同时扩增马20个STR基因座的复合扩增试剂盒及应用
文献发布时间:2023-06-19 16:08:01
技术领域
本发明属于法医遗传学技术领域,涉及一种马亲权鉴定和个体识别的方法,具体为同时扩增马20个STR基因座的复合扩增试剂盒及应用。
背景技术
马在动物分类学中的分类为:脊椎动物亚门(Vertebrata)、哺乳纲(Mammalia)、奇蹄目(Perissodactyla)、马科(Equidae)、马属(Equus)、马(Equus caballus)。是一种草食性动物。现存家马和普氏野马两个亚种。2011年末,我国马的存栏数约为677万匹,位居世界第2位。有地方品种29个,培育品种13个,已经形成育种群的引入品种有10个以上,形成了丰富多彩、分布广阔的马种资源,但其中2/3以上已经处于数量下降、濒危或濒临灭绝状态。我国马种资源正处于保种和向非役用转型的关键时期。马在我国主要分布于四川、新疆、内蒙等省(区),其中内蒙2018年存栏数63.83万头,位列全国第三。
短串联重复序列基因座(Short Tandem Repeat,STR)作为继限制性片段长度多态性之后的第二代遗传标记,自二十世纪八九十年代以来,被广泛应用于法医物证学方面相关的研究及鉴定,是目前应用最广泛的遗传标记之一。STR标记与其他遗传标记物相比,STR基因座片段小、容易扩增,更适用于微量和降解检材,且多个STR基因座可以同时进行复合扩增,具有快速、高效、准确、灵敏、信息量大等优点,被广泛应用于法医物证中的个体识别和亲子鉴定。经研究报道发现,该项技术也可用于马亲权鉴定与个体识别。
目前市场上针对马STR的商品化试剂盒仅有AB的Thermo Scientifc BovineGenotypes Panel 3.1,其为四色试剂盒,包括17个STR位点((AHT4,AHT5,ASB2,ASB17,ASB23,CA425,HMS1,HMS2,HMS3,HMS6,HMS7,HTG4,HTG6,HTG7,HTG10,LEX3 and VHL20)。根据其用户手册,这些基因座选自FAO-ISAG所推荐的马微卫星位点,所适用的也是马品种。但由于这些基因座只位于常染色体且数目不多,不排除可能遇到等位基因型相同的两个个体,当两个个体基因型相同时,基因座数量少的试剂盒将无法区别两个个体。
发明内容
解决的技术问题:为了克服现有技术的不足,实现在单管内同时扩增、检测马20个STR基因座,且在基因座排布中尽量使各基因座分布于不同染色体上、相互之间不存在遗传连锁;确保在扩增过程中各条引物之间相互无干扰,无非特异峰产生,从而满足马亲权鉴定、个体识别及性别辨别等多种需求。鉴于此,本发明提供了同时扩增马20个STR基因座的复合扩增试剂盒及应用。
技术方案:同时扩增马20个STR基因座的复合扩增试剂盒,所述试剂盒包括扩增以下20个STR基因座的特异性扩增引物;其中,20个STR基因座为:HTG6、HTG7、COR22、CA425、HTG4、COR82、LEX54、COR69、AHT5、HMS3、HMS1、HMS6、HMS7、COR58、HTG10、ASB17、VHL20、HMS2、ASB2、LEX34。
优选的,所述特异性扩增引物的序列如下:HTG6、SEQ ID NO:1-2;HTG7、SEQ IDNO:3-4;COR22、SEQ ID NO:5-6;CA425、SEQ ID NO:7-8;HTG4、SEQ ID NO:9-10;COR82、SEQID NO:11-12;LEX54、SEQ ID NO:13-14;COR69、SEQ ID NO:15-16;AHT5、SEQ ID NO:17-18;HMS3、SEQ ID NO:19-20;HMS1、SEQ ID NO:21-22;HMS6、SEQ ID NO:23-24;HMS7、SEQ IDNO:25-26;COR58、SEQ ID NO:27-28;HTG10、SEQ ID NO:29-30;ASB17、SEQ ID NO:31-32;VHL20、SEQ ID NO:33-34;HMS2、SEQ ID NO:35-36;ASB2、SEQ ID NO:37-38;LEX34、SEQ IDNO:39-40。
