一种生物大分子相连胶体金标记超敏纳米颗粒及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于体外诊断技术领域，具体涉及一种生物大分子相连胶体金标记超敏纳米颗粒及其制备方法和应用。

背景技术

目前已知的冠状病毒的强变异株传播力从1名感染者平均传染2-3人提升至1名感染者平均传染8-9人，传播力大大提升；病毒载量也大幅提升，导致重症和危重症比例提到，时间提前；免疫逃逸情况加剧，大量已接种两剂新冠疫苗的人员感染。

因此全球的抗疫形势对于冠状病毒感染的诊断的快速、准确的要求将越来越高。

为应对紧张的疫情，冠状病毒抗原检测试剂研发速度加快，在企业研发速度加快、市场需求持续释放的推动下，全球冠状病毒抗原检测市场规模将进一步扩张，而抗原试剂灵敏度的提升需求越来越受全球诊断试剂厂家的重视。

2021年5月全球著名的评估机构德国保罗埃利希研究所(PEI)发表的《Comparative sensitivity evaluation for 122CE-marked SARS-CoV-2antigen rapidtests》，该研究对全球已获得CE认证的122种冠状病毒抗原快速检测试剂进行灵敏度的评估，报告研究对象基本包含目前国际市场上市场占有率、品牌知名度比较好的几乎所有抗原快速检测产品，包含了胶体金和荧光技术平台，其中不乏罗氏、雅培、西门子等国际著名诊断试剂厂家。因此这份权威报告基本可以代表2021年5月当时世界上新冠抗原快速检测产品的最高水平。其中，国内厂家试剂排名前五结果如下：

国外厂家试剂排名前五结果如下：

综合来看，国内外在冠状病毒抗原快速检测试剂领域的技术水平相差不大。市场上最高水平为有效检测CT＜30样本，CT＞30整体符合率非常差。现有技术中冠状病毒的PCR试剂采用40个循环进行扩展检测，通常认为CT＝36为PCR有效检测的临界值，36个循环(CT＜36)以内特异性非常好，36-40个循环(CT 36-40)灵敏度进一步提高，但特异性会有所下降，存在一定的假阳概率。此外，冠状病毒抗原快速检测试剂对比PCR试剂灵敏度差距巨大，差距在2

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种生物大分子相连胶体金标记超敏纳米颗粒。

本发明的另一目的在于提供上述生物大分子相连胶体金标记超敏纳米颗粒的应用。

本发明的技术方案之一如下：

一种生物大分子相连胶体金标记超敏纳米颗粒，包括纳米核心、纳米胶体金颗粒和生物大分子，纳米胶体金颗粒连接并均匀分布于纳米核心的表面，生物大分子与纳米胶体金颗粒相连，纳米核心的粒径为100-500nm，纳米胶体金颗粒的粒径为15-100nm，其中，

纳米核心上具有活化的-NH

在本发明的一个优选实施方案中，所述纳米核心为纳米硅核心或乳胶微球核心。

在本发明的一个优选实施方案中，所述巯基化合物为1-巯基己酸、硫辛酸、1-巯基十一烷酸、1-巯基十二烷酸、1-巯基十六烷酸或巯基丁二酸。

上述生物大分子相连胶体金标记超敏纳米颗粒在制备体外诊断试剂中的应用。

本发明的技术方案之二如下：

一种生物大分子相连胶体金标记超敏纳米颗粒，包括纳米核心、纳米胶体金颗粒和生物大分子，纳米胶体金颗粒连接并均匀分布于纳米核心的表面，生物大分子与纳米胶体金颗粒相连，纳米核心的粒径为100-500nm，纳米胶体金颗粒的粒径为15-100nm，其中，

纳米核心上具有活化的-COOH，纳米胶体金颗粒上具有通过巯基化合物活化的-NH

上述桥接分子的分子链两端各具有一个

在本发明的一个优选实施方案中，所述纳米核心为纳米硅核心或乳胶微球核心。

在本发明的一个优选实施方案中，所述巯基化合物为半胱胺或1-巯基十一烷胺。

在本发明的一个优选实施方案中，所述桥接分子为BS(PEG)

上述生物大分子相连胶体金标记超敏纳米颗粒在制备体外诊断试剂中的应用。

本发明的技术方案之三如下：

一种生物大分子相连胶体金标记超敏纳米颗粒，包括纳米核心、纳米胶体金颗粒和生物大分子，纳米胶体金颗粒连接并均匀分布于纳米核心的表面，生物大分子与纳米胶体金颗粒相连，纳米核心的粒径为100-500nm，纳米胶体金颗粒的粒径为15-100nm，其中，

