一种三孢布拉霉产物的提取方法及由其提取得到的三孢布拉霉产物

技术领域

本发明属于纯化技术领域，具体涉及一种三孢布拉霉产物的提取方法。

背景技术

类胡萝卜素是一类040四萜结构的化合物及其衍生物的总称，已作为抗氧化剂被广泛研究。它是由8个类异戊二烯单位组成，呈黄色、橙红色或红色的色素。番茄红素和β-胡萝卜素是极具代表性的类胡萝卜素，能高效淬灭人体中的单线态氧和清除自由基，从而起到抗癌、抑癌作用及活化免疫细胞等功能，被称为“植物黄金”

目前，类胡萝卜素的一种制备方式为从植物中萃取，如胡萝卜、玉米、沙棘、番茄等。以番茄红素为例，即使是番茄红素含量最高的番茄其含量也仅有约100mg/kg，大规模植物提取会造成植物资源大量浪费，且植物成分复杂，造成提取产物纯度不高。因此，综合考虑到品质、技术、生产、资源成本等因素，从天然植物中提取生产类胡萝卜素的前景并不乐观。通过Wittig烯化反应可以人工合成番茄红素，但化学合成法工艺路线较长，反应条件比较苛刻，收率较低，同时产品带有大量的有毒物质残余，对食品安全产生很大影响。

微生物有生长繁殖快，生长周期短，产量高，杂质少，可以进行大规模生产的特点，可以克服番茄提取和化学法合成番茄红素的不足之处，非常适合用于工业化生产；其培养方法简单，原料来源丰富，价格低廉，经济效益高。

三孢布拉霉能够产β-胡萝卜素和番茄红素，目前作为两者产业化的常用菌种而得到广泛应用。三孢布拉霉属于毛霉菌，能生长成粗壮的长菌丝，对于普通微生物的所采用的常规破壁手段难以实现较好效果，而类胡萝卜素在菌体中以微小晶体存在，因此需要对三孢布拉霉进行彻底的破壁处理。

根据文献报道，现有技术中主要是通过酶法、物理均质或研磨、酸法，其中酸法需要在强酸溶液中对菌体进行长时间的裂解，而类胡萝卜素为多烯结构，在长时间的强酸条件下容易被破坏；现有技术中的酶法破壁，如文献《三孢布拉霉菌的复合酶破壁处理》宣称其提取率能够达到90％；物理均质或研磨手段是目前针对三孢布拉霉最常用的破壁手段，本申请人也曾经尝试采用高压均质以及配合酶解手段的使用，如CN110407659A中所述，将番茄红素从三孢布拉霉中提取出来并取得良好的收率，虽然酶解手段的配合能够一定程度上减轻均质工艺的压力，但是，高压均质所产生的能耗，处理量级，以及温度对设备带来的损耗，对于大规模的生产来说是无法忽视的。

因此，申请人想要开发一种以酶法手段为主的三孢布拉霉破壁方法，在破壁完全的同时，能够使得类胡萝卜素在温和的条件下被顺利的提取出来。

发明内容

在申请人的研究过程中，发现按照现有技术所给出的复合酶法破壁方法并无法达到其宣称的良好效果，究其原因可能在于本申请人所处理的菌株为诱变后的三孢布拉霉菌株，且经过驯化后，其类胡萝卜素产量高于大部分常规三孢布拉霉菌株，通过发酵调控其类胡萝卜素含量能够达到7％以上，类胡萝卜素在霉菌体内以晶体形式存在，相对应的，诱变后的三孢布拉霉菌株进化出更厚的细胞壁来承载高含量产物所带来的压力，所以仅采用复合酶法的手段难以达到如文献所报道的效果。申请人为了解决现有技术无法解决的问题，针对此三孢布拉霉提出新的提取方法，所述提取方法喷雾干燥法等前处理手段和酶解相结合对三孢布拉霉细胞破壁，对细胞壁破壁效果良好。

本发明所针对的菌株于2014年8月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为：三孢布拉霉BT7251(+)CCTCC M 2014378；三孢布拉霉BT7603(-)CCTCC M 2014379。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种三孢布拉霉产物的提取方法，所述三孢布拉霉产物的提取方法包括以下步骤：将由三孢布拉霉发酵得到的发酵液进行干燥、灭菌和酶解，得到提取物。

