一种单链抗体扩展库的制备方法及其应用
文献发布时间:2023-06-19 16:06:26
技术领域
本发明属于抗体制备技术领域,尤其涉及一种单链抗体扩展库的制备方法及其应用。
背景技术
CHO表达系统概述:(CHO HCP(Chinese harvest ovary,Host cell protein),又叫做中国仓鼠卵巢细胞,宿主细胞总蛋白。中国仓鼠卵巢细胞被广泛应用于基因工程药物,如乙肝疫苗、人粒细胞集落刺激因子、促红细胞生成素、人组织型纤溶酶原激活剂等表达和生产的真核表达系统。基于CHO表达系统对蛋白翻译后修饰以及蛋白折叠、组装能力,使之广泛应用于重组蛋白和抗体等临床药物制备[Florian M Wurm.Production ofrecombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells[J].NatBiotechnol.2004 Nov;22(11):1393-8]。在抗体药物表达后,随即进行培养上清收集等下游纯化操作。而下游操作的设计主要是宿主细胞总蛋白(Host cell protein,HCP)、核酸(质粒、宿主基因组、RNA)、脂质,和产品相关杂质,可能导致机体产生抗HCP抗体,引起过敏反应,其中残留的有活性蛋白,诸如细胞因子,如转化生长因子β1可由CHO-K1分泌。有可能发生“佐剂效应”,引起机体对抗体药物产生抗体,影响药物治疗效果[Beatson R,Sproviero D,Maher J,Wilkie S,Taylor-Papadimitriou J,Burchell JM:Transforminggrowth factor-b1 is constitutively secreted by Chinese hamster ovary cellsand is functional inhuman cells[J].Biotechnol Bioeng 2011,108:2759-2764]。因此,HCP是生物制品的关键质量属性(CQA),FDA/EMEA/ICH等国际医药组织都对HCP的残留水平作出评价和限定。
Elisa为当下HCP检测的金标准,且2DE/western blot覆盖度结合elisa检测。为了提高检测灵敏度,对检测用的抗体要求较高,目前检测用的抗体主要来源于动物血清抗体,如兔和羊的多抗,而杜洪桥等介绍兔抗体识别HCP条带更多。但是兔抗血清制备过程中存在血量较低,人力、时间成本较高的问题。并且,由于血清含有大量类风湿性因子,过氧化物酶,抗原类似物等,影响Elisa检测效果的因素较多。
由于动物体内B细胞资源有限,而B细胞中抗体能够表达并分泌到血液中的只是小部分,多数可能并未转录或者翻译。这也在客观上造成了抗体识别度缺失。
发明内容
针对现有技术存在的问题,本发明提供了一种单链抗体扩展库的制备方法及其应用,目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
本发明是这样实现的,一种单链抗体扩展库的制备方法,对抗体可变区分析,将不同重链、轻链可变区组合拼接,得到重链-重链、轻链-轻链、重链-轻链的抗体可变区,扩展获得非天然单链抗体扩展库。
进一步地,拼接方式包括:VH-Vκ,VH-Vλ,Vκ-Vκ,Vλ-Vλ,Vκ-Vλ,VH-VH。
进一步地,利用多重PCR技术,使用重链、轻链可变区多种引物组合扩增获得单链抗体扩展库。在抗体文库中,重链或轻链可变区存在多个引物对,分别将H链,或者κ或λ的各自多组F/R引物对集中到一起扩增,可以扩增出多于常规库容量的重链或轻链组。
进一步地,结合噬菌体展示库技术,筛选高亲和性抗体扩展库。
本发明还提供了一种单链抗体扩展库的制备方法在制备单链抗体扩展库中的应用。
进一步地,所述抗体来源于动物血清抗体。
进一步地,所述应用包括CHO HCP检测单链抗体扩展库的制备。
进一步地,将CHO上清HCP蛋白混合物整体作为抗原获取抗体,根据抗体RNA合成cDNA,对抗体可变区分析。
进一步地,将CHO上清HCP蛋白混合物整体作为抗原进行兔免疫获取抗体。
上清HCP抗原广,种类多:第一次质谱鉴定得到2697个蛋白质,形成1281个蛋白质组;第二次质谱鉴定得到2497个蛋白质,形成1202个蛋白质组。经过进一步筛选,最终从两次培养上清样本中鉴定出蛋白质1243个。分子量和等电点的分布趋势见图2和图3:培养上清蛋白质的分子量范围在7.4(Ribosomal protein S28,Q99PF7)~559.5(AHNAK,A0A3L7HVN8)kDa,主要分布在200kDa以内。等电点分布在3.9(ANP32A,A0A3L7HQ41)~11.1(Histone H2A type 1,G3HDT6),集中分布在4~10。
多重PCR:以抗体可变区cDNA文库为模板,使用重轻链多种引物组合扩增方式,也包括重链和不同轻链引物扩增产物的组合作为模板。见图19。
抗体扩展库:通过不同抗体可变区组合拼接方式,创造出常规重链-轻链(H-L)文库之外的,自然界不存在的重链-重链(H-H),轻链-轻链(κ-κ,λ-λ)的抗体可变区。进一步扩展抗体可变区的文库称之为抗体扩展库。见图18。
综上所述,本发明的优点及积极效果为:
一.
