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同时表达IFNa14蛋白和人乙肝病毒S蛋白的重组酿酒酵母菌株及制备方法和应用

文献发布时间：2023-06-19 13:48:08

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，涉及表达IFNa14蛋白和人乙肝病毒S 蛋白的重组酿酒酵母菌株的制备方法和应用。

背景技术

乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染导致的一种全世界流行的疾病，特别是在发展中国家，发病率及死亡率一直很高

IFN-α2作为研究最多的亚型，已被用于治疗慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染，具有治疗时间有限、病毒学应答持续的优点，但其疗效仍相对较低。研究发现， IFN-α14是抑制HBV共价闭合环状DNA转录和HBV e抗原/HBV表面抗原产生最有效的亚型，中位抑制浓度值约为传统IFN-α2的100倍

比较成熟的异源蛋白表达系统包括酵母细胞、原核表达系统和杆状病毒昆虫细胞表达系统。相较于后两者，酵母细胞兼具成熟的翻译后修饰能力和培养周期短、安全、便捷、生产成本低等优势

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种同时表达IFNα14和乙肝病毒HBVs蛋白的重组酵母菌株，可将其用于口服制剂的研制。

本发明的目的之二在于提供所述口服重组酵母菌株的制备方法。

本发明目的是通过如下技术方案实现的：

一种同时表达IFNα14和人乙肝病毒S蛋白的重组酿酒酵母菌株， JDY52-HBVs-IFNα14，其包含HBVs蛋白的1位至200位氨基酸，包含IFNα14的 24位至189位氨基酸。

一种乙肝病毒S蛋白的截断体，优选为第1至200位氨基酸，序列特征为 SEQ IDNo.1。

一种IFNα14蛋白的截断体，优选为第24至189位氨基酸，序列特征为SEQ ID No.2。

表达所述乙肝病毒S蛋白截断体的基因，是从第1位至600位碱基，其核苷酸序列为SEQ ID No.3。构建所述重组酵母的质粒GPD-HBVs-TU，序列特征为SEQ ID No.5，由上述基因片段和POT-GPD-TU载体组成；

表达所述IFNα14蛋白截断体的基因，是从第70位至567位碱基，其核苷酸序列为SEQ ID No.4。构建所述重组酵母的质粒GPD-IFNα14-TU，序列特征为SEQ ID No.6，由上述基因片段和POT-GPD-TU载体组成。

制备所述同时表达IFNα14和人乙肝病毒S蛋白的重组酿酒酵母菌株的方法，首先制备乙肝病毒S蛋白重组酵母，将体外构建的S蛋白截断体完整转录单位 GPD-HBVs-TU，通过同源重组整合于酵母JDY52的基因组，利用Aga1-Aga2表面展示系统将S蛋白展示于酵母细胞表面；然后在已构建好的菌株JDY52-HBVs的基础上，制备IFNα14蛋白重组酵母，将体外构建的IFNα14蛋白截断体完整转录单位GPD-IFNα14-TU，通过同源重组整合于酵母JDY52-HBVs的基因组，利用α -Factor分泌系统将IFNα14蛋白分泌至细胞外；获得能够同时表面展示HBVs蛋白和分泌IFNα14蛋白的重组酵母菌株JDY52-HBVs-IFNα14。

制备同时表达IFNα14和人乙肝病毒S蛋白的重组酿酒酵母菌株的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)乙肝病毒刺突蛋白S编码基因的PCR扩增：参考乙肝病毒基因序列AF384371.1，合成优化后的S基因，序列特征为SEQ No.3；以 pET28a(+)-HBVs质粒为模板，设计引物扩增S蛋白编码基因用于酵母载体连接；

(2)IFNα14蛋白编码基因的PCR扩增：参考IFNα14基因序列NM_002172.3，合成优化后的IFNα14基因，序列特征为SEQ No.4；以pET28a(+)-IFNα14 质粒为模板，设计引物扩增IFNα14蛋白编码基因用于酵母载体连接；