在本发明中，由三孢布拉霉发酵得到类胡萝卜素发酵液，具体发酵方法参见(专利CN104531538A)，而在三孢布拉霉发酵过程中通过添加阻断剂阻止番茄红素向β-胡萝卜素转化而获得产物番茄红素的技术已经为本领域技术人员所熟知。关于三孢布拉霉的产物β胡萝卜素和番茄红素的含量可由发酵工艺调控决定的，申请人据此已经做过一系列的发酵研究，如专利CN108034686B、CN107937469B等等，根据目的能够得到不同含量的三孢布拉霉发酵液。

在本发明中，通过干燥的过程将细胞含水量降低至5％以下，使菌体细胞壁结构发生变性，很好地破坏细胞壁结构，有利于后面酶解，且更容易配合溶剂萃取，从而进一步地提高类胡萝卜素得率。灭菌又可以称为是细胞灭活，灭活菌体更容易酶解，通常微生物领域或者是微生物油脂领域细胞灭活不论是高压灭菌或者是巴氏杀菌都需要20-30分钟，但如果仅进行长时间的灭活会使类胡萝卜素被大量破坏，而本申请由于进行了喷雾干燥，再进行灭菌可以充分避免类胡萝卜素被破坏，从而极大程度上提高类胡萝卜素提取率。

优选地，所述干燥得到的干菌体的含水量为5wt％以下，例如可以是5wt％、4.5wt％、4wt％、3.5wt％、3wt％、2.5wt％、2wt％、1.5wt％、1wt％、0.5wt％、0.2wt％、0.1wt％、0.05wt％、0wt％等。

在本发明中，所述干燥可以是直接喷雾干燥，可以是滤得菌体之后进行真空干燥，需要保证干燥后的干菌体含水量在5wt％。

优选地，所述干燥为喷雾干燥。

在本发明中，优选采用喷雾干燥的方式，这是由于喷雾干燥的优势在于处理量大、所需时间短。普通的中试塔处理量可以在1kg/h，生产级别的喷雾塔处理量可以达到70kg/h。

优选地，所述灭菌为高压蒸汽灭菌。

优选地，所述高压蒸汽灭菌处理的温度为100-150℃(例如可以是100℃、110℃、120℃、130℃、140℃、150℃等)，压力为0.1-0.2MPa(例如可以是0.1MPa、0.12MPa、0.14MPa、0.16MPa、0.18MPa、0.2MPa等)，时间为5-10min(例如可以是5min、6min、7min、8min、9min、10min等)。

优选地，所述酶解采用的酶包括复合蛋白酶和葡聚糖酶。

优选地，所述复合蛋白酶的的总酶活性为400-800U/mL，例如可以是400U/mL、420U/mL、440U/mL、460U/mL、480U/mL、500U/mL、550U/mL、600U/mL、650U/mL、700U/mL、750U/mL、800U/mL等。

优选地，所述葡聚糖酶的酶活性为0.5-10U/mL，例如可以是0.5U/mL、1U/mL、2U/mL、3U/mL、4U/mL、5U/mL、6U/mL、7U/mL、8U/mL、9U/mL、10U/mL等。

优选地，所述复合蛋白酶包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶。

优选地，所述碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的活性比值为1:1:(0.5-0.8)，例如可以是1:1:0.5、1:1:0.55、1:1:0.6、1:1:0.65、1:1:0.7、1:1:0.75、1:1:0.8等。

优选地，所述酶解的温度为35-65℃，例如可以是35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃等，所述酶解的时间为12-24h，例如可以是12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h等。

优选地，所述干燥得到的干菌体需进行稀释后再进行灭菌，所述稀释的溶剂为水。

优选地，所述稀释得到的稀释液中含水量为70-90wt％，例如可以是70wt％、72wt％、74wt％、76wt％、78wt％、80wt％、82wt％、84wt％、86wt％、88wt％、90wt％等。

优选地，所述酶解前还需调节pH至5-8，例如可以是5、5.5、6、6.5、7、7.5、8等。

在本发明中，此处的调节pH指的是：所述干燥得到的干菌体需进行稀释后再进行灭菌，而灭菌得到的稀释液在酶解前需要调节pH。

优选地，所述调节pH采用碱。

优选地，所述碱包括氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠或碳酸氢钾中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述酶解后还需进行固液分离。

优选地，所述固液分离的方式为离心。

在本发明中，所述酶解后还需进行离心处理：将酶解后的反应液离心。

优选地，所述离心的转速为8000-10000r/min，例如可以是8000r/min、8500r/min、9000r/min、9500r/min、10000r/min等，所述离心的时间为5-20min，例如可以是5min、6min、8min、10min、12min、14min、16min、18min、20min等。