二.
三.
四.
五.
附图说明
图1:CHO中国仓鼠卵巢贴壁细胞(左图)与驯化后悬浮细胞(右图):左图贴壁细胞为梭形或者多边形,右侧悬浮细胞为球状或者葡萄球状,表示驯化正常。
图2:CHO HCP SDS-PAGE考染胶图:清晰条带为16条,分子量大小130-17kDa,与文献报道一致。
图3:细胞培养上清蛋白质的质谱检测总离子流图;A:第一次质谱检测;B:第二次质谱检测。
图4:上清蛋白质分子量及等电点分布:分子量跨度大,等电点从pH=4到pH=12,范围广。
图5:CHO HCP免疫新西兰大白兔效价:效价接近10
图6:兔外周血淋巴细胞密度梯度离心:可见中间白色单核细胞层,50ml血液,单核细胞得10
图7:多重PCR扩增抗体可变区重链(VH)、轻链(Vκ、Vλ)基因电泳图:多重PCR得到清晰重轻链总条带,使用重轻链单独引物扩增,可见重链1-6组,和轻链7-30组,大小为400bp左右。
图8:拼接后单链抗体ScFv电泳图:组装后的大小约900bp,据图可见,条带清晰。
图9:ScFv连接后载体转化平板图:设置阴性对照,转化效果较好。
图10:单克隆质粒Sfi1酶切电泳图:酶切后插入条带大致在1kbp,符合预期。
图11:H-H ScFv测序结果blast分析:重链鉴定(左图),框架区,可变区结构分析(右图)。
图12:L-L ScFv测序结果blast分析:轻链鉴定(左图),框架区,可变区结构分析(右图)。
图13:FR1:测序结果与原始数据匹配,重链轻链均能够在原始数据库中找到(该图片用于证明测序结果能够在原始数据中找到,图片的清晰度和完整度对技术方案的理解没有影响)。
图14:ScFv诱导表达WB验证(HA tag单抗):HA抗体可以识别诱导后的ScFv,分子量大小符合预期。
图15:HCP二维电泳银染(左图),血清抗体对HCP WB结果(右图):识别点有45.5%。
图16:HCP二维电泳银染(左图),重组ScFv对HCP WB结果(右图):识别点有60%,且点清晰。总覆盖度远高于血清抗体覆盖度。
图17:兔抗体可变区获得流程图:流程是:收集抗原,免疫,收取脾细胞,RNA抽提,免疫组库测序(该图中免疫组测序的表格截图主要用于对工艺步骤进行说明,该图片的清晰度和完整度对技术方案的理解没有影响)。
图18:非天然抗体可变区构建示意图:ScFv形式分别有VH-Vκ,VH-Vλ,Vκ-Vκ,Vλ-Vλ,Vκ-Vλ,VH-VH,共6种组合方式。
图19:多重PCR组合方式示意图:单独可变区PCR有6种引物配对方式。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明,各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明,均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
根据本申请包含的信息,对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变,而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解,本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分,因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上,本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围,在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值,在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此,除非特别说明,否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值,其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中,“约”指给定值或范围的10%以内,优选为5%以内。
本发明披露了一种单链抗体扩展库的制备方法及其应用。
下面将结合本发明实施例,对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例
CHO Culture medium HCP制备:将CHO
动物免疫:使用大白兔免疫,兔免疫程序为:兔子背部皮下,大腿肌肉注射1-10mg的弗氏佐剂乳化的HCP蛋白抗原,3-7次免疫,每次间隔2周至数天不等,方式和剂量等同于初免,每次免疫后1周兔耳静脉采血100ul,Elisa效价检测。最终免疫完成后,心脏采血,心脏采全血到抗凝管。免疫后抗血清效价为:在相同的稀释倍数下,空白对照OD
磁珠法分选特异性淋巴B细胞,获得靶抗体RNA:
1.将经过Ficoll密度梯度离心后的单核细胞,见图6,1.0×10
2.将细胞悬液与100ul含有Protein A磁珠悬液混合,室温颠倒孵育15min;
3.放置磁力架上,吸附5min,弃上清;
4.加入binding缓冲液,轻柔混匀后,再次磁力吸附5min,弃上清;
5.将吸附有膜表面IgG表达的淋巴细胞,抽提总RNA,免疫组库测序,获得靶抗体可变区序列;见图17。
提取总RNA的浓度750ng/ul,A260/280=1.95。合成抗体可变区cDNA文库的具体过程为:在PCR管中依次加入总RNA,RNase-free ddH
多重PCR制备重轻链抗体可变区组合,扩展抗原识别能力:根据免疫组库抗体可变区分析,获得重链H(2.2579×10
表1引物设计
使用Hieff
表2扩增体系及程序
将6种重链与8种轻链,两两匹配组装,获得多样的ScFv抗体库,组装程序和体系如下:95℃/10min,58℃/1min,[95℃/30s-58℃/30s-72℃/45s]×35cycle,72℃/5min,4℃/∞。结果见图8。
表3抗体可变区组装程序
利用Sii1内切酶对组装后的ScFv,以及pComb3Xss载体,在50℃条件下酶切3h,分别对900bp ScFv和3400bp pComb3XSS大小条带进行胶回收,T4酶或者重组酶,12-16℃条件下,连接过夜。通过2500V,20ms间隔,1脉冲条件下,电转TG1感受态细胞,SOC培养基摇床震荡1h,涂布90ug/ml Amp平板。37℃过夜后,细胞刮刮下所有单克隆,见图9,图10,制备抗体可变区的DNA文库。并分析可变区,见图11,12,13。
表4酶切体系
表5连接体系
结合噬菌体展示库技术,筛选高亲和性抗体扩展库:将重组后的单链抗体扩展库,结合辅助噬菌体包装成噬菌体,进行免疫淘洗5个循环,筛选亲和性高的噬菌体展示库抗体序列。
噬菌体库的制备:
使用2×YT培养基(含2%葡萄糖)培养含抗体文库TG1菌株,在37℃、225rpm震荡培养至菌液OD600nm为0.6;然后将菌液转移至含有90ug/ml氨苄抗生素浓度的2×YT液体培养基中,再加入数目为1×1011pfu的辅助噬菌体M13K07,于37℃,225rpm/min,60min震荡培养;4000rpm,30min离心,得到沉淀;更换培养液,37℃,225rpm/min,继续震荡培养12-16h;4000rpm/min,4℃,30min离心收集YT培养基中上清,并加入1/4体积PEG/NaCl溶液,混匀后冰浴1.5h;12000g,4℃离心30min,弃上清,沉淀重悬使用5ml 2×YT液体培养基,0.45um滤膜过滤,收集噬菌体滤过液;
淘洗方法:
使用pH=9.5碳酸盐缓冲液稀释HCP至8ug/ml,取2ml包被免疫管,4℃过夜包被,次轮及第三轮抗原包被浓度分别等倍下降至4ug/ml和2ug/ml;PBST洗涤后,加入5ml 5%脱脂牛奶,37℃封闭1h;加入5ml 5%脱脂牛奶稀释的噬菌体上清,室温孵育30min;向免疫管中再次加入封闭后的噬菌体上清,37℃孵育2h;弃上清液,将5ml含有1/1000吐温20的PBS清洗免疫管(后期数轮分别增加吐温20的比例为2/1000和5/1000),甩干;加入低pH=2.8的甘氨酸洗脱液,室温下225rpm/min震荡洗脱10min,并立即加入pH=9.0Tris-HCl中和缓冲液,将pH中和至7.4左右,混匀后收集洗脱液;向新的免疫管中加入对数生长期的TG1菌,并与含有噬菌体的洗脱液合并于37℃,150rpm/min,震荡培养1h,得到一级抗体库;在混合培养后的一级库中,取10ul,并用2×YT液体培养基分别稀释100倍、1000倍和10000倍,并取100ul分别涂布SOBAG固体平板,于30℃培养箱中过夜培养,并计算单克隆数量,确定噬菌体感染量;向一级抗体库中,加入终浓度为50ug/ml的氨苄抗生素,37℃,225rpm/min震荡培养1h;加入终浓度到2%的葡萄糖溶液,并加入1×10
抗体扩展库的表达与验证:在TG1中,1mM IPTG诱导20℃,4h。收集菌体,超声破碎,过Ni柱层析ScFv。使用HA标签抗体,垂直电泳WB验证表达,见图14。并使用ScFv结合HCP 2D电泳分析,比较与血清抗体覆盖度。见图15,16。
图15:HCP二维电泳银染(左图),血清抗体对HCP WB结果(右图):识别点有45.5%。
图16:HCP二维电泳银染(左图),重组ScFv对HCP WB结果(右图):识别点有60%,且点清晰。总覆盖度远高于血清抗体覆盖度。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
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- 一种单链抗体扩展库的制备方法及其应用
- 一种白血病单链抗体库及其构建方法和应用