(3)Aga2基因与乙肝病毒S蛋白编码序列串联：通过BamHI单酶切线性化 POT-GPD-TU载体，无缝克隆连接S基因片段至表面展示表达载体 GPD-POT-TU上，获得重组质粒GPD-HBVs-TU，其序列特征为SEQ No.5. 重组质粒转化至E.coli DH5a中，用S基因检测引物进行PCR及测序验证，获得阳性克隆；

(4)α-Factor基因与IFNα14蛋白编码序列串联：通过SmaI单酶切线性化POT-GPD-TU载体，无缝克隆连接IFNα14基因片段至分泌表达载体 GPD-POT-TU上，获得重组质粒GPD-IFNα14-TU，其序列特征为SEQ No.6. 重组质粒转化至E.coli DH5a中，用IFNα14基因检测引物进行PCR及测序验证，获得阳性克隆；

(5)HBVs蛋白酵母重组菌株的构建：将重组质粒GPD-HBVs-TU与同源臂 URRs、筛选标签Leu编码序列进行酶切拼接，获得完整的包含S基因序列的重组基因，转化到酿酒酵母基因组，经营养缺陷型平板筛选后获得重组菌株，利用检测引物进行基因水平检测，Western blot、免疫荧光进行蛋白表达水平验证；

(6)同时表面展示HBVs蛋白和分泌IFNα14蛋白的酵母重组菌株的构建：将重组质粒GPD-IFNα14-TU与同源臂SURs、筛选标签Trp编码序列进行酶切拼接，获得完整的包含IFNα14基因序列的重组基因，转化到(5) 所得到的重组酿酒酵母基因组，经营养缺陷型平板筛选后获得重组菌株，利用检测引物进行基因水平检测，Western blot、免疫荧光进行蛋白表达水平验证。

所述重组酿酒酵母菌株在制备乙型肝炎病毒口服疫苗中的应用。

本发明有益效果：

本发明基于乙肝病毒主要表面抗原HBVs，可以制成HBVs蛋白截短体表面展示型口服重组酵母制剂，可实现对HBV的免疫效果；基于最有效抑制HBV 转录的IFNα14，制成了分泌表达IFNα14蛋白截短体的重组酵母制剂，可实现对HBV的治疗效果；将两种表型整合至同一酵母菌株中，通过口服途径既可以激发机体保护性免疫反应，又可对病毒携带者起到一定的治疗作用。与现有的疫苗效比，口服重组酵母制剂成本低、可实现大规模放大生产，安全可靠，具有良好的应用开发前景，为乙型肝炎病毒的免疫和治疗提供选择。

本发明中所述的同时表达IFNα14和乙肝病毒S蛋白的重组酵母制剂在国内属于首次报道，同时分泌表达和表面展示菌株构建及制剂制备具有创新性，为 HBV的防控提供新思路与制剂。

