一种高温普鲁兰酶及其制备方法与应用

文献发布时间：2023-06-19 16:04:54

技术领域

本发明涉及采用基因工程手段获得一种高温普鲁兰酶及其制备方法与应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

淀粉是自然界最丰富的多糖聚合物之一，目前被广泛应用于化工、食品、环保等领域。淀粉主要由直链淀粉和支链淀粉组成。直链淀粉是α-1,4糖苷键连接葡萄糖残基形成的线性聚合物，而支链淀粉不仅含有α-1，4糖苷键，还含有α-1,6糖苷键，因而会形成分支结构，这两种淀粉的聚合度都在几千个残基以上。目前工业上用于生产葡萄糖浆的淀粉大多数都含有75～85％的支链淀粉。大多数植物含有60％～90％的支链淀粉，如水稻、玉米、高梁、大麦、豌豆和马铃薯等，在糯米品种中支链淀粉含量高达90％以上。

与传统物理化学方法相比，酶解法降解淀粉多糖更加经济和高效。但是，目前大多数淀粉酶只能单一水解α-1，4糖苷键，因此，在工业生产过程中，由于α-1，6糖苷键的存在，导致淀粉糖化效率极低。

普鲁兰酶是一种淀粉脱支酶，可特异性水解淀粉、普鲁兰糖及相关分支多糖中的α-1，6糖苷键。普鲁兰酶根据底物特异性的不同可分为2大类：Ⅰ型普鲁兰酶和Ⅱ型普鲁兰酶。Ⅰ型普鲁兰酶仅能水解α-(1，6)糖苷键，而Ⅱ型普鲁兰酶能够水解α-(1，4)和α-(1，6)两种糖苷键。Ⅱ型普鲁兰酶是一种双功能酶，这种特性对于提高淀粉糖化效率和产量、降低工业成本具有重要意义。目前在许多微生物中已经发现了各种不同性质的普鲁兰酶。I型普鲁兰酶主要分布在中温微生物中，II型普鲁兰酶主要来源于嗜热微生物，如Geobacillus、Pyrococcus等。目前用于工业生产的II型普鲁兰酶极少，具有高活力和热稳定性好以及耐苛刻工业生产条件的双功能高温普鲁兰酶具有良好的应用前景。

发明内容

本发明的主要目的是针对现有技术的不足，提供一种高温普鲁兰酶(命名为PulTE)及其应用。

所述的酶，蛋白序列如SEQ ID NO:2所示。

所述的酶，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的另一目的，在于提供一种高温普鲁兰酶的制备方法，它包括如下步骤：

(1)普鲁兰酶基因的设计及获得

基于热球菌(Thermococcus sp.MCCC 1A01790)基因组测序数据分析获得普鲁兰酶PulTE基因序列，并对所述基因序列进行优化，使其适合在大肠杆菌中进行表达，通过人工合成的方法获得优化后的普鲁兰酶PulTE基因序列，并添加酶切位点BamHI和XhoI。

(2)重组质粒的构建

人工合成的带有BamHI和XhoI酶切位点的普鲁兰酶基因的DNA片段经限制性内切酶BamHI和XhoI酶切后，被连接到经同样限制性内切酶酶切的表达载体pET-28a(+)上，将连接产物转化大肠杆菌Escherichia coli TOP10受体菌株，筛选含有普鲁兰酶基因的重组质粒，并进行双酶切和测序验证。

(3)普鲁兰酶的表达与纯化

将含有普鲁兰酶基因的重组质粒转化入大肠杆菌E.coli Rosetta受体菌株，用IPTG诱导普鲁兰酶蛋白表达，采用Ni-Sepharose亲和层析(Ni Sepharose