纳米核心上具有通过桥接分子活化的-NH

上述桥接分子的分子链两端各具有一个

在本发明的一个优选实施方案中，所述纳米核心为纳米硅核心或乳胶微球核心。

在本发明的一个优选实施方案中，所述巯基化合物为半胱胺或1-巯基十一烷胺。

在本发明的一个优选实施方案中，所述桥接分子为BS(PEG)

上述生物大分子相连胶体金标记超敏纳米颗粒在制备体外诊断试剂中的应用。

本发明的有益效果是：将本发明用于体外诊断试剂，特别是侧流层析试剂的制备，可将侧向层析体外诊断试剂灵敏度大幅度提升，尤其使对冠状病毒抗原侧向层析检测试剂灵敏度最高提升100倍以上，对冠状病毒的有效检测浓度达到CT＝36水平，基本可以媲美核酸检测，大幅度超越全球市场上已在售的所有同类产品，在某些使用场景中，本发明完全可以替代核酸检测来使用。

具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1

(1)将100ml 0.01％氯金酸溶液加热至沸腾，迅速加入0.5ml 1％柠檬酸三钠，氯金酸中的Au

(2)将上述胶体金溶液pH调至9.0，加入0.8ml 1％1-巯基十一烷酸，室温震荡3h，使胶体金纳米颗粒表面羧基化，获得粒径为80nm的羧基胶体金纳米颗粒；

(3)8000rpm 4℃离心10min去除步骤(2)所得的物料中多余的1-巯基十一烷酸，使用纯水复溶离心的方式清洗羧基胶体金纳米颗粒，使用20mM pH6.5 PBS复溶，加入 100ul1％EDC、150ul 1％NHS室温震荡1h，8000rpm 4℃离心10min去除多余的EDC/NHS，使用20mMpH7.4PBS复溶，加入100ul 1％200nm胺基硅颗粒，10℃震荡3h将活化之后的羧基胶体金纳米颗粒化学交联到胺基硅颗粒的表面，3000rpm 4℃离心5min去除未连接的羧基胶体金纳米颗粒，将偶联好的纳米颗粒复溶在20mM pH6.5 PBS中。

(4)在步骤(3)所得的物料中加入100ul 1％EDC、150ul 1％NHS室温震荡1h，，5000rpm 4℃离心10min离心去除多余的EDC/NHS，使用20mM pH7.4PBS复溶，加入 0.5mg冠状病毒抗体(带-NH

(5)对步骤(4)所得的物料进行5000rpm 4℃离心10min离心去上清，使用纯水复溶离心的方式进行清洗2遍，使用5ml金垫包被液复溶，然后包被在胶体金释放垫上， 50℃45min烘干；

(6)使用上样垫、预包被生物大分子相连胶体金标记超敏纳米颗粒的胶体金释放垫、预包被结合蛋白的硝酸纤维素膜、吸水滤纸、基片等材料制作胶体金体外诊断侧向层析装置。

使用本实施例的冠状病毒侧向层析试剂在世界卫生组织认证的13家临床参考实验室之一的孟加拉国际腹泻病研究中心icddr，b进行了冠状病毒临床样本测试，结果如下：

本实施例的生物大分子相连胶体金标记超敏纳米颗粒对比传统胶体金颗粒，灵敏度提高40-60倍，不会受到表面活性剂和盐浓度的影响，干燥状态下也不易脱落，在测试线上参与反应的胶体金颗粒比例超过50％，对比第二代的羧基胶体金颗粒，灵敏度提高20倍，而对比nanocomposix的Ultra-Bright Gold Nanoshell Reporters(参见Increasing theSensitivity of Lateral Flow Diagnostic Assays with Ultra-Bright GoldNanoshell Reporters.)，其波长一致性更稳定，吸收峰在可见光范围，灵敏度提高2倍。

实施例2

(1)将100ml 0.01％氯金酸溶液加热至沸腾，迅速加入0.85ml 1％柠檬酸三钠，氯金酸中的Au

(2)将上述胶体金溶液pH调至9.0，加入0.8ml 1％1-巯基己酸，室温震荡3h，使胶体金纳米颗粒表面羧基化，获得粒径为40nm的羧基胶体金纳米颗粒；

(3)10000rpm 4℃离心10min去除步骤(2)所得的物料中多余的1-巯基己酸，使用纯水复溶离心的方式清洗羧基胶体金纳米颗粒，使用20mM pH6.5 PBS复溶，加入100ul 1％EDC、150ul 1％NHS室温震荡1h，10000rpm 4℃离心10min去除多余的EDC/NHS，使用20mMpH7.4PBS复溶，加入100ul 1％200nm胺基乳胶微球，10℃震荡3h将活化之后的羧基胶体金纳米颗粒化学交联到胺基乳胶微球的表面，5000rpm 4℃离心5min去除未连接的羧基胶体金纳米颗粒，将偶联好的纳米颗粒复溶在20mM pH6.5 PBS中。

