一种检测泰妙菌素的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及兽药残留检测技术领域，具体地，涉及一种检测泰妙菌素的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用。

背景技术

泰妙菌素(Tiamulin，TML)是截短侧耳类药物，为畜禽专用抗生素，对细菌、螺旋体和支原体等具有良好的抗菌活性，常用于防治鸡的慢性呼吸道疾病、猪的疟疾和支原体引起的各种畜禽疾病，治疗效果显著。但其残留于畜禽食品中，被人体长期摄入后会造成胃肠道菌群紊乱，引起过敏反应，增加患癌风险。TML的不规范使用所导致的药物残留问题，将给人类健康、生态平衡和社会经济等带来潜在威胁。我国2019年发布的GB 31650-2019《食品中兽药最大残留限量的国家标准》中明确规定泰妙菌素的最大残留限量为0.1～1mg/kg。因此，开发有效的快速检测泰妙菌素方法对监控畜禽食品质量安全尤为重要。

目前，针对泰妙菌素的检测方法有多种，包括含高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS/MS)、超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)等在内的仪器分析方法、光谱检测法以及免疫分析法等。仪器方法灵敏度高、特异性强，但需要昂贵的设备、专业的操作人员和繁琐的样品前处理过程，不适合大量样本的快速筛查；免疫分析技术作为大型仪器验证分析的重要互补检测技术，已得到广泛发展，其中免疫层析方法以其简便快捷、可现场检测等优点，备受市场青睐。免疫层析法是将免疫和色谱层析技术相结合的检测方法，以标记物标记的抗体与目标待测物特异性结合为基础并通过标记物信号实现定性或定量的目的。该方法检测时间短，使用方便，前处理简单，成本低，检测效果能满足需求，适合用于食品样品的现场检测。

检测TML在食品样品中残留的免疫层析检测方法主要为胶体金免疫层析法，关于TML的时间分辨荧光微球免疫层析检测方法尚无报道，而且目前涉及的检测样品较为单一，主要为肌肉和肝脏，对于鸡蛋样品中TML的检测报道相对较少。因此，亟待开发一种针对鸡蛋、鸡肉和猪肉等多种食品样品中TML药物残留的快速检测方法。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的上述不足，提供一种检测泰妙菌素的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用。

本发明的第一个目的是提供一种时间分辨荧光微球探针的制备方法。

本发明的第二个目的是提供所述制备方法制备得到的时间分辨荧光微球探针。

本发明的第三个目的是提供一种时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备方法。

本发明的第四个目的是提供所述制备方法制备得到的时间分辨荧光免疫层析试纸条。

本发明的第五个目的是提供所述时间分辨荧光微球探针和/或所述时间分辨荧光免疫层析试纸条在制备检测泰妙菌素产品中的应用。

本发明的第六个目的是提供一种检测泰妙菌素的试剂盒。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一种时间分辨荧光微球探针的制备方法，所述制备方法的步骤如下：

S11：溶解：混合时间分辨荧光微球和MES缓冲溶液，充分混匀；

所述时间分辨荧光微球的粒径为100～300nm，所述MES缓冲溶液pH为5～7；

S12：活化：36.5～37.5℃条件下活化步骤S11 MES缓冲溶液溶解的时间分辨荧光微球的羧基基团；

S13：标记：混合步骤S12活化的时间分辨荧光微球、硼酸盐缓冲液和泰妙菌素抗体稀释液，充分混匀，得到泰妙菌素抗体标记的时间分辨荧光微球；

所述泰妙菌素抗体与时间分辨荧光微球的质量比为0.5～1.5：50，所述泰妙菌素抗体稀释液由硼酸盐缓冲液稀释泰妙菌素抗体得到；

S14：封闭，得到泰妙菌素抗体标记的时间分辨荧光微球探针。

优选地，步骤S11所述时间分辨荧光微球的粒径为100～200nm。

更优选地，所述步骤S11所述时间分辨荧光微球的粒径为100nm。

优选地，步骤S11所述MES缓冲溶液pH为5～6。

更优选地，所述步骤S11所述MES缓冲溶液pH为5.5。

优选地，步骤S11中，混合时间分辨荧光微球和MES缓冲溶液，涡旋震荡9～11s后超声1～2min，14500～15500rpm离心14～16min，弃上清，用MES缓冲溶液复溶，超声1～2min，得到时间分辨荧光微球MES溶液；