优选地，所述固液分离后还需进行萃取纯化：将分层得到的上层粗晶体采用有机溶剂萃取，脱溶，过滤，得到含类胡萝卜素的晶体。

优选地，所述萃取用有机溶剂为乙酸乙酯。

优选地，所述萃取的温度为60-70℃(例如可以是60℃、62℃、64℃、66℃、68℃、70℃等)，所述萃取的次数在2次以上(例如可以是2次、4次、6次、8次、10次等)，所述萃取的时间在10min以上(例如可以是10min、15min、20min、25min、30min等)。

出于对纯度有利的方面进行考虑，还可以在萃取前对粗晶体进行洗涤，也可以针对脱溶过滤后的晶体进行二次洗涤，洗涤溶剂为乙醇，由于类胡萝卜素难溶于乙醇，所以基本不会对提取率造成影响。

优选地，所述一次洗涤和二次洗涤采用的溶剂均为乙醇。

优选地，所述上层粗晶体与一次洗涤的溶剂的质量比为1:(2-5)，例如可以是1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5等。

优选地，所述过滤得到的晶体与一次洗涤的溶剂的质量比为1:(10-30)，例如可以是1:10、1:12、1:15、1:18、1:20、1:23、1:25、1:27、1:30等。

优选地，所述三孢布拉霉产物的提取方法包括以下步骤：

(1)干燥：将由三孢布拉霉发酵得到的发酵液进行干燥，得到含水量为5wt％以下的干菌体；

(2)灭菌：先将干燥得到的产品稀释，得到含水量为80-90wt％的稀释液，再将所述稀释液进行灭菌处理；

(3)酶解：将灭菌后的发酵液pH调节至5-8，再与碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和葡聚糖酶混合，在55-60℃下进行12-24h的酶解反应；

(4)离心分层：将酶解得到的酶解液以8000-10000r/min的转速离心5-20min，得到上层粗晶体；

(5)将上层粗晶体进采用乙酸乙酯在60-70℃下萃取2次以上，脱溶，过滤，得到含类胡萝卜素的晶体。

第二方面，本发明提供一种三孢布拉霉产物，所述三孢布拉霉产物由如第一方面所述的三孢布拉霉产物的提取方法得到。

优选地，所述三孢布拉霉产物为类胡萝卜素晶体。

在本发明中，最终得到的产物同时中包含番茄红素和β-胡萝卜素，由于两者性质十分相近，所述的三孢布拉霉产物的提取方法能够使两者同时被提取，因此下述的所有指标中仅以番茄红素作为示意。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明所述三孢布拉霉产物的提取方法采用喷雾干燥使菌体细胞壁更容易破坏，采用复合蛋白酶和葡聚糖酶联合使用，对细胞壁破壁效果良好；

(2)本发明所述三孢布拉霉产物的提取方法有效对三孢布拉霉细胞壁进行破壁处理，更容易配合溶剂萃取，番茄红素得率高达90％以上；

(2)本发明所述三孢布拉霉产物的提取方法原料生产速度快、所得产品质量高，所需后续处理工艺少，容易大规模生产，投资回报高，且可连续化生产。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

以下实施例的产物同时中包含番茄红素和β-胡萝卜素，由于两者性质十分相近，本方法能够使两者同时被提取，并无特意的选择性特征，因此指标中仅以番茄红素作为示意。

实施例1

本实施例提供一种三孢布拉霉产物的提取方法，所述三孢布拉霉产物的提取方法具体包括如下步骤：

(1)将500g三孢布拉霉发酵液进行喷雾干燥处理至含水量为3wt％；

其中，所述三孢布拉霉发酵液中番茄红素含量为0.588wt％；所述喷雾干燥使用喷雾干燥塔进行，进风温度175℃，出风温度65℃，处理量为1kg/h；

(2)将喷雾干燥得到的产品进行稀释至含水量为85wt％，番茄红素含量0.588％，再在121℃、0.12MPa的条件下灭菌5min；

(3)先用氢氧化钠将高压灭菌后的发酵液pH调节至6，再添加复合蛋白酶和葡聚糖酶55℃酶解18h，得到酶解液；

所述酶解的反应液中：复合蛋白酶为210U/mL的碱性蛋白酶、210U/mL的中性蛋白酶和180U/mL的木瓜蛋白酶的组合，所述葡聚糖酶为3U/mL的葡聚糖酶；

(4)将酶解液8000r/min离心10min，静置分为上中下三层；

(5)取上层粗晶体，上层粗晶体加乙醇400mL，离心分离乙醇，得到脱水粗晶体110g，加2L乙酸乙酯4次萃取，萃取温度68℃，搅拌15min，收集萃取液，脱溶，收集脱溶母液，过滤得到晶体，将晶体用20倍质量得乙醇洗涤3次得到纯化晶体，纯化晶体中有番茄红素有2.7g，提取率91.8％。

