgagagcat ctaggtcaac tggaggactg 180
ccttgcaata gagtgctggg tgagacttca ggacgccatg tcggtggtcc cctcgtgacc 240
actgaagact tgctaagttt gggctccagg cttggaggcc ttgtttatgt ctcagcatag 300
gattcccagg gcctatgcta cccagagccc aaggcactca ttattagcac tgggtgagct 360
ccatgaggtt cgcgaccctt cctagggcag gccatgttta gatgaggcct ctatgatgca 420
atgcagcaat cagttctact ccaatggtgc cacaccctgc ctgcaagtaa gcagttgtca 480
tctaccatgc taaaattagt ttccaagggc cagcaagatg gctctggggt aatgaagggg 540
actttccacc tcacctgata cctggagttc aaaccctgga acctacatgg taggaggaga 600
gatctgaaat ccctaagtat aaataaataa aaaaaacaaa taaataaaat gtaaaaacct 660
ccttttgaaa ttggctttca aaacctacat gttgacattt taggtctgaa gacattttag 720
gtttccaggc aaagcaatga cactggcagc cgttgtaaag accatgcctt tgtgctcaga 780
catgtttttc atggttagtg tgaaggccta aatgtaaaag gagctggaaa caaaccatac 840
ctgaagtctc tttgtagtat gagattcagt ttgtgcaaat atatcatcta tggcccagtg 900
agatggttca acagaaaatg atgcttgctg catcgcctga tgtcctgagt ttgatcccca 960
ggacccacat ggtggacaaa gagaaccaat tcttgaaaat tgtcctctga cctccacgca 1020
tgtattgtag tatgtatgtg caaacaaaaa taaatgttac tgtgatggtt tgtacatgct 1080
tggcccaggg aatggcacca ttagaaggtg tgaccttgtt ggagtaggtg tgc 1133
<210> 7
<211> 4354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cctttagtcc taataataag gtggcagaaa cagttggatc tctgtgttca aggctagcct 60
agtctgcata gagagttcct ggccggctaa ggtgcatagt aagatcctat tacaaaaata 120
aatgaatgag taaataaaag taaactacta ccgtagttgt gctggttagt tcttgccaac 180
ttaacacaaa cgagaatcac ctgagaagag gttcctcacg tgagcaggct ggactgtgcg 240
cacacatgtg ggacattttt ctgactggtg attgatgtga gagagcccag cccactgtag 300
gcggtgtcac ccatgggcag gtgggcctgg gtgacataag acaaacaagg cagtaaacag 360
cactcctctg tgtcctctcc atcagatttt ggtctggggt ttctgccctg actttgctca 420
gtgatacact gtcaactgga agaagcagca aatcctttcc tctccatgtt gtgctgtggt 480
cattgtgttt attacaataa atcaaaaaag agaaaaagac aagaaaacaa agtaaagcag 540
gctatgcttt tgccaagaaa acagccctcc caaaatgcac ttcacccaaa tactgccctc 600
tcccttctgt gtggtaattg cgacaatgcc tccctccttg cgcatggtat ttcagattct 660
aagggatggg gtaatgtgtc atacttttcc ttcctcaacg ctagtgttac caggcacgca 720
tgtggtcgct tcctcaacgg ctgactagct accctgagag ggcagaaaga aggccacagg 780
agtagggaag gcttatgcca gtgcttctgg cttggttgac tcaaattgtc cttctaggaa 840
gaacaatgtc cccagaactg ccattttggg gaaagggagc ctttggatct gacacttgag 900
gccacaggcc cagatgacaa gtctcagaga tagtttttcg ggtctggaaa gctagtggaa 960
aatggacaca tgacaactgt cacacagacc aaaagaaccc cacagatgtt tgaagtttgg 1020
agctgaagat gagggtgact aaagctattt ggtcctctat caagagcatt ggtgtccatg 1080
aacaggaatg ccctccccaa gggatacaaa atcaagatag tcacagcctg tactcaagtc 1140
agggtgggac ggaacaagat attgaagaag caacaaacaa aaacttgaac gttcaccata 1200
ccctaaggat agaacagaac tgatgagttg gttagtcttc cgtggaaaac tgtggatcca 1260
tgtgttgctg ttgtgcacgt ctgttcccag cattctagaa gctaatgcaa gactcagttc 1320
gaggccatcc tgagctacac agtgagaccc tgtctcaaaa aaaccccaaa acaagaaaca 1380
tccaccaaat acaaaactct gtacttaaga ttattacagg gctggagaga tggctcagtg 1440
gttaagagca ctgactgctc ttccagaggt cctgagttca attcccagca accacatggt 1500
ggctcataat catctgtggt gagatctgat gccctcttct ggagtgtctg aagatagcta 1560
caatgtactc ttataaataa aataaaaaaa tcttttttta aaaaattatt atataacaaa 1620
gggtaattta ttttaccata ggaagaaaac ttgatgtttt aagactagaa gaaagaaaaa 1680
caaatgtctg agactgagag accctttaga cctggatcag ctcttagaga agttaactag 1740
ctaggaggag gggagactgg gtatagcatc agaggtgggg aaaggtgtga gttcagcaac 1800
catgaacttt ccaggggaga cagggtggga ctgtggatag ctgcgtgctt cctagagagt 1860
tcactcagcc ctttgagtga caggtgctca gtcagcgcca gtgtgccaaa tgaggaaaca 1920
aggtgaacag gacaaaaagg ccaacataac ttgagagcac tcagtttagc ccggagacag 1980
acaacaaatg accccacaat atagttctgg aatgttctgg tgttacatga ctggtggtca 2040
tgtcccacca aagttttcta ggtttttgtc ttcttattaa aacgttctaa taaaggaact 2100
cagggataat aaaggaacaa caaggaaata gcattcagat ttctccctaa aagttcactt 2160
acgggacagt ttgccctatt caacatgtgc cccaaactag ctcaggccag attgcctccc 2220
taccctcata cctagacata actggagtat gactgaatag aaattgtttg atggttgttc 2280
aggagagaag gaacttaact ccattgtctg gagagagtgg tatgtgcagc tcagggaagg 2340
tggggtccta ggttgtcaag tgcattgttt ggagggtggt gtgtgcacat agtatgtgca 2400
gtaccaggct gccaagtgca gtgttagaag aggtgtatgt gcattgcaca agccaggttc 2460
attactaaac tatttgttgt gcttacttac ctgcctcact gggaagagga aacgaggtgg 2520
aggagaatgt accatggccc ttgttagcat caaggaccta gagccagtgc tgccaggcct 2580
ctctcagatg aggaaagtga aggagactga ggttgcactg ataacctcag tggatttagg 2640
taccgaggaa gtaaaatgac cttagcagcc aaaccaagtg ggcgactgcc cagagctggg 2700
gttatgcagg aggccgcacg aggaagggac agacagggct ttctgaagaa atctgctgtg 2760
actctgaggg tgggaatatc atacagatgg tactcaacgc cacccctgct ctacctgaag 2820
tcctgtgcac agagtaaatc cagaacctgc tgaggtatct tgttcacctc accagcaagt 2880
ccttccttag tctaagctgc tgtggatggg gctgtctgag agcttccttt taaagtcttc 2940
gacttggaga acgacaaaag aattctagga caaggcaggt gtacagtgta cactttacaa 3000
gtgtaaagca gggctgtagt agattagttt atgaggaaga aagttccatt aaaatgtaag 3060
catgggagag aacaagtgct taggaggagg gtacacactc ttgggttcgg gctgctcaaa 3120
ataagagatg tccttgtcat tgcaacagcc acacatactg gttttggtgg cttctgaagc 3180
tgcagctcca aaggtagcta aggaaacttt tccctttttt ggtaaatgag atcatagggt 3240
ggttcttatg tgcactggct aggattacag ctggcacggt aaaactcgag atcacaggag 3300
ctatagggga acattaagct atctttactg taaacaaagt tttagtttta gttgggagac 3360