所述时间分辨荧光微球的浓度为8～12mg/mL，所述MES缓冲溶液的浓度为0.04～0.06mol/L，复溶前所述时间分辨荧光微球和MES缓冲溶液的比值为1μg：0.5～1.5μL，复溶与复溶前所用MES缓冲溶液体积相同；

更优选地，步骤S11中，混合时间分辨荧光微球和MES缓冲溶液，涡旋震荡10s后超声1min，15000rpm离心15min，弃上清，用MES缓冲溶液复溶，超声1min，得到时间分辨荧光微球MES溶液；

所述时间分辨荧光微球的浓度为10mg/mL，所述MES缓冲溶液的浓度为0.05mol/L，复溶前所述时间分辨荧光微球和MES缓冲溶液的比值为1μg：1μL，复溶与复溶前所用MES缓冲溶液体积相同。

优选地，步骤S12中，混合步骤S11时间分辨荧光微球MES溶液、NHS溶液和EDC溶液，36.5～37.5℃550～650rpm条件下恒温培养、摇床振荡活化14～16min，在2～4℃条件下14500～15500rpm离心14～16min，弃上清，得到活化羧基基团的时间分辨荧光微球；

所述NHS溶液的浓度为0.08～0.12mg/mL，所述EDC溶液的浓度为0.08～0.12mg/mL，所述时间分辨荧光微球MES溶液、NHS溶液和EDC溶液的体积比为39～41：5～7：4～6。

更优选地，步骤S12中，混合步骤S11含有时间分辨荧光微球的MES溶液、NHS溶液和EDC溶液，37℃600rpm条件下恒温培养、摇床振荡活化15min，在4℃条件下15000rpm离心15min，弃上清，得到活化羧基基团的时间分辨荧光微球；

所述NHS溶液的浓度为0.1mg/mL，所述EDC溶液的浓度为0.1mg/mL，所述含有时间分辨荧光微球的MES溶液、NHS溶液和EDC溶液的体积比为40：6：5。

优选地，所述步骤S13所述泰妙菌素抗体稀释液由0.008～0.012mol/L硼酸盐缓冲液稀释泰妙菌素抗体得到。

更优选地，所述步骤S13所述泰妙菌素抗体稀释液由0.01mol/L硼酸盐缓冲液稀释泰妙菌素抗体得到。

所述泰妙菌素抗体与时间分辨荧光微球的质量比为1：50，所述泰妙菌素抗体稀释液由硼酸盐缓冲液稀释泰妙菌素抗体得到。

优选地，步骤S13中，混合步骤S12活化羧基基团的时间分辨荧光微球和硼酸盐缓冲液，超声重悬并涡旋均匀后，混合泰妙菌素抗体稀释液，涡旋混匀后置于23～27℃550～650rpm条件下恒温培养、摇床振荡标记18～22min，得到泰妙菌素抗体标记的时间分辨荧光微球；

所述硼酸盐缓冲液的pH为7.5～8.5，浓度为0.04～0.06mol/L，所述泰妙菌素抗体的浓度为0.8～1.2mg/mL，所述活化的时间分辨荧光微球、硼酸盐缓冲液体积和泰妙菌素抗体的比值为50μg：50μL：0.5～1.5μg。

更优选地，步骤S13中，混合步骤S12活化羧基基团的时间分辨荧光微球和硼酸盐缓冲液，超声重悬并涡旋均匀后，混合泰妙菌素抗体，涡旋混匀后置于25℃600rpm条件下恒温培养、摇床振荡标记20min，得到泰妙菌素抗体标记的时间分辨荧光微球；

所述BB缓冲液pH为8，所述泰妙菌素抗体的浓度为1mg/mL，所述活化的时间分辨荧光微球、BB缓冲液和泰妙菌素抗体的比值为50μg：50μL：1μg。

优选地，步骤S14中，混合步骤S13泰妙菌素抗体标记的时间分辨荧光微球和BSA溶液，超声重悬1～2min后置于23～27℃550～650rpm条件下恒温振荡封闭18～22min，2～4℃14500～15500rpm离心14～16min，弃上清，得到封闭后的泰妙菌素抗体标记的时间分辨荧光微球；