附图说明

图1：乙肝病毒S蛋白编码基因结构模式图；

图2：IFNα14编码基因机构模式图；

图3：HBVs，IFNα14基因PCR扩增结果；

图4：GPD-HBVs-TU和GPD-IFNα14-TU质粒转化大肠杆菌后的转化子菌落PCR 检测结果，对照为ddH

图5：GPD-HBVs-TU完整转录单位拼接模式图；

图6：GPD-IFNα14-TU完整转录单位拼接模式图；

图7：GPD-HBVs-TU和GPD-IFNα14-TU重组酵母的基因型验证，对照为ddH

图8：JDY52-HBVs-IFNα14酵母菌株的HBVs蛋白表达的Western blot验证，泳道3，4和5对应3株不同的酵母转化子；

图9：JDY52-HBVs-IFNα14酵母菌株的IFNα14蛋白表达的Western blot验证，泳道3，4和5对应3株不同的酵母转化子。

具体实施方式

以下结合实例进一步阐述本发明，其中的内容不应理解为限定该发明的范围。实施例中所述试剂除特别说明，均为商业化试剂。

实施例1.GPD-HBVs-TU和GPD-IFNα14-TU载体的构建

(1)HBVs和IFNα14基因的扩增

根据HBVs和IFNα14基因序列结构(图1、2所示)，设计并合成引物， TU-HBVs-F(SEQID NO.7:gacgataagg taccaggatc catgggagga tggtcatcaa agc)和TU-HBVs-R(SEQ IDNO.8:tgctggatat ctactggatc cgagtatacg tgtcaggagg aagaatc)， TU-IFNα14-F(SEQ IDNO.9:gatgtgcttc gattccccgg gtgtaacctt tcacaaacac attcact)和 TU-IFNα14-R(SEQID NO.10:atctgtaagt ctagacccgg ggtcctttct tctcagccgc tt)。根据已有报道的HBVs基因序列(Genbank号AF384371.1)和IFNα14基因序列 (Genbank号NM_002172.3)，优化并人工合成了HBVs蛋白和IFNα14蛋白的基因，并构建了pET28a(+)-HBVs质粒和pET28a(+)-IFNα14，以质粒为模板，扩增HBVs(1-200)和IFNα14(24-189)的编码基因。PCR扩增体系为：

使用以下PCR程序进行扩增：

PCR结果如图3所示，PCR产物大小为600bp和498bp。

(2)GPD-HBVs-TU和GPD-IFNα14-TU载体的构建

将克隆得到的HBVs基因和IFNα14基因分别连接到实验室已构建的 POT-GPD-AgA2载体和POT-GPD-αFactor载体上

结果如图4所示，PCR扩增产物大小为600bp和498bp，与预期结果一致，表明GPD-HBVs-TU和GPD-IFNα14-TU质粒构建成功。

实施例2.同时表达IFNa14蛋白和人乙肝病毒S蛋白的重组酿酒酵母菌株的构建及检测

(1)酵母转化片段的构建

用BsaI酶切载体GPD-HBVs-TU，同时，BsmB I酶切同源臂质粒(URR1 和URR2)和选择性标记质粒(LEU)。参照Dai课题组的实验步骤

用BsaI酶切载体GPD-IFNα14-TU，同时，BsmB I酶切同源臂质粒(SUR1 和SUR2)和选择性标记质粒(Trp)。参照Dai课题组的实验步骤

(2)JDY52-HBVs重组酿酒酵母菌株的构建

①菌株活化：挑取JDY52单菌落接种到3mL YPD液体培养基中，30℃、 220rpm过夜培养。将过夜培养的菌液按1：50的比例转接到5mL新鲜的YPD 培养基中，使其初始OD为0.1～0.2，30℃、220rpm培养至OD600为0.5～0.8。 2500rpm离心5min收集5mL 菌液的菌体，并用1mL无菌水洗涤细胞，弃去上清。

②酵母转化：向离心后的菌体沉淀中加入100μL 0.1M的醋酸锂，重悬细胞，12000rpm离心20s弃去上清。加入50μL 0.1M醋酸锂，重悬细胞，12000rpm 离心20s收集菌体。然后在离心管中依次加入240μL 50％的PEG4000、36μL 1M 醋酸锂、100μg鲑鱼精DNA、2μg片段DNA，剧烈震荡至完全混匀。30℃200rpm 30min，42℃25min，6000rpm离心15s收集菌体，去除转化液，加入1mL的YPD液体培养基于30℃孵育2h，2500rpm离心5min收集菌体，用50μL去离子水重悬细胞，尽可能温和的吹吸混匀，将菌体涂布在SD-leu固体培养基表面，30℃培养箱生长2～3天，直至形成典型菌落。挑取单菌落在SD-leu平板划线纯化，同步接种至3mL YPD液体培养基中，30℃、220rpm过夜培养，用于基因型验证。

