一株长双歧杆菌NX-8及其在制备抗衰老药物中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，更具体的说是涉及一株长双歧杆菌NX-8及其在制备抗衰老药物中的应用。

背景技术

衰老过程使人体机能在多个层面恶化，从而导致其抵抗压力、损伤和疾病的能力逐渐下降。除了基因表达和代谢控制的变化外，衰老率还与高水平的活性氧(reactiveoxygen species，ROS)的产生有关。ROS是细胞有氧代谢的副产物，主要包括过氧化氢(O

紫外线照射诱导的ROS介导多种细胞功能和改变，包括基质金属蛋白酶(MMP)分泌和细胞外基质(ECM)降解。长时间的UVB紫外线暴露会导致皮肤老化，由于胶原蛋白和弹性蛋白纤维分解以及原胶原蛋白合成受到抑制，从而导致皱纹形成。胶原蛋白位于皮肤的真皮层，含量约为70％，主要类型为I(85％)、III和Ⅴ型，纤维状的胶原蛋白形成网状结构，提供皮肤的张力和弹性。MMP主要包括胶原酶(MMP-1和-13)和明胶酶(MMP-2和-9)，能够降解细胞外基质中的所有物质，包括胶原蛋白、弹性蛋白、糖蛋白等等。因此，ROS介导的氧化应激诱导的衰老可以说是引起和驱动衰老程序的最持久但可改变的因子。

衰老细胞已被提议作为干预的目标，以延缓衰老及其相关疾病或改善疾病治疗。对衰老细胞的治疗干预可能有助于恢复健康并治愈共享基础过程的疾病，而不是以单独和有症状的方式治愈每种疾病。大量实验研究表明，抗氧化剂或自由基清除剂有助于避免ROS的积累，对氧化损伤具有保护作用，可延缓衰老。但大多数化学合成或植物提取的抗氧化药物因具有潜在的不良反应而不推荐长期使用。因此，寻找一种疗效可靠、毒副作用小的治疗方式成为主要研究方向。与传统抗氧化药物相比，具有抗氧化功效的益生菌因其副作用小并且具有其他益生功效等特点，而被广泛关注。

益生菌是活的微生物，当以足够的量施用时，会给宿主带来健康益处。益生菌的使用已经与一些健康有益效果相关，包括肠道菌群的调节、氧化还原平衡、免疫应答、脑神经调节等。这解释了基于益生菌的饮食干预越来越多地用于治疗和预防不同的慢性疾病，尤其是与压力和炎症相关的慢性疾病。

然而，目前益生菌在抗氧剂、延缓衰老、皮肤光老化中的研究和应用较少。同时，当前国际益生菌专利申请集中于美、日、俄传统研发强国，而我国缺乏拥有自主知识产权的功能性菌株。国内生产企业所用益生菌菌种长期依赖进口，而且国外菌株未必适合我国居民胃肠道生理状况。另外，益生菌的功能缺乏有力的科学研究证据，严重影响了益生菌及其制品的推广。基于此，针对菌种资源的功能深入挖掘，筛选出拥有自主知识产权、具有特定功能性质、适合中国人群生理特性的新型益生菌菌株，对提高我国益生菌生产企业的核心竞争力，促进我国益生菌制品发展尤为重要。

因此，提供一株长双歧杆菌NX-8及其在制备抗衰老药物中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一株长双歧杆菌NX-8及其在制备抗衰老药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NX-8，其保藏编号为CGMCCNo.20116，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2020年06月19日，分类命名为长双歧杆菌Bifidobacterium longum。

进一步，所述的长双歧杆菌NX-8在制备抗衰老药物中的应用。

进一步，所述长双歧杆菌NX-8为菌悬液或发酵上清液。

进一步，所述菌悬液或发酵上清液在降低斑马鱼体内ROS水平，提高体内SOD活性中的应用。

进一步，所述的长双歧杆菌NX-8在缓解皮肤光老化中的应用。

进一步，所述长双歧杆菌NX-8为菌悬液或发酵上清液。

进一步，所述菌悬液或发酵上清液在UVB紫外线诱导人皮肤成纤维细胞光老化模型中能显著促进Ⅰ型胶原蛋白(Col-I)合成，和显著抑制MMP-1分泌的应用。

进一步，所述的长双歧杆菌NX-8在制备抗氧化食品、化妆品、药品中的应用。

本发明所述长双歧杆菌NX-8，在体内氧化应激模型中具有降低斑马鱼体内ROS水平，和提高斑马鱼体内SOD活性的作用，表现出良好的抗氧化延缓衰老的益生功效；同时该菌株在UVB紫外线诱导人皮肤成纤维细胞光老化模型中能显著促进Ⅰ型胶原蛋白(Col-I)的合成，和显著抑制MMP-1的分泌，表现出良好的缓解皮肤光老化作用。