ttccagaaaa tacctaggaa aggataaaag caagccttaa gcacagttca ttgctatttt 3420
aacatttcta tttgataaca aaaattttcc tatataaaag gcctattgtc cctctgtctg 3480
caaccttcac agccaacttt gttcattggg ctgaaattct tgattctcag ctggcagaag 3540
gcttcctcca gacgccaaag caagtgactt ctttctcttt ccacgtacct gtaatgttct 3600
catggctttc tatcctgctc ggggtacagg ggtgatcaat gcccagtcta acagagactt 3660
ctgtcaggcc tgattcgcct agatgaattg gagaagtcct tgagtatagc agttgtgagg 3720
acttgagatg tgacccaagg gaagcaatga aagggggttc tgggggtgtc tgcattctgg 3780
tctgggcctg acctgtgggc taactcccga aaacaatgaa gatgagctgg gtaggccctg 3840
gtaaaggtgg tctgtgagcc atctggctgg agggggctgg gacagggagt cccaaatgca 3900
cacattcaca gcagcttcac tggatgaggc gcccagggca acaatgctgt acctacctgt 3960
gatctacgtg tctctgggct cagcccaagg ggcccctttg gaggtaagga gaacactaga 4020
acatgtatgt ggtcaggtgt catagaggcc agcccatttt ggtgccactg ggctaacatg 4080
atatacttta aaatatgctt ttattggaaa attccagata cttaattctt tttttttctt 4140
ttttcttttc tgttttactt aggcactggg aaatcatgaa tttgataacg gtgtggaagg 4200
actgattgat cccctcctca gaaacgttaa atttccaatt ctgagcgcaa acattaaggc 4260
acgggggcct ctagcacatc agatatctgg actttttctg ccatctaaag ttctctctgt 4320
tggcggtgag gttgtgggga ttgttggata tact 4354
<210> 8
<211> 4567
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccagagccca aggcactcat tattagcact gggtgagctc catgaggttc gcgacccttc 60
ctagggcagg ccatgtttag atgaggcctc tatgatgcaa tgcagcaatc agttctactc 120
caatggtgcc acaccctgcc tgcaagtaag cagttgtcat ctaccatgct aaaattagtt 180
tccaagggcc agcaagatgg ctctggggta atgaagggga ctttccacct cacctgatac 240
ctggagttca aaccctggaa cctacatggt aggaggagag atctgaaatc cctaagtata 300
aataaataaa aaaaacaaat aaataaaatg taaaaacctc cttttgaaat tggctttcaa 360
aacctacatg ttgacatttt aggtctgaag acattttagg tttccaggca aagcaatgac 420
actggcagcc gttgtaaaga ccatgccttt gtgctcagac atgtttttca tggttagtgt 480
gaaggcctaa atgtaaaagg agctggaaac aaaccatacc tgaagtctct ttgtagtatg 540
agattcagtt tgtgcaaata tatcatctat ggcccagtga gatggttcaa cagaaaatga 600
tgcttgctgc atcgcctgat gtcctgagtt tgatccccag gacccacatg gtggacaaag 660
agaaccaatt cttgaaaatt gtcctctgac ctccacgcat gtattgtagt atgtatgtgc 720
aaacaaaaat aaatgttact gtgatggttt gtacatgctt ggcccaggga atggcaccat 780
tagaaggtgt gaccttgttg gagtaggtgt gccattgtgg atgtgggttt aagaccctca 840
ccctagctac ctgaaagtca gttttctgct agcagccttc agaagaagat gtagaactct 900
cagctctgcc tgcatcatgc atgcctagat gctgccaagt tcccaccttg atgataatgg 960
cctgaacctc tgaacctctg aacctgtagc cagccctaat taaatgttgt cctttataag 1020
acttgccatg gtcatagtat ctgtgcacag cagtaaaacc ctaagacagt tacatatata 1080
tatatattgg ttatatatgt gtatgtatat atacatatat atatgtatat gtgtatgtat 1140
atatacatat atatatatgt atatgtatat gtatatgtat atgtatatgt atatgtatat 1200
gtatatgtat atgtatatgt atatgtatag tttgtatgta ccatctacag ccttaaccca 1260
atgcaatatt aggtgaatgc aaccaagaac attgatttaa atttttcatg accactcaag 1320
cttttgtaca aaatgtattc atacattttg ctgttagtaa gtgaagagag ctttaacaag 1380
agattgtatt agtgtgttgg tatataaata gtacaatgaa attcttttaa tatccatttc 1440
attaatattc tttagggaca aatttagtct ttgaagatga aatctctgca ttgcagcctg 1500
aagtagataa actaaagacg ctaaatgtga ataagatcat cgccctgggg cactctggtt 1560
ttgagatgga caaacttatc gctcagaaag ttcgaggtgt ggacatcgtg gtgggaggac 1620
actccaacac ctttctctac acaggtaatt gttttgatgc gttctgcaag ctaggatgtt 1680
cattcagtgt gcagtatatg atgtattagc tgtaatatgc aggattatgt gttatacttt 1740
gcattagatg aggacaggta atcctgctgg gagacgttcc aagaattcat tcatgtcatg 1800
attaaaagtc tacactacaa gcacatagca cacataatga aactaaaaaa attattgatc 1860
tccagacaaa ggtcagccaa cggtagaatt tttaaaagat gaaatttttt tttagatatt 1920
ttcagtggtt cttggacctg aatccagacc tttctgtatt ttaaacacct atattcccag 1980
cttttggttt tctaagacag agtttcacta tctagccctg attggcccca ttctcccacc 2040
tctcaggaga atggtaggac tataagcata cacctctgta tctggtttgg aaagtttcat 2100
catcatcatc attttcatag aacttcttag aatttttaaa tgctgaatat atattacatt 2160
tggaatcagg aagtgagata cagtacaaat tatagaaaga aaagaaacac gatattgagt 2220
caaagtcctc attcctaact cacttgaatg accttgaaca ggcaagtcac ctgaccctct 2280
gggcactttg gctttctaat aagaagtctg tcaccgtttt gaagattaag agtctgggaa 2340
cagttgactt cactggtttg gccttgggtg aatgtccccc tggctcttca tcatatcaca 2400
acatgggaga gaatcaggaa gggacatgta cagggagccc aggtgtgtgt ggtggccctc 2460
ctgttacaac cactccctca catagaacta actgtggtct caaaagaact actctcctct 2520
gagggtgcta gctccagtga ccttgtcacc tcacattaga cactccttga aggtttcacc 2580
gtccctcagt gtcaccacag tgaggactaa taagctgcta acacatgaac acacactaga 2640
caaaccacat ccaagacaca acagtttcag gtgagtcttc atacttgcct ggtcttatta 2700
caattctaca gcaatcctgt ggatatgacc tattcaaact ctgggggctt tgtagctctt 2760
ccccaaggga gttttagaag gctacaacac acagcagaaa ccagttgatg ctcctgccac 2820
ttcacccttt atgttggctt gagccacagt tagcatgaca ttttacaaga ggatctaaca 2880
ggtatacgtg tacagacttg tgcactctca gagatatgta taaagtaaac cgaaaatccc 2940
caaagcaccc agactatcct gcttgtattg ttgttgttct tcagtttctt ttcttgttat 3000
tttgtttctt tttaccttga gacaggatct tatattgttt gtttcatttt tatggagaca 3060
gagtctcact ttgctttgta gtcctggctg acaacgttat atgttgactt aaccttgact 3120
gtaaggtccc ccttctactg gtatgacagg aagcactaat gtcacaagaa taccatcaca 3180
cacacacaca cacacacaca cacacacaca gagccacccc ttactccaga tgatgcaatc 3240
acccccccct ttgtcacttt gatgtttctt taccatctgt gccactttgt ggcatcattt 3300
gggcacccac agtctgctgc accgtgtggc tactgattac ggcaccctgc tagcccaaga 3360
