一种粪生链霉菌BWL-H1菌剂的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，特别涉及一种粪生链霉菌BWL-H1菌剂的制备方法和应用。

背景技术

长期以来，农药和化肥是十分重要的农业生产资料，是粮食产量稳定甚至增产的主要方式。在整个世界范围内普遍存在化肥农药的滥用现象。不仅浪费资源，且严重危害生态环境和人们的身体健康。微生物菌剂是替代化肥和农药的一种重要的生物防治技术。以放线菌为代表的生防菌，由于其出色的生防效果，已被广泛应用于植物病害防治。中国早前就开展了相关生防菌制剂的研究，用于防病保苗和增产，为农业生产带来了巨大的效益。

发明内容

鉴以此，本发明提出一种粪生链霉菌BWL-H1菌剂的制备方法和应用，来解决上述问题。

本发明的技术方案是这样实现的：一种粪生链霉菌BWL-H1菌剂的制备方法，包括以下步骤：

S1、粪生链霉菌BWL-H1固体发酵：以蚯蚓粪和麦麸为基质，将粪生链霉菌BWL-H1接种在基质上，于25～30℃发酵4～10d，30～40℃恒温干燥20～30h后，将其粉碎过100～300目筛备用，得到孢子粉；

S2、制备可湿性粉剂：将上述孢子粉与湿润剂、分散悬浮剂、载体混合制得可湿性粉剂，即为粪生链霉菌BWL-H1菌剂，所述可湿性粉剂中包括以下质量百分比原料：孢子粉8～12％、湿润剂3～8％、分散悬浮剂3～8％，余量为载体。

进一步的，所述S1中蚯蚓粪和麦麸的质量比为2～5:1。

进一步的，所述S2中可湿性粉剂中包括以下质量百分比原料：孢子粉10％、湿润剂5％、分散悬浮剂5％，余量为载体。

进一步的，所述湿润剂为十二烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠、拉开粉BX、AB-3中的一种，质量浓度为1～5％。

进一步的，所述分散悬浮剂为亚甲基二萘磺酸钠(NNO)或木质素磺酸钠，质量浓度为1～5％。

进一步的，所述载体为硅藻土、高岭土、白炭黑中的一种。

进一步的，所制得的粪生链霉菌BWL-H1菌剂作为黄瓜枯萎病防效的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明前期从土壤中分离得到的粪生链霉菌BWL-H1菌株生长繁殖迅速、产孢丰富、抗逆性强、遗传性状稳定。本发明选用麦麸和蚯蚓粪对其进行固体发酵以产生菌粉，孢子含量可达9.6×10

本发明将粪生链霉菌BWL-H1制成菌剂，抑制病原微生物的生长，减少病害发生，减少化肥农药的使用，为进一步推广应用奠定理论基础。

附图说明

图1不同载体对粪生链霉菌BWL-H1菌落生长的影响；

图2不同湿润剂对粪生链霉菌BWL-H1菌落生长的影响；

图3不同分散悬浮剂对粪生链霉菌BWL-H1菌落生长的影响。

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明链霉菌菌株：粪生链霉菌BWL-H1，从海南省昌江县霸王岭荔枝树下的土壤中分离出，在海南省绿色农用生物制剂创制工程研究中心保存。

本发明黄瓜枯萎病：镰刀菌GF，分离自四川农科院的发病黄瓜种，在海南省绿色农用生物制剂创制工程研究中心保存。

实施例1

一种粪生链霉菌BWL-H1菌剂的制备方法，包括以下步骤：

S1、粪生链霉菌BWL-H1固体发酵：以蚯蚓粪和麦麸为基质，蚯蚓粪和麦麸的质量比为2:1，将粪生链霉菌BWL-H1接种在基质上，于25℃发酵4d，30℃恒温干燥20h后，将其粉碎过100目筛备用，得到孢子粉；

S2、制备可湿性粉剂：按质量百分比将上述孢子粉8％、十二烷基苯磺酸钠3％、亚甲基二萘磺酸钠3％、白炭黑86％，混合制得可湿性粉剂，即为粪生链霉菌BWL-H1菌剂。

实施例2

一种粪生链霉菌BWL-H1菌剂的制备方法，包括以下步骤：

S1、粪生链霉菌BWL-H1固体发酵：以蚯蚓粪和麦麸为基质，蚯蚓粪和麦麸的质量比为5:1，将粪生链霉菌BWL-H1接种在基质上，于30℃发酵10d，40℃恒温干燥30h后，将其粉碎过300目筛备用，得到孢子粉；

S2、制备可湿性粉剂：按质量百分比将上述孢子粉12％、十二烷基苯磺酸钠8％、亚甲基二萘磺酸钠8％、白炭黑72％，质量浓度为1～5％，混合制得可湿性粉剂，即为粪生链霉菌BWL-H1菌剂。

实施例3

一种粪生链霉菌BWL-H1菌剂的制备方法，包括以下步骤：

S1、粪生链霉菌BWL-H1固体发酵：以蚯蚓粪和麦麸为基质，蚯蚓粪和麦麸的质量比为3:1，将粪生链霉菌BWL-H1接种在基质上，于27℃发酵7d，30～40℃恒温干燥24h后，将其粉碎过200目筛备用，得到孢子粉；

S2、制备可湿性粉剂：按质量百分比将上述孢子粉10％、十二烷基苯磺酸钠5％、亚甲基二萘磺酸钠5％、白炭黑80％，混合制得可湿性粉剂，即为粪生链霉菌BWL-H1菌剂。

