一种蜂毒肽-聚唾液酸静电复合物的制备及其用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种蜂毒肽-聚唾液酸静电复合物及其治疗癌症的用途。

背景技术

肿瘤是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物，因为这种新生物多呈占位性块状突起，也称赘生物。肿瘤又分为两类，一类生长缓慢被称为良性肿瘤，另一类生长迅速被命名为恶性肿瘤，也叫癌症。近些年来，癌症已逐渐成为威胁人类健康的第二大杀手，据研究者的调查可知，每年有超过一千万人被确诊为癌症，预计到2025年可能会增加超过2000万癌症病例，并且在未来几年还会更多。

蜂毒(Bee venom，BV)是欧洲蜜蜂分泌的毒液，是蜜蜂防御的重要组成部分。在《神农经典本草》中蜂毒首次用于治疗皮肤病、关节痛、牙痛以及脖子和耳朵部位的肿瘤等。蜂毒肽(Melitten，简称MEL)，又称蜂毒素、蜂毒肽素、蜂毒溶血肽，是BV的主要成分和主要生物活性物质，干重占比约为50％。MEL是一种高水溶性、线性、两亲性多肽，分子式为C

多项研究表明，MEL具有广谱抗癌作用，抑瘤机制主要分为抑制肿瘤新生血管形成、诱导肿瘤细胞凋亡以及直接溶解肿瘤细胞，对卵巢癌、肝癌、乳腺癌、白血病、肺癌、膀胱癌等在内的癌症均具有明显抑制效果。尽管有令人信服的针对多种癌症良好功效的数据，但MEL的应用仍主要处于临床前阶段，还未有产品上市。这是因为MEL会产生严重的副作用，主要包括溶血和过敏反应，高剂量的MEL可能会引起瘙痒、发炎和局部疼痛，MEL与红细胞膜有较高的亲和力，二者结合后会引发严重的溶血反应，主要表现为红细胞皱缩，膜通透性增加，随着MEL浓度升高红细胞膜产生孔洞，最终细胞内的血红蛋白释放，严重的副作用是MEL治疗肿瘤应用面临的主要挑战。为了提高MEL功效并降低毒性，需要对MEL进行结构修饰或者选择合适的载体。如专利CN109692326A公开了一种采用纳米颗粒作为载体的蜂毒脂质纳米颗粒，由蜂毒杂合多肽和磷脂、胆固醇脂结合组成，实现靶向抑制肿瘤生长和转移，毒副作用小；专利CN110551191A公开了一种改良型蜂毒肽，通过序列改进获得新型蜂毒肽，在保留原有功能的基础上，同时获得低溶血效果。尽管现有技术通过结构修饰或者使用载体可以一定程度在保留原有功效的同时降低毒副作用，但由于原料、工艺复杂，且开发出适于临床应用的剂型困难，这些均限制了MEL在产业上的应用。

聚合物-药物复合物是一种可以改善药物递送并且增强药物抗肿瘤效果的良好递送系统。与游离药物相比，它们可以增加制剂通过高渗透强滞留效应(Enhancedpermeability and retention effect，EPR)被动累积到肿瘤组织的能力，从而提高抗肿瘤效果。唾液酸(Sialic acid，SA)是具有9个碳原子的神经氨酸衍生物，系统命名为5-氨基-3,5-二脱氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖。聚唾液酸(PSA)是由SA单体以α-2,8-、α-2,9-、或α-2,8-/α-2,9-交替的酮苷键连接而成的无分支直链聚合物。每一个SA分子均带有一个负电荷，因此，PSA带大量负电荷。PSA是一种内源性物质，具有生物相容性且无免疫原性，对肿瘤具有一定的主动靶向作用，PSA可与成纤维母细胞相结合，而这种成纤维母细胞多高表达于乳腺癌、肺癌、黑色素瘤、肝癌等肿瘤中，参与肿瘤的分化、生长、浸润、转移和肿瘤新血管的生成。PSA带有大量负电荷，结合MEL带正电荷的特性，如果将PSA与MEL在一定条件下形成静电复合物，将可以达到增效减毒的目的，具有极好的应用前景。

发明内容

为克服上述现有技术的缺陷和不足，本发明提供了一种蜂毒肽-聚唾液酸(MEL-PSA)静电复合物、其制备方法及其应用。该复合物中，聚唾液酸(PSA)具有生物相容性且无免疫原性，对肿瘤具有主动靶向作用，PSA带有大量负电荷可结合蜂毒肽(MEL)带正电荷的特性，混合制备的MEL-PSA静电复合物，达到了增效减毒的目的，具有意料不到的技术效果。

本发明的首要目的是提供一种蜂毒肽-聚唾液酸(MEL-PSA)静电复合物，所述复合物包含蜂毒肽和聚唾液酸，所述静电复合物由蜂毒肽和聚唾液酸主要通过静电相互作用形成。