agctggaggg aatggtgatt atccttttgc tcttacaact attgccccag ccagcaagtc 3420
ctgcaacatg agagatctga gggtgagctg tagcttgctc atctcctgaa tccagtctct 3480
taaacgctga cccgagtcta agtcatttgt ttcacatttc ataatagatt accaagatta 3540
aacttgctcc catgaaaatg tgttttggct ctcttttgag gactaaatat agcaattaaa 3600
ggacatgata tgaaatgaga cctactcatg tatttaaaca aatttttgcc agccttaaaa 3660
aaaaaatttt ttttcagaca ggctgacaag aaaactcagc agataaaggt acttgctgta 3720
ctagcctaga gacctgagtc tgaacccata taagggcaga aggagagaaa ctaaagccca 3780
aaagttagtt gtcctctgac ctcatgtgta ccacagcata tcctcatatt tattctgtct 3840
ctctctctct cacttactca ctctctctct ctctctcact tactcactct ctctttctct 3900
ctcacataca cacacaaaca cacacacacc acacacactg aaaaaaactt aagcaatctt 3960
ttactaaacc attttatgaa attaccaaga agcaacaaga gagagagaga gagagagaga 4020
gagagagaga gagagagaga gagagagaga gaagaaagga aaggaaagga agaaaagaga 4080
agagaagaga agagaagaga agaaaagaaa agaaaagaaa agaaaagaaa agaaaagaaa 4140
agaaaagaaa agaaattacc aagaagctaa attaagtctg ttaaacatta catagtaaat 4200
gtagtaaaaa gaacacagct tgtggaagca tacatccttt tgtgttttaa gtccagatct 4260
tattgtctga tctggaattt actctgtagc ccaggctaga ctcaaatcat ggcagtcttt 4320
ctatgtaagc ctctgtagag ctgggaatag tggcatgagc catcatgctc agctagaaat 4380
ttaaagttta agaaatgtct cagcatgtga catgcacaca gcccaaagga aaacgtccct 4440
gaagcacctg aatagcacct gatagactct ggtcttttat ttagtctttt gtgtgtatta 4500
ctgcccacta aattagttcc cttcttgtct tgtttgttgt ttatttgtaa cccacattct 4560
aaaaacc 4567
<210> 9
<211> 1725
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgtgtcccc gagccgcgcg ggcgcccgcg acgctactcc tcgccctggg cgcggtgctg 60
tggcctgcgg ctggcgcctg ggagcttacg attttgcaca ccaacgacgt gcacagccgg 120
ctggagcaga ccagcgagga ctccagcaag tgcgtcaacg ccagccgctg catgggtggc 180
gtggctcggc tcttcaccaa ggttcagcag atccgccgcg ccgaacccaa cgtgctgctg 240
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggcagtgttg gggtaggtta tggagagaga agaaaaatgt ctggaagccc gggagcctgg 60
catggctgtc ctctgagagg ccctactgat tgagcatctg actgagacag aatcagatgc 120
ttacacccaa ccattgggct gaagttgggg atccctatga ttgaattagg ggaaggattg 180
aagaagctga aggggagggc aaccctatag gaagaccaac agtttcaact aaaccagacc 240
agaccccaag gagctcccag agactgagcc accaacaagg cagcatacac cagcaggtca 300
aagatccacc ctggcacata tgtagcagag gtctacctag tctggcctca gtgggagaag 360
atttgcttga tccttgagag acttgagacc ccaggaaagg aggaggccgg gtgcagtgca 420
ggggaagcac tctttcagag tcaaggagga agagggggaa tgggatgagg aactgtggga 480
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<210> 16
<211> 4951
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aagtggcatc caaattttct tgctcaacct aaaaccacac ttaacatttt tattttagct 60
aacaaaatgt ggattattta tggtgtataa catggtgttt taagatgtgt accaacactg 120
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<210> 17
<211> 45928
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
atgtgtcccc gagccgcgcg ggcgcccgcg acgctactcc tcgccctggg cgcggtgctg 60
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ctatttttgc tatagttact cattgagcag acttatgaaa tctccccaca gcacaaaact 3420
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tgctcctaaa tgggggaggc agcagccagg gtgggaacca tggcccccgc ctttaactca 3660
cccaggggac aggttagtca gatagatggt cctttgttcg ccaccctcca cctcccacat 3720
agacaacatt ctaatgtgtt tgatggactg catatagttt tgtttctaca tgcactttca 3780
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ttacccatct gctccctggc tgatgggttt ggagatggcg tctaacaccc tgcctccaca 4020
aataatgctg ctccagatat cttcctggat ggtctcacca gatgatttct acccaggagc 4080
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gcagtttgtg tgtatgtgtg tgtttgtgct tttgtatgct aatgagatga tctatggctg 5820
ggggccctta gatagcttcg ggaagggggc tggtcgccag aaagactaat ttatgactag 5880
agggttagaa ctttcagccc tacctctccc acttctagag ggtagatggg ctacagattg 5940
agttcggtct ccaacagcca gtgaattaat caatcatgcc ttcacgataa accttcatga 6000
agacccctaa acaaccagat tcagagagct tccaagttgg tgaacatatt gaggtgctgg 6060
gaaggtggtg cacatggagt gggcatggaa gctttgccca tccactccca tgccttgccc 6120
tgtgcatctc ttcacttgct tgttccctag tcgtatgctt tataataagc cagtaaagtg 6180
ctttccaagt tctgtgactc gttctagcca attatcaatc ccaaggatag ggtcatggga 6240
acctccaatt tataactagt tggttgggaa tacaggtggc ccaggactct cgactggtgt 6300
ctgaagtggg ggcagtcttg tgcatttgag ccttctcact tgtgggatct gatgctaagt 6360
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ttggaagatg agcagaaaag ggtgggaggg agaagacaag agagaagagg gtgaggaaag 6540
aggccaggca gcagtccaag tgtgagatga taacacctga actctggtaa ttgaggagac 6600
caaatccacg ggaaccagct gcaaaaggca ttctgtctgg taggtatagg gctaagggag 6660
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ggagcaggtt atttaatctc atgaaacctc catttccaca tgtgtgaggt atgtgattgt 6780
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ctctggtagt aacagaaatg atggcctggg gaatgggaag agtatgagcc cagttttgag 7560
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gactgggtaa gatctataaa ggagagaggt taaacagcaa agcaaaagtg actgaaattc 7800
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cacaattact ttatcttcag tcatgaagcc tttcttgagg aaagaaaaat tagcaatact 8040
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cttcaggcag gggagggagg aagtaaaggt agtttctcag ctcatcttgt cctcgtacta 8340
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ttagtgttag ttcttagaaa tcagtgtaag aacgtctgga tctactggag gactccctag 19980