本发明所述在体内氧化应激模型中能显著降低斑马鱼体内ROS水平，和显著提高斑马鱼体内SOD活性，以及在UVB紫外线诱导人皮肤成纤维细胞光老化模型中也能显著促进Ⅰ型胶原蛋白合成，和显著抑制MMP-1分泌的菌株NX-8，包括菌株NX-8的发酵上清液(胞外分泌物)、菌悬液(菌体)。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一株长双歧杆菌NX-8及其在制备抗衰老药物中的应用，长双歧杆菌NX-8是从广东省梅州市蕉岭县的长寿老人粪便中分离筛选得到的，在斑马鱼氧化应激模型中具有显著降低斑马鱼体内ROS水平，和显著提高斑马鱼体内SOD活性，以及在UVB紫外线诱导人皮肤成纤维细胞光老化模型中能显著促进Ⅰ型胶原蛋白合成，和显著抑制MMP-1分泌的潜能，此为利用长双歧杆菌NX-8开发抗氧化延缓衰老、缓解皮肤光老化的益生菌制剂提供理论参考和指导依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明长双歧杆菌NX-8形成的菌落形态图；

图2附图为本发明长双歧杆菌NX-8革兰氏染色后的显微形态观察；

图3附图为本发明长双歧杆菌NX-8的发酵上清液、菌悬液对甲萘醌诱导斑马鱼氧化应激模型中ROS水平影响的直观图；

图4附图为本发明长双歧杆菌NX-8的发酵上清液、菌悬液对甲萘醌诱导斑马鱼氧化应激模型中ROS水平影响的统计图；

图5附图为本发明长双歧杆菌NX-8的发酵上清液、菌悬液对甲萘醌诱导斑马鱼氧化应激模型中SOD活性的影响；

图6附图为本发明长双歧杆菌NX-8的发酵上清液、菌悬液对紫外线UVB诱导人皮肤成纤维细胞光老化模型中Ⅰ型胶原蛋白(Col-I)合成的影响；

图7附图为本发明长双歧杆菌NX-8的发酵上清液、菌悬液对紫外线UVB诱导人皮肤成纤维细胞光老化模型中MMP-1分泌的影响。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1 长双歧杆菌NX-8分离、鉴定及保藏

(1)分离：将长寿老人粪便经梯度稀释后，分别接种于PYG固体培养基、BHI固体培养基、BS固体培养基、MRS固体培养基中，37℃厌氧培养48h，挑取平板上的单菌落划线分离得到纯菌落。将平板上的纯菌落接种于BS液体培养基中，37℃厌氧培养12～16h，加入20％甘油，置于-80℃冰箱中保存。

(2)菌株形态学鉴定：对筛选出的菌株革兰氏染色后于显微镜下观察，革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

(3)菌株的分子生物学鉴定：对所获得的菌株提取基因组DNA，通过PCR技术利用16S rDNA通用引物27F和1492R扩增16S rDNA全长片段，之后进行测序，鉴定菌株的种属。

其中，通用引物27F和1492R的引物序列如下：

27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；SEQ ID NO.1；

1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’；SEQ ID NO.2。

实验结果：从广东省梅州市蕉岭县长寿老人粪便中筛选出的菌株，经形态观察、16S rDNA鉴定，其中菌株NX-8被鉴定为长双歧杆菌，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.3所示。

TCATCCCACAAGGGGTTAGGCCACCGGCTTCGGGTGCTGCCCACTTTCATGACTTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGCATTCACCGCGACGTTGCTGATTCGCGATTACTAGCGACTCCGCCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGACCGGTTTTCAGGGATCCGCTCCGCGTCGCCGCGTCGCATCCCGTTGTACCGGCCATTGTAGCATGCGTGAAGCCCTGGACGTAAGGGGCATGATGATCTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTAACCCCGGCGGTCCCCCGTGAGTTCCCGGCATAATCCGCTGGCAACACGGGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTGAACCCGCCCCGAAGGGAAGCCGTATCTCTACGACCGTCGGGAACATGTCAAGCCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTTCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATGCTTAACGCGTTAGCTCCGACACGGAACCCGTGGAACGGGCCCCACATCCAGCATCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTAACGGCCCAGAGACCTGCCTTCGCCATTGGTGTTCTTCCCGATATCTACACATTCCACCGTTACACCGGGAATTCCAGTCTCCCCTACCGCACTCAAGCCCGCCCGTACCCGGCGCGGATCCACCGTTAAGCGATGGACTTTCACACCGGACGCGACGAACCGCCTAC；SEQ ID NO.3。