③JDY52-HBVs菌株的基因型验证

选择在SD-leu培养基中生长的酵母，提取其基因组PCR验证HBVs基因是否成功整合到基因组。酵母基因组的提取方法参照文献进行

使用以下PCR程序进行扩增：

(3)JDY52-HBVs-IFNα14重组酿酒酵母菌株的构建

挑取构建成功的JDY52-HBVs单菌落进行接种，按照(2)①②的方法将 IFNα14构建至菌株中，并按照(2)③的方法进行基因型验证。

实验结果如图7所示，JDY52-HBVs-IFNα14重组酵母菌株No.3，No.4，No.5 基因型正确。

(4)JDY52-HBVs-IFNα14菌株的表型验证

由于GPD-HBVs-TU和GPD-IFNα14-TU载体插入片段的C端带有His标签，利用Western blot抗His抗体检测目的基因的表达情况。

HBVs的表达情况：收集2mL 48h的YPD培养液，6000rpm离心1min收集菌体，加入酸洗玻璃珠，60μL PEB缓冲液重悬菌体，玻璃珠法破壁5次，加入15μL 5×SDS上样缓冲液，沸水浴5min，4℃下12000rpm离心10min，小心吸取上清，8μL上清用于12％SDS-PAGE电泳。

IFNα14的表达情况：收集2mL 48h的YPD培养液，6000rpm离心1min 收集上清，通过浓缩管进行浓缩，取60μL上清液，加入15μL 5×SDS上样缓冲液，沸水浴5min，8μL上清用于12％SDS-PAGE电泳。

SDS-PAGE电泳结束后，通过湿转法将蛋白分离胶转移至与其同等大小的 PVDF膜上，转膜条件为300mA 100min；转膜完成后，在室温下，用5％脱脂牛奶封闭PVDF膜1h；将膜完全浸没在用5％BSA 1:2000稀释的鼠抗His单克隆抗体(HT501,Transgene)中，4℃孵育过夜；回收一抗，用TBST缓冲液漂洗PVDF膜3次，每次10min；用5％BSA 1:5000稀释的羊抗鼠HRP标记二抗(LK2003,Sungene Biotech)室温孵育1h；TBST缓冲液漂洗PVDF膜3次；避光向PVDF膜正面滴加化学发光显色底物(34075,ThermoFisher)，通过Bio-rad 化学发光成像仪曝光，观察蛋白表达情况。

结果如图8、9所示，重组酵母菌株No.3,No.4和No.5均可表达HBVs蛋白和IFNα14蛋白。HBVs蛋白分子量理论值为25KDa，但实际观测结果为40KDa。 IFNα14蛋白分子量理论值为20KDa，但实际观测结果为25KDa。HBVs蛋白和 IFNα14蛋白有多个糖基化位点，分子量增加考虑糖基化所致。

尽管本发明内容是结合上述实施例进行说明，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,本发明的范围由所附权利要求书限定，其他的任何在限定范围内所作的改变或修饰，均应为等效的置换方式，均包含在本发明的保护范围之内。

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[7]

序列表

<110> 天津大学

<120> 同时表达IFNa14蛋白和人乙肝病毒S蛋白的重组酿酒酵母菌株及制备方法和应用

<130> 2021.08.10

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 200

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Gln Gly Met Gly Thr Asn Leu

1 5 10 15

Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro

20 25 30

Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn

35 40 45

Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Ala Gly Ala Phe Gly

50 55 60

Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln

65 70 75 80

Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser

85 90 95

Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu

100 105 110

Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His

115 120 125

Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly

130 135 140

Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro

145 150 155 160

Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn Met Glu

165 170 175

Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly

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Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu

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<210> 2

<211> 166

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 2

Cys Asn Leu Ser Gln Thr His Ser Leu Asn Asn Arg Arg Thr Leu Met

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Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp

20 25 30

Arg His Asp Phe Glu Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe

35 40 45

Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Met Gln Gln Thr

50 55 60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65 70 75 80

Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Met Asn Asp Leu

85 90 95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met

100 105 110

Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

115 120 125

Leu Tyr Leu Met Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

130 135 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys

145 150 155 160

Arg Leu Arg Arg Lys Asp

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<211> 600

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

atgggaggat ggtcatcaaa gccgcgacaa ggaatgggaa caaacctttc agttcctaac 60

cctcttggat tcttcccaga ccatcaactt gatcctgcat ttggagcaaa ctcaaacaac 120

cctgattggg atttcaatcc aaacaaagat cattggcctg aagcaaacca agttggagca 180

ggagcatttg gacctggatt tacacctcct catggaggac ttcttggatg gtcacctcaa 240

gcacaaggca tactcactac cgtacctgca gcacctcctc ctgcatcaac aaacagacaa 300

tcaggaagac aacctacacc tatttcacct cctcttagag attcacatcc tcaagcaatg 360

caatggaact caacaacatt tcatcaagca cttcttgatc ctagagttag aggactttat 420

ttcccggccg gaggatcatc atcaggaaca gttaaccctg ttcctacaac agcatcacct 480

atttcatcaa tattctcccg aacaggagat cctgcaccta acatggagaa taccacatca 540

ggatttcttg gacctttact cgtacttcaa gccggattct tcctcctgac acgtatactc 600

<210> 4

<211> 498

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

tgtaaccttt cacaaacaca ttcacttaac aacagaagaa cacttatgct tatggctcag 60

atgcgccgga tcagtccgtt cagttgcctc aaggaccgcc acgacttcga gttccctcaa 120

gaagaatttg atggaaacca atttcagaag gcccaggcaa tttcagttct tcatgaaatg 180

atgcaacaaa catttaacct atttagtacc aagaatagtt cagcagcatg ggatgaaaca 240

cttcttgaga agttctacat agaactcttt caacaaatga atgatcttga agcatgtgtt 300

attcaagaag ttggagttga agaaacaccg ctaatgaatg aggactctat attggccgta 360

aagaagtact ttcaaagaat cactttgtac cttatggaga agaagtacag cccttgtgca 420

tgggaagttg ttagagcaga aattatgaga tcactttcat tctccaccaa ccttcagaag 480

cggctgagaa gaaaggac 498

<210> 5

<211> 6928

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

agggcctcgt gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttagg 60

acggatcgct tgcctgtaac ttacacgcgc ctcgtatctt ttaatgatgg aataatttgg 120

gaatttactc tgtgtttatt tatttttatg ttttgtattt ggattttaga aagtaaataa 180

agaaggtaga agagttacgg aatgaagaaa aaaaaataaa caaaggttta aaaaatttca 240

acaaaaagcg tactttacat atatatttat tagacaagaa aagcagatta aatagatata 300

cattcgatta acgataagta aaatgtaaaa tcacaggatt ttcgtgtgtg gtcttctaca 360

cagacaagat gaaacaattc ggcattaata cctgagagca ggaagagcaa gataaaaggt 420

agtatttgtt ggcgatcccc ctagagtctt ttacatcttc ggaaaacaaa aactattttt 480

tctttaattt ctttttttac tttctatttt taatttatat atttatatta aaaaatttaa 540

attataatta tttttatagc acgtgatgaa aaggacccag gtggcacttt tcggggaaat 600

gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg 660

agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa 720

catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac 780

ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac 840

atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt 900

ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc 960

gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca 1020

ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc 1080

ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag 1140

gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa 1200

ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg 1260

gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa 1320

ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg 1380

gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtggtagtcg cggtatcatt 1440

gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt 1500

caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag 1560

cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat 1620

ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct 1680

taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct 1740

tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca 1800

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agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc 1920

aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct 1980

gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag 2040

gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc 2100

tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg 2160

agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag 2220

cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt 2280

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cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata 2520

cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt 2580

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gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcctatgt tgtgtggaat tgtgagcgga 2700

taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagcgcgc aattaaccct 2760

cactaaaggg aacaaaagct ggagctccac cgcggtggcg gccgcgaatt ccccgggtct 2820

agaggtctcg gttggcagtg actcggtctc tacctggctt cattatcaat actgccattt 2880

caaagaatac gtaaataatt aatagtagtg attttcctaa ctttatttag tcaaaaaatt 2940

agccttttaa ttctgctgta acccgtacat gcccaaaata gggggcgggt tacacagaat 3000

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gatgacacaa ggcaattgac ccacgcatgt atctatctca ttttcttaca ccttctatta 3300

ccttctgctc tctctgattt ggaaaaagct gaaaaaaaag gttgaaacca gttccctgaa 3360

attattcccc tacttgacta ataagtatat aaagacggta ggtattgatt gtaattctgt 3420

aaatctattt cttaaacttc ttaaattcta cttttatagt tagtcttttt tttagtttta 3480

aaacaccaag aacttagttt cgaataaaca cacataaaca aacaaagatg atgcagttac 3540

ttcgctgttt ttcaatattt tctgttattg cttcagtttt agcacaggaa ctgacaacta 3600

tatgcgagca aatcccctca ccaactttag aatcgacgcc gtactctttg tcaacgacta 3660

ctattttggc caacgggaag gcaatgcaag gagtttttga atattacaaa tcagtaacgt 3720

ttgtcagtaa ttgcggttct cacccctcaa caactagcaa aggcagcccc ataaacacac 3780

agtatgtttt taagcttctg caggctagtg gtggtggtgg ttctggtggt ggtggttctg 3840

gtggtggtgg ttctgctagc atgactggtg gacagcaaat gggtcgggat ctgtacgacg 3900

atgacgataa ggtaccagga tccatgggag gatggtcatc aaagccgcga caaggaatgg 3960

gaacaaacct ttcagttcct aaccctcttg gattcttccc agaccatcaa cttgatcctg 4020

catttggagc aaactcaaac aaccctgatt gggatttcaa tccaaacaaa gatcattggc 4080

ctgaagcaaa ccaagttgga gcaggagcat ttggacctgg atttacacct cctcatggag 4140

gacttcttgg atggtcacct caagcacaag gcatactcac taccgtacct gcagcacctc 4200

ctcctgcatc aacaaacaga caatcaggaa gacaacctac acctatttca cctcctctta 4260

gagattcaca tcctcaagca atgcaatgga actcaacaac atttcatcaa gcacttcttg 4320

atcctagagt tagaggactt tatttcccgg ccggaggatc atcatcagga acagttaacc 4380

ctgttcctac aacagcatca cctatttcat caatattctc ccgaacagga gatcctgcac 4440

ctaacatgga gaataccaca tcaggatttc ttggaccttt actcgtactt caagccggat 4500

tcttcctcct gacacgtata ctcggatcca gtagatatcc agcacagtgg cggccgctcg 4560

agtctagagg gcccttcgaa ggtaagccta tccctaaccc tctcctcggt ctcgattcta 4620

cgcgtaccgg tcatcatcac catcaccatt gatagccgaa tttcttatga tttatgattt 4680

ttattattaa ataagttata aaaaaaataa gtgtatacaa attttaaagt gactcttagg 4740

ttttaaaacg aaaattctta ttcttgagta actctttcct gtaggtcagg ttgctttctc 4800

aggtatagca tgaggtcgct cttattgacc acacctctac cggcctctga gagagaccca 4860

agacactgcg gatcgagacc actagtaccg gtctgcagct cgaggggggg cccggtaccc 4920

aattcgccct atagtgagtc gtattacgcg cgctcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt 4980

gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc 5040

agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg 5100

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tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggcct attggttaaa aaatgagctg 5520

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gcatccgctt acagacaagc tgtgacaatc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca 6900

ccgtcatcac cgaaacgcgc gagattaa 6928

<210> 6

<211> 6610

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6