优选的,所述特异性扩增引物的浓度如下:HTG6、0.2μM;HTG7、0.15μM;COR22、0.15μM;CA425、0.2μM;HTG4、0.25μM;COR82、0.25μM;LEX54、0.25μM;COR69、0.25μM;AHT5、0.25μM;HMS3、0.2μM;HMS1、0.15μM;HMS6、0.2μM;HMS7、0.25μM;COR58、0.25μM;HTG10、0.25μM;ASB17、0.25μM;VHL20、0.2μM;HMS2、0.2μM;ASB2、0.25μM;LEX34、0.2μM。特异性扩增引物具体信息如下表所示:
优选的,所述特异性扩增引物分为5组,HTG6、HTG7、COR22、CA425为第1组,HTG4、COR82、LEX54、COR69为第2组,AHT5、HMS3、HMS1、HMS6为第3组,HMS7、COR58、HTG10、ASB17为第4组,VHL20、HMS2、ASB2、LEX34为第5组。
优选的,所述特异性扩增引物采用荧光染料FAM、HEX、SUM、LYN、PUR中的任一种进行标记,且5组引物采用的荧光染料均不同,内标选用橙色荧光SIZ标记。
优选的,每个基因座的特异性扩增引物中至少1条的5’端采用荧光标记。
优选的,所述试剂盒包括:20个基因座的等位基因分型标准物、反应混合液、热启动Taq酶、马基因组DNA、sdH
优选的,所述反应混合液包括:MgCl
以上任一所述同时扩增马20个STR基因座的复合扩增试剂盒在马亲权鉴定或个体识别中的应用。
有益效果:(1)本发明所述试剂盒能够在单管中同时扩增、检测20个马STR位点,为同类型产品中检测位点最多的试剂盒;(2)选用的基因座尽量分布在不同染色体上,相互之间不存在遗传连锁,从而提高了试剂盒的整体识别能力;(3)所述特异性扩增引物之间相互无干扰,无非特异峰产生,且具有特异性强、分辨率高、分型准确、灵敏度高等特点,可完全满足马亲权鉴定、个体识别、性别辨别等多方面需求。
附图说明
图1为本发明的基因座排布示意图;
图2为本发明的实际样本1分型图。
图3为本发明的实际样本2分型图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换,均属于本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
同时扩增马20个STR基因座的复合扩增试剂盒,具体包括:
一、基因座位点筛选
根据多态性高、标记间不连锁、易于基因分型等要求及实际引物测试效果与基因座排布需求,筛选出20个染色体STR基因座:HTG6、HTG7、COR22、CA425、HTG4、COR82、LEX54、COR69、AHT5、HMS3、HMS1、HMS6、HMS7、COR58、HTG10、ASB17、VHL20、HMS2、ASB2、LEX34。
二、基因座排布
根据以上20个基因座,设计了独特的基因座排布方式及化学荧光染料标记的方法:HTG6、HTG7、COR22、CA425为第一组,荧光染料标记物为FAM;HTG4、COR82、LEX54、COR69为第二组,荧光染料标记物为HEX;AHT5、HMS3、HMS1、HMS6为第三组,荧光染料标记物为SUM;HMS7、COR58、HTG10、ASB17为第四组,荧光染料标记物为LYN;VHL20、HMS2、ASB2、LEX34为第五组,荧光染料标记物为PUR基因座排布如图1。
三、特异性引物设计及复合扩增条件的建立
通过基因座名称或者染色体位置,利用UCSC或NCBI网站进行基因座序列下载;其次,根据每个基因座重复单元两侧的序列进行引物设计。
(1)特异性引物设计
在设计特异性引物时,使用的设计软件最佳搭配是Premier和Oligo合并使用,以Premier进行自动搜索,Oligo进行分析评价,特异性引物碱基分布要随机、Tm值相近、GC含量在40%~60%之间、引物自身及引物之间不应存在互补序列;同时也要保证引物扩增的特异性,在NCBI数据库中使用Primer-BLAST软件对设计的引物进行比对分析,要充分考虑引物3’端的特异性,因为引物3’端序列同源性较高的话容易导致错误引发。