所述BSA溶液的浓度为19～21％(w/v)，所述泰妙菌素抗体标记的时间分辨荧光微球和BSA溶液的比值为1μg：3～7μL。

更优选地，步骤S14中，混合步骤S13泰妙菌素抗体标记的时间分辨荧光微球和BSA溶液，超声重悬1min后置于25℃600rpm条件下恒温振荡封闭20min，4℃15000rpm离心15min，弃上清，得到封闭后的泰妙菌素抗体标记的时间分辨荧光微球；

所述BSA溶液的浓度为20％(w/v)，所述泰妙菌素抗体标记的时间分辨荧光微球和BSA溶液的比值为1μg：5μL。

所述制备方法制备得到的时间分辨荧光微球探针。

一种时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备方法，所述制备方法的步骤如下：

S21：划膜：将0.25～1mg/mL的泰妙菌素抗原TML-O-OVA划到时间分辨荧光免疫层析试纸条的NC膜T线上，作为包被原；将0.28～0.4mg/mL的羊抗鼠IgG划到NC膜C线上，作为二抗；

所述泰妙菌素抗原TML-O-OVA的结构式如式Ⅰ所示：

S22：处理样品垫：将时间分辨荧光免疫层析试纸条的玻璃纤维膜浸泡于样品垫处理液中，充分浸泡后取出玻璃纤维膜，烘干备用，所述样品垫处理液为0.1％～0.4％Tween-20溶液；

S23：组装试纸条。

优选地，步骤S21中，将0.5～1mg/mL的泰妙菌素抗原TML-O-OVA划到时间分辨荧光免疫层析试纸条的NC膜T线上；将0.28～0.36mg/mL的羊抗鼠IgG划到NC膜C线上。

更优选地，步骤S21中，将0.5mg/mL的泰妙菌素抗原TML-O-OVA划到时间分辨荧光免疫层析试纸条的NC膜T线上；将0.36mg/mL的羊抗鼠IgG划到NC膜C线上。

优选地，步骤S22中，检测鸡肉样品所用样品垫处理液为0.1～0.3％Tween-20溶液，检测蛋类和/或猪肉样品所用样品垫处理液为0.3％～0.4％Tween-20溶液。

更优选地，步骤S22中，检测鸡肉样品所用样品垫处理液为0.2％Tween-20溶液，检测蛋类和/或猪肉样品所用样品垫处理液为0.4％Tween-20溶液。

所述制备方法制备得到的时间分辨荧光免疫层析试纸条。

所述时间分辨荧光微球探针和/或所述时间分辨荧光免疫层析试纸条在制备检测泰妙菌素产品中的应用。

一种检测泰妙菌素的试剂盒，所述试剂盒中含有所述时间分辨荧光微球探针、所述时间分辨荧光免疫层析试纸条和样品稀释液，所述样品或泰妙菌素标准品样品稀释液含有0.1～0.3mol/LPB溶液。

优选地，所述样品稀释液含有0.2mol/LPB溶液。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公开了一种检测泰妙菌素的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用。时间分辨荧光免疫层析方法(TRFICA)以镧系元素离子螯合物为示踪物，能有效消除由生物材料短寿命自荧光引起的背景干扰，灵敏度高、稳定性好、样品前处理简单，准确性强，是一种较为理想的快速检测方法。以铕-(Eu-)荧光纳米粒子为示踪物标记泰妙菌素单克隆抗体，选择合适的荧光微球粒径，活化缓冲溶液的pH值，抗体稀释液和抗体用量，制备标记泰妙菌素单克隆抗体的时间分辨荧光微球探针，能有效提高时间分辨荧光微球与泰妙菌素单克隆抗体的结合效率，促进标记抗体的时间分辨荧光微球探针在试纸条上的释放，提高其检测灵敏度，减少抗原、抗体用量，适用于检测鸡蛋、鸡肉和猪肉等不同样品中的泰妙菌素。本发明所述的样品前处理方法简单，仅需一次提取并稀释即可完成样品前处理操作，对鸡蛋、鸡肉和猪肉等样品中的泰妙菌素裸眼检测限为0.5ng/mL，定量检测限为0.07～0.13ng/mL，回收率为75.0％～101.8％，标准偏差为2.2％～29.5％，该方法操作简单、效率高，短时间内即可完成检测。