本发明提供的酶的最适温度为80℃，在65～80℃条件下比较稳定，保温8h其酶活力保持80％以上，保温20h其酶活力保持50％以上；该酶在85℃稳定性也较好，保温4h其酶活力保持60％以上；该酶在90℃也具有一定的稳定性，保温2h其酶活力保持60％以上；该酶具有较宽的pH作用范围，最适pH为6.5，在pH5.5～8.0范围内其酶活力保持50％以上；该酶对普鲁兰糖和γ-环糊精有很强的水解作用，可以水解α-(1,4)糖苷键和α-(1,6)糖苷键，是一种双功能酶，属于II型普鲁兰酶，在淀粉资源和普鲁兰糖的加工利用方面具有良好的应用前景；该酶对γ-环糊精水解能力优于麦芽八糖，在麦芽八糖制备方面具有优势。

附图说明

图1为纯化后的酶蛋白的SDS-PAGE电泳；

图2为酶对不同底物水解作用的效果；

图3为不同温度对酶活力的影响；

图4为酶在不同温度条件下的稳定性检测；

图5为不同pH对酶活力的影响；

图6为酶的完全水解产物分析；

图7为酶的开环反应水解产物分析。

具体实施方式

实施例1普鲁兰酶的制备

步骤如下：

实验材料

热球菌(Thermococcus sp.MCCC 1A01790)(中国海洋微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号为1A01790，可通过购买方式得到)，大肠杆菌E.coil TOP10和E.coli Rosetta(购自ThermoFisher公司)；表达载体pET-28a(+)(购自Novagen公司)；限制性内切酶BamHI和XhoI(购自全式金公司)；T4连接酶(购自Takara公司)；LB培养基(每升含1％蛋白胨，0.5％酵母抽提物，1％NaCl)；结合缓冲液(磷酸盐缓冲液：20mM磷酸盐，pH7.4)；漂洗缓冲液(500mM NaCl,10～50mM咪唑，20mM磷酸盐，pH7.4)；洗脱缓冲液(500mM NaCl，500mM咪唑，20mM磷酸盐，pH7.4)；3，5－二硝基水杨酸(DNS)(购自上海生工)；卡那霉素和氯霉素(购自上海生工)；Ni Sepharose

实验步骤(1)普鲁兰酶基因的设计及获得

优化后的编码普鲁兰酶PulTE的核苷酸序列如下：(SEQ ID NO:1)