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tggccgattc tcgtaacagg tccatgtgtg taatcaacat gtgctgaagt tctctggacc 34020
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agtaatgggg tcaaatgaat ctgtcccata gtctctaatt tgaaacagct gaactgtgcc 34140
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<210> 18
<211> 48382
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
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ctggagcaga ccagcgagga ctccagcaag tgcgtcaacg ccagccgctg catgggtggc 180
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ctggacgccg gcgaccagta ccagggcact atctggttca ccgtgtacaa gggcgccgag 300
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cccactatga gatgggagta tttagaggag caggacccag tcctgcctgc gaggggctta 600
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ttaacaggca ccatccccgc aaaaagggag acgtgataag aatggacacc agatctcttt 840
gaccccggag cttgagagta attaagctca cagctttggg gtagattctc tgttcaatta 900
ccttctatgt gaccttgagc aagttattta ctctttcttg cctcagttct atcctgtata 960
aaaataagga ttataattgt acatagtgca catagtgtgg tctctatatt attaccagac 1020
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cactcagtaa tgacaaaata aatatttgta gaattgagtt gttgctaccc tgtgtctcca 2040
cttcctccca gaagggtaga ataaacttac atgtgtttgt tttattttgc atataaacca 2100
cgactttgta aactttactt tttgtgacac tcttttctcc acaattgtgt gaaccctttt 2160
tagtggaaaa ataagaatga agaattccta gttttcccta ataatatttc cctcttgtaa 2220
gtctagttga gctcctggtg ttaatcatgg tatcaaatgt ttatgacagg acatctaggt 2280
gaggcctgag taaactgctg taagttacag cctatctctt ctgtgtttgt tcagaatcct 2340
ttttgttgga tgaaattact ttctttcaaa ttttgctcaa gaaaattgaa ttgggttctg 2400
aggaaaaata ggctacttac gtaatgttgg cagggggtaa agattgggag cggatcacat 2460
ggcaaggtta gatggctgtg tcctcaggac ttactctgtg cagtttgggg gtgtgtcaaa 2520
catgatttga cgtgcataaa atcccagttc tgtagtgcta aagcatgtgc taaagctctg 2580
ctgtactcca gtattgcaca gatgtttcac tgtcaattgt ttatattata ctaaccctca 2640
gagaatttat tgctgttgtg gtataaacgt tcctccactg taaccactca ccgcatattg 2700
attcctagga cactggggat tcaaatcagg gtggaaaaca gttgtggagg ggcatctcca 2760
gtttcctgga gactggacct agttcaaagg agccacataa aaggactgaa gcatatggag 2820
gacaaagagg aatttcctag aatccagcta aaacacagga gtcccctcga gcaggaactt 2880
ccaaggaggt gtacactttc tagacctact ggagtaatcc tgattgctgt agaggaccca 2940
gggcaatcct ggagaccccc tggaaccact actaggcaga aaactgggaa gaggatggca 3000
aaactctcca gttagtgtag ctgtctcagt ggaaggactg ttgtcccctg aggcacgagg 3060
aagacagcat ggaagcactg acagtatgcg cttggcctgg ttactttctc tgagcttcat 3120
gttccttagc tgtaaaacag gagtgataac ccccatcttg cagaggtttt gtgaggaata 3180
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gaggggaatt gtgaggaagg gaaggtttgg gttgtgcatc agattatctg attctcacag 3300
cctggcacag tctaccacct gcctgccctc taccatctta cctaagtacc attgcctaaa 3360
ctatttttgc tatagttact cattgagcag acttatgaaa tctccccaca gcacaaaact 3420
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tgagcaggtc tctagggtcc cctagaaagg tgccttttct ctgcttggct gctgcttctg 3540
aggccctggc tgctgagccc acttcctgcc cataaggctg cagccttagc cctagccaat 3600
tgctcctaaa tgggggaggc agcagccagg gtgggaacca tggcccccgc ctttaactca 3660
cccaggggac aggttagtca gatagatggt cctttgttcg ccaccctcca cctcccacat 3720
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aaacctttgt gtgcttatat tttataatgg catacccagt cctgttattt agccctttct 3840
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ttacccatct gctccctggc tgatgggttt ggagatggcg tctaacaccc tgcctccaca 4020
aataatgctg ctccagatat cttcctggat ggtctcacca gatgatttct acccaggagc 4080
agaattgctg gccacagggc atactttgag tactacaaga ctggtttcct caatgactga 4140
catcctccat tctcttccac ctactcccat ccccaaacag gacatgtaaa tttctatatt 4200
ttacctatat atcatggcag tatccagctt tattgtaggt gtaaaataca cattgctgct 4260
ttatcatgta cttttctaat aactagtgag tttggacatt ttttgatatg tttgttaact 4320
ttttaagctt cctcttctct aattgcttat tcatattctt tggtattttt taaattgggt 4380
tagctttata ttttttgact ttcaggagtt ataggttttg atctgtgatc aattttagac 4440
attgcaaata tattatgatg atattaggtc tattaatttt gtccatggta tctttcattg 4500
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gaaattcaga gatcaccacg gttctctctg ccttttaaga gataaatcta caatctgtgg 4680
ctatgcaatt cacttctcag catcaccagt tcctcatcta taaaatagaa gtttgaacca 4740
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attcagtgaa gggacaggag gatggggcaa aggtgtagag gcaggaatct acacaatgga 4860
ccaggttgga ccagagtgag gtagcaggaa tcatggcaga agaggttgtg taaactctaa 4920
aggccacctg agaagtttga gttatgttgc catgggcagc catgtggttt ctgcgtagaa 4980
gaccactgtg gtataataaa aaataaatat ttggtccttg tccccagtac ctgtcacaga 5040
gttcctaaaa ccctagaaat ttcctaagta atagaaatgt cctttgtgat tcataataaa 5100
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attgaattca attataggac actcagtttg tgttttctgg agtactgttt ggtgtctggg 5700
ggaaatccca cacacatctg gtcacagaag tattctgtgt tcagtgtgac agtagaaaaa 5760
gcagtttgtg tgtatgtgtg tgtttgtgct tttgtatgct aatgagatga tctatggctg 5820
ggggccctta gatagcttcg ggaagggggc tggtcgccag aaagactaat ttatgactag 5880
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agttcggtct ccaacagcca gtgaattaat caatcatgcc ttcacgataa accttcatga 6000
agacccctaa acaaccagat tcagagagct tccaagttgg tgaacatatt gaggtgctgg 6060
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ctttccaagt tctgtgactc gttctagcca attatcaatc ccaaggatag ggtcatggga 6240