随着复合扩增系统中引物数量的增加,不同基因座的特异性引物之间的相互干扰也越来越严重,反应体系的动力学变得越来越复杂,因此需要设计大量的引物序列进行复杂的测试,最终保证试剂盒的扩增特异性及效率。
(2)复合扩增条件的建立
先对20个基因座的单一扩增条件进行优化,在成功地建立了单个基因座扩增条件的基础上,研究20个基因座复合扩增PCR反应条件,通过大量的反复实验确定了复合扩增中的各个参数,包括循环参数、退火温度、缓冲液离子强度、酶量、复合扩增反应体积的变化以及模板DNA量等,使扩增产物达到平衡、特异的要求,建立起复合扩增体系,同时扩增出20个基因座或位点,最终特异性引物序列及浓度见表1。
表1特异性引物序列及浓度
所述特异性扩增引物分为5组,HTG6、HTG7、COR22、CA425为第1组,HTG4、COR82、LEX54、COR69为第2组,AHT5、HMS3、HMS1、HMS6为第3组,HMS7、COR58、HTG10、ASB17为第4组,VHL20、HMS2、ASB2、LEX34为第5组。所述特异性扩增引物采用荧光染料FAM、HEX、SUM、LYN、PUR中的任一种进行标记,且5组引物采用的荧光染料均不同,内标选用橙色荧光SIZ标记。每个基因座的特异性扩增引物中至少1条的5’端采用荧光标记。
所述试剂盒包括:20个基因座的等位基因分型标准物、反应混合液、热启动Taq酶、马基因组DNA、sdH
表2试剂盒扩增体系
本试剂盒仅可用于提取样本的扩增,马基因组DNA指的是马基因组DNA提取物。因提取检材与提取方式的不同,所获得的DNA提取物浓度也不同,加入量X为不定值,根据所提DNA提取物的浓度可调节马基因组DNA的加入量,保证加入的DNA为0.125-1ng,可获得准确分型结果。马基因组DNA最大加入量X为2μL。
所述反应混合液包括:MgCl
实施例2
实施例1复合扩增试剂盒在马亲权鉴定或个体识别中的应用。应用步骤如下:
1、配制PCR扩增体系;
2、扩增热循环
(l)将PCR扩增管置于热循环仪上;
(2)选择表3推荐的PCR扩增条件进行PCR扩增;
(3)扩增后的产物应避光保存;
表3
3、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标AGCU Marker SIZ-500组成上样混合物:(0.5μLAGCU Marker SIZ-500)×(进样数)+(12μL去离子甲酰胺)×(进样数),AGCU MarkerSIZ-500购于无锡中德美联生物技术有限公司;
将12.5μL所述上样混合物与1μL扩增产物或20个基因座等位基因分型标准物Allelic Ladder(无锡中德美联生物技术有限公司)混合,避免产生气泡,95℃变性3min,冰浴3min,并尽快使遗传分析仪进行电泳检测;
4、分型分析
用片段分析软件GeneMapper ID-X分析步骤三中遗传分析仪检测收集的数据,电泳采用多道或单道毛细管电泳。
本实施例中的样本1为马肉粉末,样本购自国家计量局,利用Chelex法对样本进行马基因组DNA提取。样本2为无锡食药环送检疑似马肉假冒驴肉检材,利用磁珠提取试剂盒对马基因组DNA提取。
结果显示,使用本发明对上述马样本进行分型检测,使用本发明可对马个体进行有效辨别,在马个体识别上有较大的作用。
序列表
<110> 呼伦贝尔市公安局刑事侦查支队
无锡中德美联生物技术有限公司
<120> 同时扩增马20个STR基因座的复合扩增试剂盒及应用
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<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> DNA
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- 同时扩增马20个STR基因座的复合扩增试剂盒及应用
- 一种同时扩增人常染色体和Y染色体STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用