atgcagaaag aaaatggcgc atggagcatt accgtttgtc tggaaccggg tcgctatgaa 60

tataaatttt ttattaacgg tgagtgggtg aaagatatga gtagcgataa atatggcaat 120

ccggtggacc ctgaagccga tgaatatgtt gatgatggtt ttggtggtaa aaatgcagtg 180

cgcattgttg aaggtaatat gggttttgtt ctggaacata atccgcgtga tccggcatat 240

ctgtgtgtgg ccgataatcg caccgtggtg cgttttaaaa cccgtccggg tcaggttcag 300

agcgcagtgc tggtgaccaa tctgggcgaa tataatatga gcctgcagct gtggtggggt 360

agcggtgaaa tgtggcgtgt tgaactgccg tttgttgaac cgattgaata ttatattaag 420

ctgaccacac ctgataatga agaatttctg gttctgaata ccagtaccga tgcctttttt 480

agctttgatg gtaataatag cttcccgcag gttgaatggg ttagcaaagg cgtgggttat 540

cagatttttc cggaacgctt taataatggc gatccgagta atgatgccct ggcactgcag 600

accgatgaat tttggtttaa tgaactgatt gaggatcgtc cgattctgag taattggagc 660

gatccgatta cacctctgca ttgctgccat cagtattttg gtggtgatat tcgcggcatt 720

attgaaaaac tggattatct gcaggaactg ggcgttacct ttatttatct gaacccgatt 780

tttctggccg gtagcgcaca tggttatgat atttatgatt attaccgcgt ggaccctcag 840

tttggcaccg atgaagatct gaaactgctg ctggaagaag cccataaacg tggcattcgc 900

gtgatttttg attttgttcc gaatcatagc ggcattggtc attgggcatt tctggatgtg 960

gccagtcgcg gtaaagaaag cccgtattgg aattggtatt ttgtgcagaa atggccgttt1020

aaactgggcg atggcaaagc atatattggc tggtggggta ttggcagcct gccgaaactg1080

aataccatga atccggaagt taaagaatat ctgattggtg cagccctgta ttggctggat1140

tttggctttg atggtattcg tgtggatgtt ccgaatgaac tgatcaatgc cgatgaattt1200

tttagtgaac tgcgtcagcg cgttaaagaa aaacatccgg aagcatatat tgtgggcgaa1260

atttggcagc tgagtccgaa atgggttcag ggcgataaat ttgatagtct gatgaattat1320

gccctgggtc gtgatattct gctgaattat gcactgggta cctggaatgg tgaacgcacc1380

ctggaactgc tgggccgtta ttttgccagc tatggtgaaa atgtggcagc aatgggtttt1440

aatctgatta gtagccatga taccagccgc ctgctgaccg atctgggcgg tggccgtttt1500

ggtgaaaatc cgaaaccgga agcaattgaa cgtctgaaaa tgctgagtac cctgctgtat1560

agtctgccgg gcgcacctgt tacctttcag ggtgatgaac gcggtattct gggtgaaaaa1620

gaatattatg atgcccatcg ctatccgatt cagtgggata aagttaatga agaagtgctg1680

acccattata aaggtctggg tatgctgcgc aaacgtattc cggccctgac cagtagcgcc1740

attaaactgt ataccgccaa agatggtgtg attgcctttt ttcgtggcca tgaaaatgaa1800

gttctggttc tggccaataa tggcaaaacc agcaccagca ttgccctgcc gccgggtaaa1860

tggaaactgg tgtggccggc cgaagaaggc atttttgaag gcgaaattga agtgccgccg1920

gttatgaccc tggttctgga acgcgaatga 1950

该酶的氨基酸序列如下：(SEQ ID NO:2)

(2)重组质粒的构建

将人工合成的带有BamHI和XhoI酶切位点的普鲁兰酶基因的DNA片段经限制性内切酶BamHI和XhoI酶切后进行胶回收，并对pET-28a(+)载体也用限制性内切酶BamHI和XhoI进行酶切和胶回收，将酶切后的普鲁兰酶基因的DNA片段和pET-28a(+)载体用T4连接酶进行连接；将连接产物与受体菌E.coli Top10感受态混合，冰上放置30min，42℃热激90s后，加入500μL LB液体培养基，37℃、150rpm复苏45min，离心后涂布于含30μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养，筛选重组质粒，并对重组质粒进行双酶切和测序验证，获得含有普鲁兰酶基因的重组质粒。

(3)基因的诱导表达及粗酶液的制备

将含有普鲁兰酶基因的重组质粒转化入E.coli Rosetta中，获得含有普鲁兰酶基因的重组菌株。将重组菌株接种于5mL含30μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素的LB液体培养基中过夜培养，按1％接种量接种于500mL含卡那霉素和氯霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养至OD

(4)酶的纯化

将制备的粗酶液加入至预先平衡好的His纯化柱Ni Sepharose

实施例2

普鲁兰酶的酶学性质

(1)普鲁兰酶活性测定方法

采用DNS法测定还原糖含量。将50μL稀释的酶液和200μL 1％的普鲁兰糖底物混合，在80℃条件下反应10min。反应完成后加入500μL DNS试剂，煮沸5min，立即置于冰水中冷却，短暂离心后取上清，测定OD

(2)酶的底物特异性

在80℃、pH6.5条件下，分别以1％的普鲁兰糖、可溶性淀粉、直链淀粉、糊精、α环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、支链淀粉和糯米淀粉为底物进行酶活测定，以最大酶活力为100％，计算普鲁兰酶水解不同底物的相对活力。结果表明，该酶对普鲁兰糖水解能力最强，对γ-环糊精也有很强的水解作用，相对酶活力达到95％以上；该酶对可溶性淀粉水解能力也较强，相对酶活力可达60％左右；对糊精、α-环糊精、β-环糊精、支链淀粉和糯米淀粉也有一定的水解作用。结果见图2。