附图说明

图1为泰妙菌素抗原TML-O-OVA的化学结构。

图2为泰妙菌素时间分辨荧光免疫层析试纸条结构。

图3为时间分辨荧光免疫层析方法检测样品中泰妙菌素的原理图。

图4为时间分辨荧光微球粒径对活化的影响。

图5为不同pH的MES缓冲溶液对活化的影响：A为试纸条测试图，B为标准曲线。

图6为抗体稀释液对活化的影响：A为试纸条测试图，B为标准曲线。

图7为抗体用量对活化的影响：A为试纸条测试图，B为标准曲线。

图8为探针用量对活化的影响：A为试纸条测试图，B为标准曲线。

图9为标准品稀释液对跑样效果的影响：A为试纸条测试图，B为标准曲线。

图10为包被原和二抗对跑样效果的影响：A为试纸条测试图，B为标准曲线。

图11样品垫处理液对各类样品跑样效果的影响：A、B表示样品垫处理液对鸡蛋样品的影响，其中A为试纸条测试图，B为标准曲线；C、D为样品垫处理液对鸡肉样品的影响，其中C为试纸条测试图，D为标准曲线；E、F为样品垫处理液对猪肉样品的影响，其中E为试纸条测试图，F为标准曲线。

图12为时间分辨荧光微球免疫层析法特异性反应结果。

图13为各鸡蛋、鸡肉和猪肉基质中TRFICA的灵敏度结果：A为试纸条测试图，B为标准曲线。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

抗原TML-O-OVA由本实验室自制；泰妙菌素单克隆抗体由本实验室自制；时间分辨荧光微球溶液于Bangs公司购买。

实施例1标记泰妙菌素单克隆抗体的时间分辨荧光微球探针的制备方法

1、溶解：将20μL10 mg/mL粒径为100nm的时间分辨荧光微球溶于200μL0.05mol/LpH为5.5的MES缓冲溶液，时间分辨荧光微球为铕

2、活化：混合步骤1得到的时间分辨荧光微球MES溶液、30μL 0.1mg/mL NHS溶液和25μL 0.1mg/mL EDC溶液，37℃600rpm条件下恒温培养、摇床振荡活化15min，随后在4℃条件下15000rpm离心15min弃去上清，得到活化羧基基团的时间分辨荧光微球。

3、标记：混合步骤2活化羧基基团的时间分辨荧光微球和200μL0.05 mol/LpH为8.0的BB缓冲液，超声重悬并涡旋均匀；再混合4μL泰妙菌素抗体稀释液，所述泰妙菌素抗体稀释液为用0.01mol/L BB溶液稀释泰妙菌素抗体浓度至1mg/mL，所述泰妙菌素抗体的制备方法参见专利CN112939832A；涡旋混匀后置于25℃600rpm条件下恒温培养、摇床振荡标记20min，得到标记泰妙菌素抗体的时间分辨荧光微球。

4、封闭：混合步骤3得到的标记泰妙菌素抗体的时间分辨荧光微球和1mL的20％(w/v)BSA溶液，超声重悬1min后置于25℃600rpm条件下恒温振荡封闭20min，4℃15000rpm离心15min弃去上清，得到封闭的标记泰妙菌素抗体的时间分辨荧光微球。

5、重悬：混合步骤4封闭的标记泰妙菌素抗体的时间分辨荧光微球和200μL复溶液，超声重悬即得到标记泰妙菌素单克隆抗体的时间分辨荧光微球探针，4℃保存待用，最终得到的标记泰妙菌素单克隆抗体的时间分辨荧光微球探针的浓度为1μg/μL，复溶液为pH＝7.4的0.02mol/L PB溶液，其中还含有10％Tween-20(v/v)、5％蔗糖(w/v)、0.5％BSA(w/v)、10％PVP(v/v)和3％procline-300(v/v)。

实施例2检测泰妙菌素试剂盒

一、检测泰妙菌素的试剂盒的制备方法

1.泰妙菌素时间分辨荧光微球免疫层析试纸条的制备方法

(1)划膜：用含有0.15mol/L NaCl的pH为7.4的0.02mol/L PB溶液，分别稀释泰妙菌素抗原TML-O-OVA(结构式见图1)和羊抗鼠IgG，稀释后泰妙菌素抗原TML-O-OVA的浓度为0.5mg/mL，羊抗鼠IgG的浓度为0.36mg/mL。通过喷金划膜仪分别将0.5mg/mL的泰妙菌素抗原TML-O-OVA划到NC膜T线上，作为包被原；将0.36mg/mL羊抗鼠IgG划到NC膜C线上，作为二抗，泰妙菌素抗原TML-O-OVA和羊抗鼠IgG的划膜用量为0.9μL/cm，划好后放入37℃烘箱干燥14h，并在阴凉干燥处密封保存备用。