acctccaatt tataactagt tggttgggaa tacaggtggc ccaggactct cgactggtgt 6300
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ccaggtagag aatgtcagaa tgcatctgaa ttgttggaca ccaagttggt gtccacacag 6420
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aggccaggca gcagtccaag tgtgagatga taacacctga actctggtaa ttgaggagac 6600
caaatccacg ggaaccagct gcaaaaggca ttctgtctgg taggtatagg gctaagggag 6660
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ggagcaggtt atttaatctc atgaaacctc catttccaca tgtgtgaggt atgtgattgt 6780
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cttggtttgt ctctggacaa gtctaagttt gcatgacaac tctctaattt ctccttcaca 7380
gttatttatt tattttttgg cagctatttc cttgtggaga gatagcgtag gtctttcagg 7440
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ctctggtagt aacagaaatg atggcctggg gaatgggaag agtatgagcc cagttttgag 7560
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atgccaggct ctctgctaag tgctgaggat agcgatcagg acctgctagg gtgaaaatta 7680
ctcttcagaa gatagcagag tggataatgg ccattcgagt tcctcttaac tacacagagg 7740
gactgggtaa gatctataaa ggagagaggt taaacagcaa agcaaaagtg actgaaattc 7800
taacacccat gcatggggat tcttgagcta aagatctggt ctgtagaaga agacacatca 7860
gaccctcata tttagcatct aagccgaaat cagcagtaag catgtttctt ctcccataaa 7920
aacttgtccc taagaagaga gacaagtgct tacaaggact cttatgttaa aggaaactgt 7980
cacaattact ttatcttcag tcatgaagcc tttcttgagg aaagaaaaat tagcaatact 8040
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aaccaaaaaa gtaattattc ctaaagctca ggtgtcagaa gttgtgaatg tctagggggt 8160
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tattggcggc tttctgcaca tcactcacaa atacatctga atgctctgta ctctccagtg 8460
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agatatagtt gaaccttcct ggacctcaat tagttgggca gttaattctg aatgttgatg 8640
tgcctatttt gcacgtatgg agagtttgta cgtcccccct ccccaaacaa gtagaatgct 8700
gtctatttgg tacttgctca ttcatacatt ctttcaacaa ccaaacccag ttgcagctgg 8760
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gtgattggca actgagcccc gtcatatagt aaatcaggct gtctctcttt aaaaaagaga 9000
gacagagaga gagagagtct cccaatgttg cctaggctgg tctcaaactc ctgggctcaa 9060
gcaatcatcc cttcttgcct cccaaaatgc tgggattaca ggcatgagcc accatgccca 9120
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gcatcctaca ctgcttttaa agaaactctg ctatcctttg ttttaccgtc taacatttct 9360
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catatgaatc aacgatcaaa gaatgaagat attctgaatc caagtttctt gttttgatta 9780
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accttatttg gaaattactt caggtaatta tgaagtaata atatctctat tcatatgcta 9960
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acccaagttg aaatgcaaac aaatgcatga tatcattatg tgaccctccc ctagccctta 10080
ccctgtccat ggcagatgct aagaaaaact tgtccctaag aagagagaag tcaattgatt 10140
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caaggagtta ctgtcaatca actagagatg gcgctcaaga taaaattatt ttccatcctg 10260
tactaatata ataataagca tggaatctat ttattggttt tttcacaaca ataaaatata 10320
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ttagcagtca cactgaaact ctgctgcatg accacactgt cctgaggcca tgtgccaact 10500
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gagatggtgg ttaacacagg aaccaggatg gaggcctcag acttgaccct ggcctgcagg 10740
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aaataatatg cattagttga tccctataac cacttaaaat gtatctaaca caggagaaat 10980
ctttggtaaa tatttactga atgaatgaac aaataaataa ttggagggag ggagaaagag 11040
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aagaattaga ggaccacagg agtgcttggg aagaagcaat tgtggcaacc taggtgaatg 16440
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ggaagtttta agcacactgt ctcatttgat atccacaact tatttttggt aggaaagaga 44280
gatgtttttc ccacctgtca gatgaaaaaa ctgaagctca aaaagggttg acttgaccat 44340
acagctaatg ctgacagatc caagacctag acctaggtct tttgaactca agtccagcat 44400
tctcaactat atcaagttac tgttcagaat acttaatatc tcctctcttc ataattatca 44460
atagccccaa gctcatggat gacaaatctc tgctttattt cttgtctcta ttttttcact 44520
ttatagctcc tgttataata gcaagtttaa tggtataaac acaggatacc atcctctctt 44580
gcaacaccca tgtgcctttg atgagtcagg tagcaagctg tagtagataa tgagaaaggc 44640
cagaggctgc aaaagacagt caaaggacac gagagaaagg aaggggaaga acaggactcc 44700
aggactgttt tatattatag aaaagcaaga gctaaagagc atttacacat gttaaacaga 44760
tacttgttaa gcatagtgcc tgacacacgg cattagctgt tattttatga gattccatca 44820
gctctgcctc tgtcctcttt cttctaacat gaaggtatca tgagaagaga accttctaac 44880
ataagctgta attctaaacc tgcacttgtc cctctccagc aagaggctag cactgaattc 44940
attctactca tactacacac ccagttatgg aatgtccaga gttctcgaag aaaataaatg 45000
actttaggaa gaggtataca ttttttaagt cgctctgcct ccaaatctga acagtcactg 45060
taaatcattc ttaagcccag atatgagaac ttctgctgga aagtgggacc ctctgagtgg 45120
gtggtcagaa aatacccatg ctgatgaaat gacctatgcc caaagaacaa atacttaacg 45180
tgggagtgga accacatgag cctgctcagc tctgcataag taattcaaga aatgggaggc 45240
ttcaccttaa aaacagtgtg caaatggcag ctagaggttt tgataggaag tatgtttgtt 45300
tcttagtgtt tacaaatatt aagtactctt gatacaaaat atacttttaa acttcataac 45360
ctttttataa aagttgttgc agcaaaataa tagcctcggt tctatgcata tatggattag 45420
ctataaaaaa tgtcaataag attgtacaag gaaaattaga gaaagtcaca tttagggttt 45480
attttttaca cttggccagt aaaatagggt aaatcctatt agaatttttt aaagaacttt 45540
ttttaagttt cctaaatctg tgtgtgtatt gtgaagtggt ataagaaatg actttgaacc 45600