(3)酶的作用温度

将稀释的酶液在40～100℃范围内，以100mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)配制的1％的普鲁兰糖作为底物进行酶活测定，以最大酶活力为100％，计算不同温度下的相对酶活力。结果表明，该酶最适反应温度为80℃，在70～90℃范围内酶活力较高，其相对酶活力均保持70％以上；在65～95℃范围内，其相对酶活力均保持50％以上；该酶在100℃仍有活性，其剩余酶活力为37％。结果见图3。

(4)酶在不同温度条件下的稳定性

将酶液分别在65～80℃条件下共保温36h，每4h测定一次酶活力；将酶液在85℃条件下共保温12h，每1h测定一次酶活力；将酶液在90℃条件下共保温4.5h，每0.5h测定一次酶活力。分别将在不同温度下保温不同时间的酶液与100mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)配制的1％的普鲁兰糖反应进行酶活测定，以未经处理的酶的活力为100％，计算不同处理的酶的相对活力。结果表明，该酶在65～80℃条件下比较稳定，保温4h其酶活力保持90％以上，保温8h其酶活力保持80％以上，保温20h其酶活力保持50％以上；该酶在65℃和70℃分别保温32h和28h，其酶活力仍保持55％以上；该酶在85℃稳定性也较好，保温1h、4h和5h其酶活力分别保持75％、60％和50％以上，保温11h其剩余酶活力仍保持30％以上；该酶在90℃也具有一定的稳定性，保温0.5h、2h和2.5h其酶活力分别保持75％、60％和55％以上，保温3.5h其剩余酶活力仍保持40％以上。结果见图4。

(5)酶的作用pH

将稀释的酶液在80℃下，以不同缓冲液(100mM醋酸钠缓冲液，pH4.0～6.0；100mM磷酸钠缓冲液，pH6.0～8.0；100mM Tris-盐酸缓冲液，pH7.0～9.0；100mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH9.0～10.0)配制的1％的普鲁兰糖作为底物进行酶活测定，以最大酶活力为100％，计算不同pH下该酶的相对活力。结果表明，该酶具有较宽的pH作用范围，最适pH为6.5，在pH5.5～7.0范围内酶活力较高，其酶活力保持78％以上；在pH5.5～8.0范围内，其酶活力保持50％以上；在pH5.0和pH9.0仍保持40％左右的酶活力。结果见图5。

(6)完全水解产物分析

将50μL适量稀释的纯酶加入200μL的含有1％底物(普鲁兰糖、糊精、支链淀粉、直链淀粉、可溶性淀粉和γ-环糊精)的100mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)中，混匀后于80℃条件下过夜反应，采用薄层层析(TLC)法检测普鲁兰酶完全水解产物，上样量为1μL。展开剂为异丙醇：乙酸乙酯：水(3:1:1，v/v/v)，显色剂为N-(1-萘基)乙二胺：硫酸：甲醇(0.3:5:100，w/v/v)。结果显示，该酶可将普鲁兰糖水解为麦芽三糖，将糊精、支链淀粉、直链淀粉、可溶性淀粉和γ-环糊精完全水解为麦芽三糖和麦芽糖，显示该酶既可以水解α-(1,4)糖苷键又能水解α-(1,6)糖苷键，是一种双功能酶，属于II型普鲁兰酶。结果见图6。

(7)开环反应水解产物分析

将100μL纯酶加入至1mL的含有1％γ-环糊精的100mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)中，混匀后于70℃、100rpm条件下分别反应30min和60min，将反应产物适量稀释后采用TLC法检测普鲁兰酶开环水解产物，上样量为1μL。所用展开剂和显色剂均与上述检测完全水解产物所述的展开剂和显色剂一样。结果表明，初始阶段该酶先将γ-环糊精开环生成麦芽八糖，随着反应时间延长，麦芽八糖中间产物累积，显示该酶对γ-环糊精水解能力优于麦芽八糖，在麦芽八糖制备方面具有优势。结果见图7。

序列表

<110> 自然资源部第三海洋研究所

<120> 一种高温普鲁兰酶及其制备方法与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1950

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 1