实施例2

本实施例提供一种三孢布拉霉产物的提取方法，所述三孢布拉霉产物的提取方法具体包括如下步骤：

(1)将500g三孢布拉霉发酵液进行喷雾干燥处理至含水量为5wt％，

其中，所述三孢布拉霉发酵液中番茄红素含量为1.17wt％；所述喷雾干燥使用喷雾干燥塔进行，进风温度175℃，出风温度65℃，处理量为1kg/h；

(2)将喷雾干燥得到的产品进行稀释至含水量为70wt％，番茄红素含量1.17％，再在121℃、0.12MPa的条件下灭菌10min；

(3)先用氢氧化钠将高压灭菌后的发酵液pH调节至6.5，再添加复合蛋白酶和葡聚糖酶60℃酶解18h，得到酶解液；

所述酶解的反应液中：复合蛋白酶为300U/mL的碱性蛋白酶、300U/mL的中性蛋白酶和180U/mL的木瓜蛋白酶的组合，所述葡聚糖酶为5U/mL的葡聚糖酶；

(4)将酶解液8000r/min离心10min，静置分为上中下三层；

(5)取上层粗晶体，上层粗晶体加乙醇400mL，离心分离乙醇，得到脱水粗晶体110g，加2L乙酸乙酯4次萃取，萃取温度68℃，搅拌15min，收集萃取液，脱溶，收集脱溶母液，过滤得到晶体，将晶体用20倍质量得乙醇洗涤3次得到纯化晶体，纯化晶体中有番茄红素有2.5g，提取率90.2％。

实施例3

本实施例提供一种三孢布拉霉产物的提取方法，与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，干燥后的干菌体至含水量为10wt％。

实施例4

本实施例提供一种三孢布拉霉产物的提取方法，与实施例1的区别仅在于，步骤(2)中，稀释至含水量为55wt％，而直接进行灭菌。

实施例5

本实施例提供一种三孢布拉霉产物的提取方法，与实施例1的区别仅在于，复合蛋白酶为210U/mL的碱性蛋白酶和180U/mL木瓜蛋白酶的组合。

实施例6

本实施例提供一种三孢布拉霉产物的提取方法，与实施例1的区别仅在于，复合蛋白酶为210U/mL的中性蛋白酶和180U/mL木瓜蛋白酶的组合。

实施例7

本实施例提供一种三孢布拉霉产物的提取方法，与实施例1的区别仅在于，复合蛋白酶为210U/mL的碱性蛋白酶和180U/mL中性蛋白酶的组合。

实施例8

本实施例提供一种三孢布拉霉产物的提取方法，与实施例1的区别仅在于，不添加3U/mL的葡聚糖酶。

实施例9

本实施例提供一种三孢布拉霉产物的提取方法，与实施例1的区别仅在于，将3U/mL的葡聚糖酶替换为70U/mL的磷脂酶。

实施例10

本实施例提供一种三孢布拉霉产物的提取方法，与实施例1的区别仅在于，参与酶解的酶为中性蛋白酶、纤维素酶和磷脂酶，其中，中性蛋白酶的酶活性为210U/mL，纤维素酶的酶活性为350U/mL，磷脂酶的酶活性为70U/mL。

对比例1

本对比例提供一种三孢布拉霉产物的提取方法，所述三孢布拉霉产物的提取方法具体包括如下步骤：

(1)将500g发酵液浓缩至含水量为85wt％，番茄红素含量0.588％；

(2)在121℃、0.12MPa的条件下灭菌5min；

(3)先用氢氧化钠将高压灭菌后的发酵液pH调节至6，再添加复合蛋白酶和葡聚糖酶55℃酶解18h，得到酶解液；

所述酶解的反应液中：复合蛋白酶为210U/mL的碱性蛋白酶、210U/mL的中性蛋白酶和180U/mL的木瓜蛋白酶的组合，所述葡聚糖酶为3U/mL的葡聚糖酶；

(4)将酶解液8000r/min离心10min，静置分为上中下三层；

(5)取上层粗晶体，上层粗晶体加乙醇400mL，离心分离乙醇，得到脱水粗晶体110g，加2L乙酸乙酯4次萃取，萃取温度68℃，搅拌15min，收集萃取液，脱溶，收集脱溶母液，过滤得到晶体，将晶体用20倍质量得乙醇洗涤3次得到纯化晶体，纯化晶体中有番茄红素有2.23g，提取率76％。