菌株NX-8单菌落接种到BS固体培养基上，37℃厌氧生长良好，菌落白色、呈圆形、表面光滑、不透明、边缘整齐(图1)，革兰氏染色呈阳性(图2)。菌株NX-8已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2020年06月19日，分类命名为长双歧杆菌Bifidobacterium longum，保藏编号为CGMCC No.20116。

实施例2 长双歧杆菌NX-8发酵上清液(胞外分泌物)、菌悬液(菌体)的制备

将长双歧杆菌NX-8活化培养后接种于BS液体培养基中，37℃培养15h后，调整发酵菌浓度为1×10

将长双歧杆菌NX-8活化培养后接种于BS液体培养基中，37℃培养15h后，调整发酵菌浓度为1×10

实施例3 长双歧杆菌NX-8对斑马鱼氧化应激模型中ROS水平的影响

还原型谷胱甘肽(GSH)、甲萘醌、二甲基亚砜(DMSO)均购自上海源叶生物科技有限公司；2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)购自Sigma-Aldrich公司。

挑选发育至4dpf(days post fertilization)的健康野生型AB系斑马鱼置于6孔细胞培养板中，每孔20条鱼。实验设置空白对照组、模型组、阳性对照组、样品(菌悬液、发酵上清液)干预组，每组20条鱼。空白对照组加入PBS，模型组加入PBS，阳性对照组加入GSH溶液(100μM)，菌悬液组加入菌悬液，发酵上清液组加入发酵上清液，每孔2.5mL；28℃孵育24h后，空白对照组加入2.5mL PBS(1％DMSO)，模型组、阳性对照组、菌悬液组、发酵上清液组分别加入6μM甲萘醌(先用DMSO将甲萘醌配制为600μM储备溶液，再用PBS稀释为6μM)，每孔2.5mL；28℃孵育24h后，弃上述溶液，再用PBS将上述斑马鱼洗涤3次，加入20μg/mL DCFH-DA溶液，每孔3mL，28℃避光孵育1h后，用PBS将上述斑马鱼洗涤3次，置于荧光显微镜下观察斑马鱼体内荧光强度并拍照记录。使用Image J软件对斑马鱼体内荧光强度(S)进行定量统计分析。斑马鱼体内ROS水平计算如下：

采用SPSS 19.0软件统计处理数据，实验数据均用

结果见图3、4；由图3和图4可知，斑马鱼体内绿色荧光的强弱反映ROS水平的高低；与空白对照组相比，模型组斑马鱼体内绿色荧光强度增强，表明模型组斑马鱼体内ROS水平升高；同时，与空白对照组(100.00±3.02％)相比，模型组斑马鱼体内ROS水平(189.65±7.43％)显著升高(p<0.005)，表明本次斑马鱼氧化应激模型建立成功。

与模型组相比，阳性对照组(GSH)斑马鱼体内绿色荧光强度减弱，表明GSH在甲萘醌诱导斑马鱼氧化应激模型中，可降低斑马鱼体内ROS水平；同时，阳性对照组斑马鱼体内ROS水平为119.83±6.85％，与模型组(189.65±7.43％)相比差异性显著(P<0.005)；因此，GSH具有明显的抗氧化作用，与临床结果一致。与模型组相比，长双歧杆菌NX-8的发酵上清液、菌悬液组斑马鱼体内绿色荧光强度也减弱，表明长双歧杆菌NX-8的发酵上清液、菌悬液在甲萘醌诱导斑马鱼氧化应激模型中，可降低斑马鱼体内ROS水平；同时长双歧杆菌NX-8的发酵上清液、菌悬液组斑马鱼体内ROS水平分别为135.28±7.51％、163.63±8.83％，与模型组(189.65±7.43％)相比较均差异性显著(P<0.01)。因此，上述结果表明长双歧杆菌NX-8的发酵上清液、菌悬液在体内氧化应激模型中均能显著降低斑马鱼体内ROS水平，表现出良好抗氧化延缓衰老的作用。

实施例4长双歧杆菌NX-8对斑马鱼氧化应激模型中SOD活性的影响

挑选发育至4dpf(days post fertilization)的健康野生型AB系斑马鱼置于6孔细胞培养板中，每孔20条鱼。实验设置空白对照组、模型组、阳性对照组、样品(菌悬液、发酵上清液)干预组，每组20条鱼。空白对照组加入PBS，模型组加入PBS，阳性对照组加入GSH溶液(100μM)，菌悬液组加入菌悬液，发酵上清液组加入发酵上清液，每孔2.5mL；28℃孵育24h后，空白对照组加入2.5mL PBS(1％DMSO)，模型组、阳性对照组、菌悬液组、发酵上清液组分别加入6μM甲萘醌(先用DMSO将甲萘醌配制为600μM储备溶液，再用PBS稀释为6μM)，每孔2.5mL；28℃孵育24h后，弃上述溶液，再用PBS将上述斑马鱼洗涤3次，收集斑马鱼至1.5mL离心管，每管50mg斑马鱼，每个实验组收集6管；将离心管中的水吸干后，加入250μL缓冲液(超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒缓冲溶液)。将离心管用超声波破碎仪在冰浴中处理，工作5s、间隔8s，超声破碎10次，12000×g，4℃离心10min，收集上清液。使用超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒(Sigma-Aldrich公司)检测各组的SOD活性。