(2)处理样品垫：将玻璃纤维膜浸泡于样品垫处理液中，充分浸泡后取出玻璃纤维膜，垂直放置至其无液体滴落；将其水平放置于37℃的烘箱中烘干14h，在干燥阴凉处密封保存备用。其中，适用于鸡肉的样品垫处理液为0.2％Tween-20(v/v)溶液，适用于猪肉和鸡蛋的样品垫处理液为0.4％Tween-20溶液(v/v)。

(3)组装试纸条：在PVC板上贴上步骤1制备的NC膜，NC膜的一端与步骤2处理的样品垫重叠1～2mm，另一端与吸水纸重叠1～2mm，组装好后裁剪为宽度为3.5mm的条状备用，即得泰妙菌素时间分辨荧光免疫层析试纸条。图2为泰妙菌素时间分辨荧光免疫层析试纸条结构。

2.时间分辨荧光微球样品槽的制备方法

将实施例1制备的标记泰妙菌素单克隆抗体的时间分辨荧光微球探针复溶后以5μL/孔的量加入酶标孔中，干燥后密封备用。

二、检测泰妙菌素的试剂盒的组成

由上述检测泰妙菌素的试剂盒的制备方法制备得到检测泰妙菌素的试剂盒。

实施例3时间分辨荧光免疫层析方法(TRFICA)检测鸡蛋、鸡肉和猪肉样品中泰妙菌素(TML)

1、各类样品的前处理方法：分别称取1.0g均质后的鸡蛋、鸡肉或猪肉样品于50mL离心管中，鸡蛋样品加入5mL 0.2mol/L PB溶液，鸡肉样品加入5mL含20％甲醇的0.2mol/LPB溶液，猪肉样品加入5mL含50％甲醇的0.2mol/L PB溶液，涡旋振荡3min后，4500rpm离心5min，避开沉淀取上清提取液。

2、消除基质效应：用0.2mol/L PB溶液稀释步骤1中的上清提取液至消除基质效应，得到消除基质效应的样品提取液。其中，将鸡蛋提取液稀释8倍，得到鸡蛋提取稀释液；鸡肉或猪肉提取液分别稀释6倍，得到鸡肉或猪肉提取稀释液。将消除基质效应的样品提取稀释液加入实施例2制备的时间分辨荧光微球样品槽中，吹打均匀后孵育2min，再将实施例2制备的泰妙菌素时间分辨荧光免疫层析试纸条的样品垫端插入样品槽中，反应8min后将试纸条取出，放入时间分辨免疫定量分析仪中读数，判断检测结果。

3、建立标准曲线：用消除基质效应后的泰妙菌素阴性的样本提取稀释液将TML标准品按照0、0.1、0.25、0.5、1、1.25、1.5、2.5和5ng/mL的梯度进行稀释，各浓度取100μL，加入实施例2制备的时间分辨荧光微球样品槽中，孵育2min，再将实施例2制备的泰妙菌素时间分辨荧光免疫层析试纸条的样品垫端插入样品槽中，反应8min后将试纸条取出，放入时间分辨免疫定量分析仪中读数，建立各基质中TML的TRFICA标准曲线。以添加浓度为横坐标，以T/C荧光比值为纵坐标，拟合标准曲线。

4、判定方法：(1)定性判定法：在紫外仪下观察，若T和C线均有显色，则是不含有TML的阴性样本；若C线显色、T线不显色，则是含有TML的阳性样本；(2)定量判定法：使用时间分辨免疫定量分析仪测定T和C线下的荧光强度，T/C为纵坐标，以添加TML标准品浓度为横坐标建立标准曲线，进行定量检测。