本发明所述的蜂毒肽-聚唾液酸静电复合物，其中所述蜂毒肽与聚唾液酸的摩尔比为1:1～1:100，优选为1:2～1:50，更优选为1:5～1:10。

本发明所述的蜂毒肽-聚唾液酸静电复合物，其中所述聚唾液酸的分子量不小于5KD，优选不小于10KD，更优选为30KD～100KD(例如30KD，40KD，50KD，60KD，70KD，80KD，90KD，100KD)。

本发明的第二个目的是提供一种蜂毒肽-聚唾液酸静电复合物的制备方法，所述方法包括：

(1)称取蜂毒肽于烧杯中，加入溶剂使其溶解；

(2)称取聚唾液酸于西林瓶中，加入溶剂使其溶解；

(3)移取步骤(1)和(2)的溶液混合均匀，搅拌即得。

本发明所述静电复合物的制备方法中，所述步骤(1)和步骤(2)中的溶剂为注射用水或葡萄糖的水溶液。

本发明所述静电复合物的制备方法中，所述步骤(3)中，搅拌的时间为0.25h～5h，优选为0.5h～2h(如0.5h，1h，1.5h，2h)。

本发明所述静电复合物的制备方法中，所述步骤(3)的温度为20℃～60℃，优选为30℃～50℃(如30℃，35℃，40℃，45℃，50℃)。

本发明所述静电复合物的制备方法中，所述步骤(3)中混合溶液的pH值保持在4-9，优选为5-8，更优选为6-7。

本发明的目的还包括提供一种包含上述静电复合物的药物制剂，所述的药物制剂选自液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型包括但不限于溶液剂、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)；固体剂型包括但不限于片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸等；半固体剂型包括但不限于软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

本发明所述包含静电复合物的药物制剂，包含所述静电复合物及其药学上可接受的辅料制备而成。在本发明的一个优选实施方式中，例如可以将本发明所述静电复合物、注射用水及任选的渗透压调节剂、pH调节剂等进一步制备为注射剂。

本发明的目的还包括提供蜂毒肽-聚唾液酸静电复合物在制备治疗癌症的药物中的用途。优选的，所述癌症包括前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、大肠癌、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤、白血病、鼻咽癌、淋巴瘤、子宫癌、膀胱癌、骨肉瘤、黑色素瘤、结肠肿瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤等。由于MEL的广谱抗癌特性，因此所述癌症包括但不限于上述具体种类。

本发明的静电复合物使用没有限制，可以单独使用，可作为制剂使用，也可与其他治疗药物(如其它抗癌剂)、方法(如放疗)、手段、技术联合应用。

本发明的静电复合物中，聚唾液酸是一种肿瘤生长必需的“营养物质”，其结构中的羧基带有负电荷，可与MEL结构中的正电荷以静电作用结合为静电复合物(MEL-PSA)，不同分子量的PSA与MEL结合紧密程度不同，其抗肿瘤效果也有区别。MEL-PSA通过肿瘤对PSA的主动摄取而增加MEL-PSA对肿瘤的靶向抑制作用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供的蜂毒肽-聚唾液酸静电复合物，较大分子量的PSA将MEL紧紧包裹，因此相较于游离的MEL可明显降低溶血等毒副作用。同时由于PSA对于肿瘤细胞主动的靶向性，在进一步降低MEL毒副作用的基础上增加了MEL在病灶的分布，提高了MEL的抗癌效果。

(2)本发明提供的蜂毒肽-聚唾液酸静电复合物性状、粒径、包覆率均达到优异水平，可完全满足制剂要求，同时制备原料易得，制备方法简单，易于工业化生产，具有极大的应用潜力。

附图说明

图1不同浓度的MEL小鼠体内溶血情况。

具体实施方式

下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通与/或改变都将落入本发明保护范围。

原料来源如下：蜂毒肽原料药(Melittin，MEL，吉尔生化上海有限公司，纯度≥97％，中国)；

聚唾液酸(Poly[2,8-(N-acetylneuraminic acid sodium salt)]，PSA

聚唾液酸(Poly[2,8-(N-acetylneuraminic acid sodium salt)]，PSA

聚唾液酸(Poly[2,8-(N-acetylneuraminic acid sodium salt)]，PSA

灭菌注射用水(石家庄四药有限公司，中国)；

5％葡萄糖注射液(5％Glu，昆明南疆制药有限公司，中国)。

实施例1 MEL-PSA

室温条件下，精密称取10.0mg MEL于烧杯中，加入10mL灭菌注射用水使其溶解，得浓度为1mg/mL的MEL溶液，精密称取12.0mg PSA

实施例2 MEL-PSA

室温条件下，精密称取20.0mg MEL于烧杯中，加入1mL 5％Glu使其溶解，用5％Glu稀释至20mL，得浓度为1mg/mL的MEL溶液，精密称取10.0mg PSA