actttgcaat tgtagattcc caacaataaa attgaagata agctctttgg tctttgatag 45660
ttatttcttc tctcattcaa acacctgcca actaaagaca atatgactga aggaaaactc 45720
tgacagattt tcactggtat catttctctt gatcataagc cacttaccat ctgataaccc 45780
tccatagccc ctcacacccc taaaatgaga agaaaaatgc atccaatttt taagtaggag 45840
agaaaagtga gtggtatttt aaggaagact actaaatttg gtggctttga tatacagaat 45900
ctgatataaa aatggttttg aggccagtat aacttcgtat aatgtatgct atacgaagtt 45960
ataggtctga agaggagttt acgtccagcc aagctagcgg ctccggtgcc cgtcagtggg 46020
cagagcgcac atcgcccaca gtccccgaga agttgggggg aggggtcggc aattgaaccg 46080
gtgcctagag aaggtggcgc ggggtaaact gggaaagtga tgtcgtgtac tggctccgcc 46140
tttttcccga gggtggggga gaaccgtata taagtgcagt agtcgccgtg aacgttcttt 46200
ttcgcaacgg gtttgccgcc agaacacagg taagtgccgt gtgtggttcc cgcgggcctg 46260
gcctctttac gggttatggc ccttgcgtgc cttgaattac ttccacctgg ctccagtacg 46320
tgattcttga tcccgagctg gagccagggg cgggccttgc gctttaggag ccccttcgcc 46380
tcgtgcttga gttgaggcct ggcctgggcg ctggggccgc cgcgtgcgaa tctggtggca 46440
ccttcgcgcc tgtctcgctg ctttcgataa gtctctagcc atttaaaatt tttgatgacc 46500
tgctgcgacg ctttttttct ggcaagatag tcttgtaaat gcgggccagg atctgcacac 46560
tggtatttcg gtttttgggg ccgcgggcgg cgacggggcc cgtgcgtccc agcgcacatg 46620
ttcggcgagg cggggcctgc gagcgcggcc accgagaatc ggacgggggt agtctcaagc 46680
tggccggcct gctctggtgc ctggcctcgc gccgccgtgt atcgccccgc cctgggcggc 46740
aaggctggcc cggtcggcac cagttgcgtg agcggaaaga tggccgcttc ccggccctgc 46800
tccagggggc tcaaaatgga ggacgcggcg ctcgggagag cgggcgggtg agtcacccac 46860
acaaaggaaa ggggcctttc cgtcctcagc cgtcgcttca tgtgactcca cggagtaccg 46920
ggcgccgtcc aggcacctcg attagttctg gagcttttgg agtacgtcgt ctttaggttg 46980
gggggagggg ttttatgcga tggagtttcc ccacactgag tgggtggaga ctgaagttag 47040
gccagcttgg cacttgatgt aattctcctt ggaatttgcc ctttttgagt ttggatcttg 47100
gttcattctc aagcctcaga cagtggttca aagttttttt cttccatttc aggtgtcgtg 47160
agcggccgga agcttcacga ggccgccacc cccggggttg acaattaatc atcggcatag 47220
tatatcggca tagtataata cgacaaggtg aggaactaaa ccatgggatc ggccattgaa 47280
caagatggat tgcacgcagg ttctccggcc gcttgggtgg agaggctatt cggctatgac 47340
tgggcacaac agacaatcgg ctgctctgat gccgccgtgt tccggctgtc agcgcagggg 47400
cgcccggttc tttttgtcaa gaccgacctg tccggtgccc tgaatgaact gcaggacgag 47460
gcagcgcggc tatcgtggct ggccacgacg ggcgttcctt gcgcagctgt gctcgacgtt 47520
gtcactgaag cgggaaggga ctggctgcta ttgggcgaag tgccggggca ggatctcctg 47580
tcatctcacc ttgctcctgc cgagaaagta tccatcatgg ctgatgcaat gcggcggctg 47640
catacgcttg atccggctac ctgcccattc gaccaccaag cgaaacatcg catcgagcga 47700
gcacgtactc ggatggaagc cggtcttgtc gatcaggatg atctggacga agagcatcag 47760
gggctcgcgc cagccgaact gttcgccagg ctcaaggcgc gcatgcccga cggcgatgat 47820
ctcgtcgtga cccatggcga tgcctgcttg ccgaatatca tggtggaaaa tggccgcttt 47880
tctggattca tcgactgtgg ccggctgggt gtggcggacc gctatcagga catagcgttg 47940
gctacccgtg atattgctga agagcttggc ggcgaatggg ctgaccgctt cctcgtgctt 48000
tacggtatcg ccgctcccga ttcgcagcgc atcgccttct atcgccttct tgacgagttc 48060
ttctgagggg atcaattctc tagagctcgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc 48120
cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc 48180
actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct 48240
attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg 48300
catgctgggg atgcggtggg ctctatggct tctgaggcgg aaagaaccag ctggggctcg 48360
actagagctt gcggaaccct tc 48382
<210> 19
<211> 3582
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
agtttagtag aggccccggt ggccggtgct cactgggctc agggccagtc cacccgctca 60
acgcgctcta gccagccatg tgtccccgag ccgcgcgggc gcccgcgacg ctactcctcg 120
ccctgggcgc ggtgctgtgg cctgcggctg gcgcctggga gcttacgatt ttgcacacca 180
acgacgtgca cagccggctg gagcagacca gcgaggactc cagcaagtgc gtcaacgcca 240
gccgctgcat gggtggcgtg gctcggctct tcaccaaggt tcagcagatc cgccgcgccg 300
aacccaacgt gctgctgctg gacgccggcg accagtacca gggcactatc tggttcaccg 360
tgtacaaggg cgccgaggtg gcgcacttca tgaacgccct gcgctacgat gccatggcac 420
tgggaaatca tgaatttgat aatggtgtgg aaggactgat cgagccactc ctcaaagagg 480
ccaaatttcc aattctgagt gcaaacatta aagcaaaggg gccactagca tctcaaatat 540
caggacttta tttgccatat aaagttcttc ctgttggtga tgaagttgtg ggaatcgttg 600
gatacacttc caaagaaacc ccttttctct caaatccagg gacaaattta gtgtttgaag 660
atgaaatcac tgcattacaa cctgaagtag ataagttaaa aactctaaat gtgaacaaaa 720
ttattgcact gggacattcg ggttttgaaa tggataaact catcgctcag aaagtgaggg 780
gtgtggacgt cgtggtggga ggacactcca acacatttct ttacacaggc aatccacctt 840
ccaaagaggt gcctgctggg aagtacccat tcatagtcac ttctgatgat gggcggaagg 900
ttcctgtagt ccaggcctat gcttttggca aatacctagg ctatctgaag atcgagtttg 960
atgaaagagg aaacgtcatc tcttcccatg gaaatcccat tcttctaaac agcagcattc 1020
ctgaagatcc aagcataaaa gcagacatta acaaatggag gataaaattg gataattatt 1080
ctacccagga attagggaaa acaattgtct atctggatgg ctcctctcaa tcatgccgct 1140
ttagagaatg caacatgggc aacctgattt gtgatgcaat gattaacaac aacctgagac 1200
acacggatga aatgttctgg aaccacgtat ccatgtgcat tttaaatgga ggtggtatcc 1260
ggtcgcccat tgatgaacgc aacaatggca caattacctg ggagaacctg gctgctgtat 1320
tgccctttgg aggcacattt gacctagtcc agttaaaagg ttccaccctg aagaaggcct 1380
ttgagcatag cgtgcaccgc tacggccagt ccactggaga gttcctgcag gtgggcggaa 1440
tccatgtggt gtatgatctt tcccgaaaac ctggagacag agtagtcaaa ttagatgttc 1500