图3为时间分辨荧光免疫层析方法检测样品中泰妙菌素的原理图，游离的待检物TML与标记泰妙菌素单克隆抗体的时间分辨荧光微球探针在微孔中反应一段时间后，插入实施例2制备的泰妙菌素时间分辨荧光微球免疫层析试纸条，在毛细作用下试纸条上的样品向吸水垫方向层析，没有和药物结合的标记泰妙菌素单克隆抗体的时间分辨荧光微球探针再移动至固定抗原的区域，使T线出线；标记泰妙菌素单克隆抗体的时间分辨荧光微球探针和待检物形成的结合物与NC膜上的羊抗鼠特异性结合使C线出线，将试纸条装入卡槽内在紫外灯照下裸眼观察显色结果并插入读卡仪进行定量记录。

实施例4各条件对时间分辨荧光免疫层析方法(TRFICA)的影响

一、实验方法

用0.2mol/L PB溶液作为标准品稀释液，将泰妙菌素(TML)梯度稀释为0、0.1、0.25、0.5、1、1.25、1.5、2.5和5ng/mL，按照实施例3的方法进行检测，建立标准曲线，每个浓度梯度重复3次，取其平均值，以添加浓度为横坐标，以T/C荧光比值为纵坐标，拟合标准曲线，计算IC

1、时间分辨荧光微球粒径对时间分辨荧光免疫层析方法(TRFICA)的影响

用不同粒径(100nm、200nm和300nm)的时间分辨荧光微球，按照实施例1的方法制备标记泰妙菌素单克隆抗体的时间分辨荧光微球探针，按照实施例3的方法进行检测。

2、活化pH值对时间分辨荧光免疫层析方法(TRFICA)的影响

用不同pH(pH＝5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)的0.05mol/L的MES缓冲液，其他步骤按照实施例1的方法制备标记泰妙菌素单克隆抗体的时间分辨荧光微球探针，按照实施例3的方法进行检测。

3、抗体稀释液对时间分辨荧光免疫层析方法(TRFICA)的影响

在实施例1的标记步骤，用6种不同的缓冲液：0.01mol/L PB、含有0.5％BSA的0.01mol/L PB、0.01mol/L BB、含有0.5％BSA的0.01mol/L BB、0.5％BSA、H

4、抗体用量对时间分辨荧光免疫层析方法(TRFICA)的影响

将原始浓度为3.6mg/mL的TML抗体用0.01mol/L BB稀释为1mg/mL，分别添加2、4、6、8和10μL泰妙菌素抗体与时间分辨荧光微球偶联，其他步骤按照实施例1的方法制备标记泰妙菌素单克隆抗体的时间分辨荧光微球探针，按照实施例3的方法进行检测。

5、探针用量对时间分辨荧光免疫层析方法(TRFICA)的影响

按照实施例2的方法制备时间分辨荧光微球样品槽，酶标孔中分别添加2、3、4、5和6μL/孔的标记泰妙菌素单克隆抗体的时间分辨荧光微球探针，其他步骤按照实施例3的方法进行检测。

6、样品稀释液对时间分辨荧光免疫层析方法(TRFICA)的影响

选择五种不同离子浓度的样品稀释液(0.05、0.1、0.2、0.3、0.4mol/L PB)稀释TML，其他步骤按照实施例3的方法进行检测。

7、包被原及二抗浓度对时间分辨荧光免疫层析方法(TRFICA)的影响

用不同的抗原浓度包被在CT线上，其中，T线：1mg/mL泰妙菌素抗原TML-O-OVA，C线：0.36mg/mL羊抗鼠IgG；T线：0.5mg/mL泰妙菌素抗原TML-O-OVA，C线：0.36mg/mL羊抗鼠IgG；T线：0.25mg/mL泰妙菌素抗原TML-O-OVA，C线：0.28mg/mL羊抗鼠IgG；T线：0.17mg/mL泰妙菌素抗原TML-O-OVA，C线：0.25mg/mL羊抗鼠IgG。再按照实施例2的方法制备泰妙菌素时间分辨荧光免疫层析试纸条，其他步骤按照实施例3的方法进行检测。

8、样品垫处理液对时间分辨荧光免疫层析方法(TRFICA)的影响

向水中添加Tween-20作为样品垫处理液，设置4个梯度的吐温添加量(0.1％、0.2％、0.3％和0.4％)，其他步骤按照实施例2的方法制备泰妙菌素时间分辨荧光免疫层析试纸条，按照实施例3的方法进行检测。