实施例3 MEL-PSA

室温条件下，精密称取20.0mg MEL于烧杯中，加入1mL 5％Glu使其溶解，用5％Glu稀释至20mL，得浓度为1mg/mL的MEL溶液，精密称取10.0mg PSA

试验例

1、粒径及包封率

粒径测定：取样品适量，以5％葡萄糖溶液进行稀释，放入样品池内，使光密度值在250～350kHz之间，采用基于动态光散射原理的Nicomp-380粒径测定仪测定制剂粒径。测定条件：光源为He-Ne激光(空气冷却)，波长632.8nm，功率75mW，温度为室温(25℃)。

表1实施例1-3静电复合物的粒径

结果：实施例1-3制备得到的复合物粒径分布平均，从表1可以看到，实施例1-3的粒径均小于30nm，符合进一步制备为各种制剂的要求，尤其适用于注射给药制剂。

包封率测定：采用葡聚糖凝胶Sephadex G-50测定静电复合物的包封率。将葡聚糖凝胶Sephadex G-50浸泡于蒸馏水中过夜，充分溶胀，装于2.5mL注射器内，体积约为1.5mL，待水分自然流下，2000rpm离心4min除去多余水分制备凝胶柱，柱高约为1.0cm，备用。分别精密量取0.2mL静电复合物各两份，一份直接加入2mL容量瓶中，用灭菌注射用水定容至刻度并摇匀，于紫外-分光光度计278nm处测定吸光度，记为Abefore，代入紫外标准曲线方程，得到相应的Cbefore；另一份上样于葡聚糖凝胶柱顶端，2000rpm离心3min后续加0.2mL灭菌注射用水于葡聚糖凝胶柱顶端，同法操作3次，合并洗脱液转移至2mL容量瓶中，用灭菌注射用水稀释至刻度并摇匀，于紫外-分光光度计278nm处测定吸光度，记为Aafter，代入紫外标准曲线方程，得到相应的Cafter，根据公式EE％＝Cafter/Cbefore×100％计算MEL的包封率。

表2实施例1-3静电复合物的包封率

结果：测定结果表明不同PSA分子量包裹的MEL的包封率均在98％以上，包封效果优异。

2、体内溶血考察

分组如下：MEL-PSA

结果：如图1所示，高剂量与中剂量的MEL能使小鼠体内产生较强的溶血作用，而MEL-PSA

3、抑制肿瘤效果研究

细胞与动物：

S180细胞(骨肉瘤细胞，中国科学院上海细胞库，中国)

昆明小鼠(18～22g，♂，沈阳药科大学实验动物中心，中国)

实验方法：

液氮中取出冷冻保存的S180细胞，于37℃水浴下迅速复苏。复苏后的S180细胞悬液腹腔注射于小鼠体内。7天后，在无菌条件下抽取乳白色粘稠腹水，台盼蓝法计算存活率。将抽取的腹水用生理盐水稀释至1.5×10

将42只S180荷瘤小鼠随机分为7组，分别为5％Glu、H-MEL-S(高剂量MEL-S，代表MEL纯溶液)、M-MEL-S(中剂量MEL-S)、L-MEL-S(低剂量MEL-S)、H-MEL-PSA

将42只S180荷瘤小鼠随机分为7组，分别为5％Glu、H-MEL-PSA

分别于荷瘤后第3、6、9、12、15天尾静脉注射给药。对照组给予0.2mL/只的5％Glu，其余组给药剂量为高剂量1.6mg/kg，中剂量0.8mg/kg，低剂量0.4mg/kg(MEL的剂量)。每隔2天记录一次肿瘤长径(a)和短径(b)，计算肿瘤体积及肿瘤抑制率。评价指标为肿瘤体积(Tumor volume，V，mm

表3不同浓度MEL抑制肿瘤体积及抑制率

由表3可知，5％Glu组肿瘤呈现匀速生长的趋势，并没有出现过快或过慢的现象，没有受到外因的影响。MEL-S与MEL各制剂均具有一定的抑瘤效果，且与剂量呈正相关。H-MEL-S肿瘤抑制率为53.2±12.6％，M-MEL-S抑瘤率为38.0±9.8％，L-MEL-S为23.4±38.6％。虽然MEL-S相比于对照组均有一定的抑瘤效果，但没有显著性差异(P>0.05)，也就是说MEL-S针对S180并不能达到治疗效果。H-MEL-PSA

需要特别指出的是，MEL-S各组(高、中、低)第20天，小鼠死亡率均为66.7％；MEL-PSA