tttgcaccaa gtgtcgagtg cccagttatg accctctcaa aatggacgag gtatataagg 1560
tgatcctccc aaacttcctg gccaatggtg gagatgggtt ccagatgata aaagatgaat 1620
tattaagaca tgactctggt gaccaagata tcaacgtggt ttctacatat atctccaaaa 1680
tgaaagtaat ttatccagca gttgaaggtc ggatcaagtt ttccacagga agtcactgcc 1740
atggaagctt ttctttaata tttctttcac tttgggcagt gatctttgtt ttataccaat 1800
agccaaaaat tctccttgcc tttaatgtgt gaaactgcat tttttcaagt gagattcaaa 1860
tctgcctttt aggacctggc tttgtgacag caaaaaccat ctttacaggc tcctagaagc 1920
tgaaggttag agcattataa aatgaagaga cagacatgat tactcagggt cagcaaccta 1980
gtgagttaga aaaaaaatta acatagggcc ctataaggag aaagccaact atgttaagtt 2040
tacgtgtcca aattttaatg aaattttact aacaatttta aaccatattt ttcttcttca 2100
tatccatttc taatccatca aacagcttat gtttacataa aattttatca ttcacaagga 2160
agttttaagc acactgtctc atttgatatc cacaacttat ttttggtagg aaagagagat 2220
gtttttccca cctgtcagat gaaaaaactg aagctcaaaa agggttgact tgaccataca 2280
gctaatgctg acagatccaa gacctagacc taggtctttt gaactcaagt ccagcattct 2340
caactatatc aagttactgt tcagaatact taatatctcc tctcttcata attatcaata 2400
gccccaagct catggatgac aaatctctgc tttatttctt gtctctattt tttcacttta 2460
tagctcctgt tataatagca agtttaatgg tataaacaca ggataccatc ctctcttgca 2520
acacccatgt gcctttgatg agtcaggtag caagctgtag tagataatga gaaaggccag 2580
aggctgcaaa agacagtcaa aggacacgag agaaaggaag gggaagaaca ggactccagg 2640
actgttttat attatagaaa agcaagagct aaagagcatt tacacatgtt aaacagatac 2700
ttgttaagca tagtgcctga cacacggcat tagctgttat tttatgagat tccatcagct 2760
ctgcctctgt cctctttctt ctaacatgaa ggtatcatga gaagagaacc ttctaacata 2820
agctgtaatt ctaaacctgc acttgtccct ctccagcaag aggctagcac tgaattcatt 2880
ctactcatac tacacaccca gttatggaat gtccagagtt ctcgaagaaa ataaatgact 2940
ttaggaagag gtatacattt tttaagtcgc tctgcctcca aatctgaaca gtcactgtaa 3000
atcattctta agcccagata tgagaacttc tgctggaaag tgggaccctc tgagtgggtg 3060
gtcagaaaat acccatgctg atgaaatgac ctatgcccaa agaacaaata cttaacgtgg 3120
gagtggaacc acatgagcct gctcagctct gcataagtaa ttcaagaaat gggaggcttc 3180
accttaaaaa cagtgtgcaa atggcagcta gaggttttga taggaagtat gtttgtttct 3240
tagtgtttac aaatattaag tactcttgat acaaaatata cttttaaact tcataacctt 3300
tttataaaag ttgttgcagc aaaataatag cctcggttct atgcatatat ggattagcta 3360
taaaaaatgt caataagatt gtacaaggaa aattagagaa agtcacattt agggtttatt 3420
ttttacactt ggccagtaaa atagggtaaa tcctattaga attttttaaa gaactttttt 3480
taagtttcct aaatctgtgt gtgtattgtg aagtggtata agaaatgact ttgaaccact 3540
ttgcaattgt agattcccaa caataaaatt gaagataagc tc 3582
<210> 20
<211> 1349
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
attaagggtt ccggatcctc ggggacacca aatatggcga tctcggcctt ttcgtttctt 60
ggagctggga catgtttgcc atcgatccat ctaccaccag aacggccgtt agatctgctg 120
ccaccgttgt ttccaccgaa gaaaccaccg ttgccgtaac caccacgacg gttgttgcta 180
aagaagctgc caccgccacg gccaccgttg tagccgccgt tgttgttatt gtagttgctc 240
atgttatttc tggcacttct tggttttcct cttaagtgag gaggaacata accattctcg 300
ttgttgtcgt tgatgcttaa attttgcact tgttcgctca gttcagccat aatatgaaat 360
gcttttcttg ttgttcttac ggaataccac ttgccaccta tcaccacaac taactttttc 420
ccgttcctcc atctctttta tatttttttt ctcgagggat ctttgtgaag gaaccttact 480
tctgtggtgt gacataattg gacaaactac ctacagagat ttaaagctct aaggtaaata 540
taaaattttt aagtgtataa tgtgttaaac tactgattct aattgtttgt gtattttaga 600
ttccaaccta tggaactgat gaatgggagc agtggtggaa tgcctttaat gaggaaaacc 660
tgttttgctc agaagaaatg ccatctagtg atgatgaggc tactgctgac tctcaacatt 720
ctactcctcc aaaaaagaag agaaaggtag aagaccccaa ggactttcct tcagaattgc 780
taagtttttt gagtcatgct gtgtttagta atagaactct tgcttgcttt gctatttaca 840
ccacaaagga aaaagctgca ctgctataca agaaaattat ggaaaaatat tctgtaacct 900
ttataagtag gcataacagt tataatcata acatactgtt ttttcttact ccacacaggc 960
atagagtgtc tgctattaat aactatgctc aaaaattgtg tacctttagc tttttaattt 1020
gtaaaggggt taataaggaa tatttgatgt atagtgcctt gactagagat cataatcagc 1080
cataccacat ttgtagaggt tttacttgct ttaaaaaacc tcccacacct ccccctgaac 1140
ctgaaacata aaatgaatgc aattgttgtt gttaacttgt ttattgcagc ttataatggt 1200
tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct 1260
agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg tctggatctg acatggtaag 1320
taagcttggg ctgcaggtcg agggaccta 1349
<210> 21
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gaattctaat acgactcact atagggggtc ttcgagaaga cctgttttag agctagaaat 60
agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct 120
tttaaaggat cc 132
<210> 22
<211> 1865
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cagggagtct ccttgtcctt gatgtcaaac tacatttttc ttccagtgat attcatatct 60
gcctctggag acctggcttt gtaacagcac tcatcatcct caaggttcct agcagatgtt 120
cttcacaagg aagagactgt aacatcattt gttggggcca gcaactcagt gagcagatag 180
aaagtcacag tgaaccaaca gggtccttct ggcagggagt gggtaagggg aaacaactag 240
atgtagcttg catagccaca taacacatct ggttaccatt tccctttcta ttcatttcta 300
atccatcaaa caattgatgt ttacatacaa cttcatcatc gccagctctg gtggcacatg 360
cctgtggtca cggcacttgg cagggaggag aggatggctg caagttctag gccagcctga 420
catatgtaga gtttcaggcc agtcagctag atatcaagac tcacacacac aaacaaacat 480
tataatttac aagtagattt ttgtagacaa gtcttatgat aagctaagca gaaagggtcg 540
acttgttcaa ggtcagacat ctccaaataa tacatctaag atctgtacct gagtcttttt 600
acctcaagtc caacctctcg cctactgtca agtctcctct cttcctgcgg ttggtctcag 660
acaacaaatc tgtttctgcc ttccatagta ccctttcttt tgggctcttg ttgtctctca 720