二、实验结果

1、结果如图4所示，从图4可看出，选择100nm的时间分辨荧光微球与抗体偶联，制得的探针相对释放干净，本底值较低，背景干扰小，因此选用100nm的荧光微球进行探针的制备。

2、结果如图5所示，从图5A可看出，当活化pH为5.5时，试纸条显色均匀，且TRFMs探针无聚集。从图5B可看出，当活化pH为5.5时，标准曲线的IC

3、结果如图6所示，从图6A可看出，当抗体稀释液为0.01mol/L BB时，纸条显色深浅适宜，NC膜背景干净。从图6B可看出，当抗体稀释液为0.01mol/L BB时，标准曲线的IC

4、随着抗体用量的不断增加，IC

5、当探针用量小于5μL时，试纸条的灵敏度虽然较高，但是试纸条显色过浅，信号读数不稳定，从图8A和B可看出，探针用量为5μL时，IC

6、当PB的浓度为0.05mol/L和0.2mol/L时，IC

7、结果如图10所示，从图10A可看出，当T线：0.5mg/mL泰妙菌素抗原TML-O-OVA，C线：0.36mg/mL羊抗鼠IgG时，T线和C线显色强度相当。从图9B可看出，当T线：0.5mg/mL泰妙菌素抗原TML-O-OVA，C线：0.36mg/mL羊抗鼠IgG时，IC

8、结果如图11所示，从图11A～F可看出，对于鸡蛋样品，当Tween-20含量为0.4％时纸条显色效果最好，IC

实施例5时间分辨荧光免疫层析方法的特异性实验

一、实验方法

对泰妙菌素TML及其结构和功能类似物(8-α-羟基妙林、阿奇霉素、氧氟沙星、氟罗沙星、盐酸沃尼妙林、克拉霉素、泰乐菌素、泰万菌素和罗红霉素)进行测试。用0.2mol/L的PB的样品稀释液将泰妙菌素TML及其结构和功能类似物(8-α-羟基妙林、阿奇霉素、氧氟沙星、氟罗沙星、盐酸沃尼妙林、克拉霉素、泰乐菌素、泰万菌素和罗红霉素)分别稀释为500ng/mL，后按照实施例3的方法进行检测，对有交叉反应的药物进行梯度稀释并绘制标准曲线，测定IC

二、实验结果

结果见表1。该方法对TML代谢生物8-α-羟基妙林有较大交叉，可实现同时检测的目的，对其它TML结构功能类似物的交叉反应率均小于0.5％，表明该方法与其它类似物均不存在明显交叉反应，如图12所示，从左到右依次为阴性对照、TML、8-α-羟基妙林、阿奇霉素、氧氟沙星、氟罗沙星、盐酸沃尼妙林、克拉霉素、泰乐菌素、泰万菌素和罗红霉素的试纸条测试结果，药物浓度均为500ng/mL。

表1 TRFICA对TML及其类似物的交叉反应率(n＝3)

实施例6鸡蛋、鸡肉和猪肉样品中TRFICA的灵敏度

一、实验方法

按照实施例3的方法对鸡蛋、鸡肉和猪肉样品进行前处理，并检测。

二、实验结果

结果如图13所示，图13A分别为建立鸡蛋、鸡肉和猪肉的标准曲线的试纸条测试结果，图13B为荧光读数结果经origin 9.0软件拟合后得到的标准曲线。在鸡蛋标准曲线中，该试纸条对TML的qLOD为0.07ng/mL，IC

实施例7添加回收测定

一、实验方法

将TML用0.2mol/L PB溶液稀释到低、中、高三个浓度，并分别添加到鸡蛋、鸡肉和猪肉样品中，使得最终添加浓度如表2所示。样品经前处理后进行检测，具体方法与实施例3相同，将所得的T/C值代入标准曲线，算出回收的浓度及相对标准偏差。

表2样品添加回收实验(n＝3)

二、实验结果

结果如表2，鸡蛋样品的添加回收率在87.5％～101.8％，RSD<22％；鸡肉样品的添加回收率在80.3％～95.3％，RSD<2.6％；猪肉样品的添加回收率在78.1％～88.6％，RSD<29.5％，说明建立的TRFICA可以在其线性范围内，有效地检测鸡肉、猪肉和鸡蛋等实际样品中的TML药物残留。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。