采用SPSS 19.0软件统计处理数据，实验数据均用

结果见图5；由图5可知，与空白对照组(3.80±0.55U/mg)相比，模型组斑马鱼体内SOD活性(0.84±0.09U/mg)显著降低(p<0.005)，表明本次斑马鱼氧化应激模型建立成功。

阳性对照组斑马鱼体内SOD活性为3.01±0.27U/mg，与模型组(0.84±0.09U/mg)相比差异性显著(P<0.005)，表明GSH具有明显的抗氧化作用，与临床结果一致。长双歧杆菌NX-8的发酵上清液、菌悬液组斑马鱼体内SOD活性分别为2.56±0.27U/mg、2.31±0.21U/mg，与模型组(0.84±0.09U/mg)相比较均差异性显著(P<0.01)。因此，上述结果表明长双歧杆菌NX-8的发酵上清液、菌悬液在体内氧化应激模型中均能显著提高斑马鱼体内SOD活性，增强机体清除自由基的能力，表现出良好抗氧化延缓衰老的作用。

实施例5长双歧杆菌NX-8对人皮肤成纤维细胞HSF光老化模型中Ⅰ型胶原蛋白和MMP-1含量的影响

将对数生长期的HSF细胞，经胰酶消化、吹打制备成细胞悬液后，调整其细胞浓度为5×10

结果见图6、7；由图6和图7可知，与空白对照组(Col-I：26.70±0.46ng/mL、MMP-1：4.20±0.16ng/mL)相比，模型组Col-I(15.46±1.05ng/mL)显著降低和MMP-1(11.61±1.07ng/mL)显著增加(p<0.005)，表明本次UVB紫外线诱导人皮肤成纤维细胞光老化模型建立成功。

长双歧杆菌NX-8的发酵上清液、菌悬液组Col-I浓度分别为20.99±0.62ng/mL、19.02±0.97ng/mL，与模型组(15.46±1.05ng/mL)相比较均差异性显著(P<0.05)；另外，长双歧杆菌NX-8的发酵上清液、菌悬液组MMP-1浓度分别为6.41±0.86ng/mL、8.23±0.55ng/mL，与模型组(11.61±1.07ng/mL)相比较均差异性显著(P<0.05)。因此，上述结果表明长双歧杆菌NX-8的发酵上清液、菌悬液在UVB紫外线诱导人皮肤成纤维细胞光老化模型能显著促进Ⅰ型胶原蛋白合成，和显著抑制MMP-1分泌的潜能，表现出良好缓解皮肤光老化的作用。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 广东一元兰欣生物科技有限公司 佛山市朗芯生物科技有限公司

<120> 一株长双歧杆菌NX-8及其在制备抗衰老药物中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 885

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

tcatcccaca aggggttagg ccaccggctt cgggtgctgc ccactttcat gacttgacgg 60

gcggtgtgta caaggcccgg gaacgcattc accgcgacgt tgctgattcg cgattactag 120

cgactccgcc ttcacgcagt cgagttgcag actgcgatcc gaactgagac cggttttcag 180

ggatccgctc cgcgtcgccg cgtcgcatcc cgttgtaccg gccattgtag catgcgtgaa 240

gccctggacg taaggggcat gatgatctga cgtcatcccc accttcctcc gagttaaccc 300

cggcggtccc ccgtgagttc ccggcataat ccgctggcaa cacggggcga gggttgcgct 360

cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacgaccat gcaccacctg 420

tgaacccgcc ccgaagggaa gccgtatctc tacgaccgtc gggaacatgt caagcccagg 480

taaggttctt cgcgttgcat cgaattaatc cgcatgctcc gccgcttgtg cgggcccccg 540

tcaatttctt tgagttttag ccttgcggcc gtactcccca ggcgggatgc ttaacgcgtt 600

agctccgaca cggaacccgt ggaacgggcc ccacatccag catccaccgt ttacggcgtg 660

gactaccagg gtatctaatc ctgttcgctc cccacgcttt cgctcctcag cgtcagtaac 720

ggcccagaga cctgccttcg ccattggtgt tcttcccgat atctacacat tccaccgtta 780

caccgggaat tccagtctcc cctaccgcac tcaagcccgc ccgtacccgg cgcggatcca 840

ccgttaagcg atggactttc acaccggacg cgacgaaccg cctac 885