ggtttgagag agtagctact ggacaggatt ctttcctaca acaccatgtg cctttggtga 780
gtcatagaca aactgtatac agcagataat agattagtcc agggactgca aaaggcagtc 840
agggacaggc aggaaaggga aaggagaata tgaccaggac ttacagaaga gagtagatgg 900
gttccataaa cactagttaa ggagcagaac atggctccaa agcacaacac tggttcttat 960
taactcctgt gcgactccaa aagccctgcc tctctccttc cttcttcctc acatggaggt 1020
gccatgagag aacttcctaa aataaactgt aattctcaac ctgcacctgt cctgtccaag 1080
atgccaacac ggctctcatt caagtcacac atgtacaatc caatattctg gaaggcaaga 1140
gtgaatttaa gaagtggtat acataaatgt ttgaagtcac tgagactcaa atcccacaca 1200
accactgtaa ggcatactca ggtcaagaca tgagaagacc agcaggacag tgagccctat 1260
gggaggccca agagataccc agactgatga aatgatctgt gcccacagaa caccagacca 1320
agacagtcct gtgaccaagt gagcatagtc agcactgtac agtagttaag aatccttaac 1380
tataaaccag cagctagatg tctggacagg gaacatgttg gtttcctagt gtttacgaat 1440
attaaggact cttgacccaa accgtttaaa attccaatcc ttttatgaag tttgttgcag 1500
tgaaacaatg ccttcagttc tttttgaatg tgtagattag ttataaacag aaatgtcagt 1560
aagactgtaa aaaaaaatga agaaaggtgc atatgaggta tatttttatg cttggcgagt 1620
aaataaggag aaatcttata gcataatttt taaagaacat ttgtataatt tttctaaata 1680
tgtgtatatg tatattttat gcagcagtat tgagaaatga ccttggacta tcttgtaatt 1740
gtaaattcca aaaataaagc tgaagatata gtcctttgtc tttggtctta cttcttctct 1800
taacacttgt accctcaggg atgcagcaaa gacaatgttc acttcaaaac tgagacgaac 1860
aatgc 1865
<210> 23
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gcggaaccct tcgaagttcc tattctctag aaagtatagg aacttcccag agcccaaggc 60
actcattatt agcactgggt gagctccatg 90
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gagtggtatg tgcagctcag ggaag 25
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gctccaagaa acgaaaaggc cgaga 25
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
agcgcaaaca ttaaggcacg ggg 23
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ttaatgtttg cgctcagaat tgg 23
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gagcgcaaac attaaggcac ggg 23
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
aattctgagc gcaaacatta agg 23
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cctctagcac atcagatatc tgg 23
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tgagcgcaaa cattaaggca cgg 23
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gattgttgga tatacttcaa agg 23
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ttggaaattt aacgtttctg agg 23
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
catcacttgc ggggaagtcc tgg 23
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
tgctgagtcc atcacttgcg ggg 23
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
caggacttcc ccgcaagtga tgg 23
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gtctgtaacc ccgataagct tgg 23
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ttgcatctgc ggagttagca tgg 23
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gccatcgacc attcgtgcac agg 23
<210> 40
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ccctgtgcac gaatggtcga tgg 23
<210> 41
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
agtggagccc tgtgcacgaa tgg 23
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
cctttgaagt atatccaaca atc 23
<210> 43
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
tagggattgt tggatatact tcaaagg 27
<210> 44
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
aaaccctttg aagtatatcc aacaatc 27
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
cctgtgcacg aatggtcgat ggc 23
<210> 46
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
tagggccatc gaccattcgt gcacagg 27
<210> 47
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
aaaccctgtg cacgaatggt cgatggc 27
<210> 48
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
tttgataacg gtgtggaagg actgat 26
<210> 49
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
agacagcgat gcccttcaga ggata 25
<210> 50
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
tacacggtga accagatagt gccc 24
<210> 51
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
gtgggcggaa tccatgtggt gtatg 25
<210> 52
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
gccccagggc gatgatctta ttcac 25
<210> 53
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
agagaccctt tagacctgga tcagc 25
<210> 54
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
acctagaaaa ctttggtggg acatga 26
<210> 55
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
aactgatgaa tgggagcagt ggtgg 25
<210> 56
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
gcagacactc tatgcctgtg tggag 25
<210> 57
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aagatgtttc ttgtcccggg tttcg 25
<210> 58
<211> 25
<212> DNA
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<400> 58
ggactgattg atcccctcct cagaa 25
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<211> 22
<212> DNA
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gcacctgccg tccatcatct gc 22
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
acgtgctgtt tttggatgcc 20
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
tggtgtgcaa aatcgtaagc 20
<210> 62
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
tcaccatctt ccaggagcga ga 22
<210> 63
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
gaaggccatg ccagtgagct t 21
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