(4)在步骤(3)所得的物料中加入100ul 1％EDC、150ul 1％NHS室温震荡1h，，7000rpm 4℃离心10min离心去除多余的EDC/NHS，使用20mM pH7.4PBS复溶，加入 0.5mg重组抗Flu A病毒抗体(带-NH

(5)对步骤(4)所得的物料进行7000rpm 4℃离心10min离心去上清，使用纯水复溶离心的方式进行清洗2遍，使用5ml金垫包被液复溶，然后包被在胶体金释放垫上， 50℃45min烘干；

(6)使用上样垫、预包被生物大分子相连胶体金标记超敏纳米颗粒的胶体金释放垫、预包被结合蛋白的硝酸纤维素膜、吸水滤纸、基片等材料制作胶体金体外诊断侧向层析装置。

用本实施例的方法制备检测FluA的胶体金体外诊断侧向层析装置，其中胶体金颗粒的粒径为40nm，纳米核心为粒径200nm的乳胶微球核心，将步骤(2)中的1-巯基十一烷酸替换为1-巯基己酸。将本实施例的胶体金体外诊断侧向层析装置进行检测，其整体色度提高4-5个色度，灵敏度提高16倍左右。具体结果如下表所示：

其中超敏试剂对应本实施例的胶体金体外诊断侧向层析装置，对照试剂为英科新创生产甲型流行性感冒病毒抗原检测试剂盒(胶体金法)(国械注准20143401923)，可以看出，与对照试剂的平行试验相比，本实施例的灵敏度显著高于对照试剂，特异性无明显差异。

实施例3

(1)将100ml 0.01％氯金酸溶液加热至沸腾，迅速加入0.85ml 1％柠檬酸三钠，氯金酸中的Au

(2)将上述胶体金溶液pH调至9.0，加入0.8ml 1％1-巯基十一烷酸，室温震荡3h，使胶体金纳米颗粒表面羧基化，获得粒径为40nm的羧基胶体金纳米颗粒；

(3)10000rpm4℃离心10min去除步骤(2)所得的物料中多余的1-巯基十一烷酸，使用纯水复溶离心的方式清洗羧基胶体金纳米颗粒，使用20mM pH6.5 PBS复溶，加入100ul1％EDC、150ul 1％NHS室温震荡1h，10000rpm 4℃离心10min去除多余的 EDC/NHS，使用20mM pH7.4PBS复溶，加入100ul 1％120nm胺基硅颗粒，10℃震荡3h 将活化之后的羧基胶体金纳米颗粒化学交联到胺基硅颗粒的表面，4500rpm 4℃离心5min 去除未连接的羧基胶体金纳米颗粒，将偶联好的纳米颗粒复溶在20mM pH6.5 PBS中。

(4)在步骤(3)所得的物料中加入100ul 1％EDC、150ul 1％NHS室温震荡1h，，6000rpm 4℃离心10min离心去除多余的EDC/NHS，使用20mM pH7.4PBS复溶，加入 0.5mg重组抗Flu B病毒抗体(带-NH

(5)对步骤(4)所得的物料进行6000rpm 4℃离心10min离心去上清，使用纯水复溶离心的方式进行清洗2遍，使用5ml金垫包被液复溶，然后包被在胶体金释放垫上， 50℃45min烘干；

(6)使用上样垫、预包被生物大分子相连胶体金标记超敏纳米颗粒的胶体金释放垫、预包被结合蛋白的硝酸纤维素膜、吸水滤纸、基片等材料制作胶体金体外诊断侧向层析装置。

用本实施例的方法制备检测Flu B的胶体金体外诊断侧向层析装置，其中胶体金颗粒的粒径为40nm，纳米核心为粒径120nm的纳米硅核心，将步骤(2)中的1-巯基十一烷酸替换为1-巯基己酸。将本实施例的胶体金体外诊断侧向层析装置进行检测，其整体色度提高4-5个色度，灵敏度提高60倍左右。具体结果如下表所示：

其中超敏试剂对应本实施例的胶体金体外诊断侧向层析装置，对照试剂为英科新创生产乙型流行性感冒病毒抗原检测试剂盒(胶体金法)(国械注准20143401924)，可以看出，与对照试剂的平行试验相比，本实施例的灵敏度显著高于对照试剂。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。