实施例4

本实施例与事实3的区别在于，所述载体为硅藻土，其余步骤的工艺条件不变。

实施例5

本实施例与事实3的区别在于，所述载体为高岭土，其余步骤的工艺条件不变。

实施例6

本实施例与事实3的区别在于，所述湿润剂为十二烷基硫酸钠，其余步骤的工艺条件不变。

实施例7

本实施例与事实3的区别在于，所述湿润剂为拉开粉BX，其余步骤的工艺条件不变。

实施例8

本实施例与事实3的区别在于，所述分散悬浮剂为木质素磺酸钠，其余步骤的工艺条件不变。

对比例1

将粪生链霉菌BWL-H1按照中国植物病理学会《生防放线菌孢子缓释微球的研制[的研究方法》，张伟伟,冯浩等人的方法制成粪生链霉菌BWL-H1微球。

一、验证实验

(1)孢子含量测定

将实施例1～3的发酵制得的孢子粉测定其孢子含量，结果如下表1：

可知实施3的孢子含量可达9.6×10

(2)载体的筛选

将硅藻土、高岭土、白炭黑三种载体按500μg/ml的浓度加入到PDA中，于121℃高温灭菌20min，之后将其倒入平板中自然冷却后备用。

将粪生链霉菌BWL-H1培养7d，向培养皿中加入2ml无菌水，用无菌载玻片慢慢刮洗下来，用移液枪吸取少量于血球计数板上，拿到显微镜下计数，完成后在超净工作台上将原液稀释相应倍数制成孢子浓度为10

表2不同载体对粪生链霉菌BWL-H1的菌落生长影响

研究结果表明，三种载体与ck之间无显著性差异。但白炭黑和硅藻土相对于高岭土表现出更强的促进菌落形成作用(表2，图1)。在本研究中白炭黑细度更高，对产品悬浮性能更优，因此实施例3～5的对比中，实施例3的白炭黑更适合作为粪生链霉菌BWL-H1固体制剂的载体。

(2)湿润剂的筛选

以2.5g为基数，孢子粉占10％，湿润剂在含量为1％、3％、5％时，以白炭黑补全至100％。在250mL烧杯中加入100mL标准硬水，水浴加热至25℃。称取2.5g均匀试样，在尽量保持液面平稳的前提下一次性全部倒入烧杯中，同时开始计时，记录全部润湿所用的时间。重复三次，取平均值作为其湿润时间，三种湿润剂在不同浓度下的湿润时间如表3所示。

表3湿润剂的润湿特性及对粪生链霉菌BWL-H1菌落生长影响

由上表可知，SDS具有较好的湿润性，在5％浓度下可达到3.83 s，但因其对放线菌孢子萌发影响较大，与该菌株生物相容性较差，在该浓度下完全抑制孢子萌发，因此选择SDBS作为湿润剂，加入该湿润剂，可使湿润时间小于2 min。

(3)分散悬浮剂的筛选

参考GB/T 14825-2006的方法比较实施例3亚甲基双萘磺酸钠(NNO)和实施例8木质素磺酸钠这两种分散悬浮剂的悬浮率，以2.5 g为基数，孢子粉占10％，最优湿润剂占5％，分散剂含量分别为1％、3％、5％时，以白炭黑补全至100％。称取适量样品，取250mL烧杯，加50mL标准硬水，恒温水浴加热至30±1℃后加入样品。用手振荡烧杯，以较平缓的振荡速率持续2min，静置4min，全部倒入250mL量筒，多次清洗直至其满刻度。用盖子完全堵住量筒开口，上下摇晃一段时间后水浴锅中继续静置，此时测其孢子浓度为C1。待静置足够长时间后，将上清液吸出，不要吸起沉淀物，此时测两桶内孢子浓度为C2。悬浮率的计算公式如下：

两种分散悬浮剂的悬浮特性如表4所示，

表4分散悬浮剂的悬浮特性及对粪生链霉菌BWL-H1菌落生长影响

由上表可知，当不加入分散剂，仅以孢子粉占比10％含量混入白炭黑载体时，其制剂的悬浮率仅有42.25％。分散剂NNO的悬浮特性优于木质素磺酸钠，可使制剂的悬浮率达到70.97％。将两种分散剂与粪生链霉菌BWL-H1的生物相容性进行比较，NNO的对放线菌孢子萌发不存在抑制现象，因此，选取NNO作为分散剂添加到可湿性粉剂中。

二、黄瓜枯萎病的防治盆栽试验

将镰刀菌GF接种于PDB平板中，于28℃恒温培养箱内振荡培养7d，经过2层粗纱布过滤掉菌丝后，制成孢子浓度为1×106CFU/mL的菌悬液备用。

将黄瓜种子催芽后，播种于育苗盘，两周后将其移栽口径为10cm，高9.5的盆中。试验共设10个处理：T1:清水对照,；T2：将实施例3的粪生链霉菌BWL-H1可湿性粉剂稀释100倍灌根，一周后，将100mL镰刀菌GF的孢子悬浮液对黄瓜苗进行灌根处理；T3:将粪生链霉菌BWL-H1微球与营养土以质量比为1：100混匀，每处理重复3次，每次重复10株苗。10d后调查植株发病情况，防治效果和病情指数标准，见表5。

表5不同等级病害分级标准及公式

采用Excel2007中AVERAGE和STDEVP函数计算样本的均值和标准差，采用SPSS17.0软件中沃勒-邓肯进行多重比较(P<0.05)结果如下表6。

表6链霉菌BWL-H1两种制剂对黄瓜枯萎病的防效

注：T1、T2、T3分别代表对照、可湿性粉剂处理、微球处理。

由上表可知，可湿性粉剂处理、微球处理与对照之间各自存在显著性差异(P<0.05)，粪生链霉菌BWL-H1可湿性粉剂对黄瓜枯萎病的防治效果最为明显，可达48.65％，显著高于粪生链霉菌BWL-H1微球对枯萎病的防效。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。