对比例2

本对比例提供一种三孢布拉霉产物的提取方法，所述三孢布拉霉产物的提取方法具体包括如下步骤：

(1)将500g发酵液进行喷雾干燥处理至含水量为3％，所述发酵液中番茄红素含量为0.588％；

所述喷雾干燥使用喷雾干燥机进行，所述喷雾干燥机的功率为15kW，进风温度175℃，出风温度65℃，处理量为1kg/h；

(2)将喷雾干燥得到的产品进行稀释至含水量为85wt％，番茄红素含量0.588％，再在121℃、0.12MPa的条件下灭菌5min；

(3)先用氢氧化钠将高压灭菌后的发酵液pH调节至6，加2L乙酸乙酯4次萃取，萃取温度68℃，搅拌15min，收集萃取液，脱溶，收集脱溶母液，过滤得到晶体，将晶体用20倍质量得乙醇洗涤3次得到纯化晶体，纯化晶体中有番茄红素有0.17g，提取率5.8％。

对比例3

本对比例提供一种三孢布拉霉产物的提取方法，所述三孢布拉霉产物的提取方法具体包括如下步骤：

(1)将500g发酵液进行喷雾干燥处理至含水量为3％；所述发酵液中番茄红素含量为0.588％；

所述喷雾干燥使用喷雾干燥机进行，所述喷雾干燥机的功率为15kW，进风温度175℃，出风温度65℃，处理量为1kg/h；

(2)将喷雾干燥得到的产品进行稀释至含水量为85wt％，番茄红素含量0.588％；

(3)先用氢氧化钠将高压灭菌后的发酵液pH调节至6，再添加复合蛋白酶和葡聚糖酶55℃酶解18h，得到酶解液；

所述酶解的反应液中：复合蛋白酶为210U/mL的碱性蛋白酶、210U/mL的中性蛋白酶和180U/mL的木瓜蛋白酶的组合，所述葡聚糖酶为3U/mL的葡聚糖酶；

(4)将酶解液8000r/min离心10min，酶解液分为上中下三层；

(5)取上层粗晶体，上层粗晶体加乙醇400mL，离心分离乙醇，得到脱水粗晶体110g，加2L乙酸乙酯4次萃取，萃取温度68℃，搅拌15min，收集萃取液，脱溶，收集脱溶母液，过滤得到晶体，将晶体用20倍质量得乙醇洗涤3次得到纯化晶体，纯化晶体中有番茄红素有2.3g，提取率78％。

性能测试

分别采用HPLC法测试上述实施例1-10和对比例1-3最后得到的纯化晶体中番茄红素的纯度和提取率：具体测试结果如下表1所示：

表1

由表1测试数据可知，本发明所述提取方法用喷雾干燥使菌体细胞壁更容易破坏；采用复合蛋白酶和葡聚糖酶联合使用，对细胞壁破壁效果良好。该方法有效对三孢布拉霉细胞壁进行破壁处理，更容易配合溶剂萃取，番茄红素得率高达90％以上。

由实施例1和实施例3-4的对比可知，若喷雾时温度过低，或导致干燥不完全，继而导致无法充分破壁；若喷雾时温度过高，虽然干燥完全，但可能出现的情况。

由实施例1和实施例5-7的对比可知，干燥后不进行复溶，或复溶的浓度不在本申请优选范围内，都会导致酶解无法充分对细胞壁破壁，继而导致番茄红素得率的下降。

由实施例1和实施例8-12的对比可知，采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和葡聚糖酶进行复合酶解，能进一步地提高破壁效果。

由实施例1和对比例1-3的对比可知，本发明采用干燥、灭菌和酶解相配合的处理模式，才能够充分对细胞壁破壁进行破坏，而不进行其中任一项的操作，番茄红素得率很低，最高仅有78％。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明所述三孢布拉霉产物的提取方法及由其提取得到的三孢布拉霉产物，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。