6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸的前药、其制备方法及应用

技术领域

本发明属于药物技术领域，尤其涉及一种6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸的前药、其制备方法及应用。

背景技术

癌症已成为一个影响人民生活质量的重大疾病，根据国家癌症中心发布的数据显示，我国的癌症发病率呈上升的趋势。传统的癌症治疗方式有化疗，放疗以及手术切除。化疗是通过化学药物去杀死癌细胞，是目前最为有效的一个治疗手段。但是化疗往往会伴随着严重的副作用，因为化疗药物往往缺乏选择性，杀死癌细胞的同时，也会对正常细胞造成损伤。例如有的药物会对心脏，胃肠系统，肝肾组织，皮肤等产生毒副作用。

实体瘤中普遍存在乏氧区域，这些区域可通过多种途径引起肿瘤耐药，不利于肿瘤的治疗。而在正常生理条件下，组织不会存在乏氧区域，所以这些乏氧区域为肿瘤选择性治疗带来了机会。实体瘤乏氧这一独特的性质，也为化疗药物开发带来了不同的方向。目前，临床上已开发出多种缺氧激活的前药Hypoxia-Activated Prodrugs(HAPs)。利用肿瘤自身乏氧的特征，HAPs可以在肿瘤部位选择性激活为有活性的药物，发挥杀伤肿瘤的作用，避免药物带来的全身毒性。将小分子化疗药物改性为HAPs类的药物这一策略，不仅降低了药物的全身毒性，同时也将肿瘤乏氧这一劣势转换为选择性治疗的优势。

DON是一类谷氨酰胺拮抗剂，可阻断细胞的谷氨酰胺代谢，从而杀伤细胞。但该药无法区分正常细胞与肿瘤细胞，在临床试验中，存在严重的胃肠毒副作用，病人会出现腹泻、呕吐等症状。最终，临床试验被暂停。近年来，美国约翰斯·霍普金斯大学医学院的芭芭拉·斯卢谢尔课题组将DON进行化学修饰，DON的羧基位点被乙酯保护，氨基位点被亮氨酸修饰，合成了一种JHU-083的前药，其合成路线如下所示：

该前药主要通过氨肽酶和酯酶作用还原成DON。与DON前药相比，JHU-083降低了DON的胃肠毒副作用。但该前药的氨基位点的还原主要依赖于氨肽酶的作用，而氨肽酶广泛的存在于各组织中，因此JHU-083的还原选择性不足，无法高效实现肿瘤部位的选择性激活，并且JHU-083合成步骤多，会导致最终总的反应产率低。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种乏氧激活的6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸的前药、其制备方法及应用。

本发明提供了一种6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸的前药，如式(I)所示：

其中，n为0～5的整数；R

优选的，所述取代的偶氮基中的取代基选自取代或未取代的C1～C10的烷基、取代或未取代的C6～C20的芳基；

所述取代的C1～C10的烷基与取代的C6～C20的芳基中的取代基各自独立地选自C1～C10的烷胺基。

优选的，所述R

其中，R

优选的，如式(II)或式(III)所示：

本发明还提供了一种上述6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸的前药的制备方法，包括：

S1)将式(IV)所示的化合物与式(V)所示的化合物反应，得到式(VI)所示的化合物；

S2)将所述式(VI)所示的化合物在低温条件下与三甲基硅基重氮甲烷及烷基锂反应，得到式(I)所示的6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸的前药；

或者将式(VII)所示的化合物与式(VIII)所示的化合物反应，得到式(I)所示的6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸的前药；

其中，n为0～5的整数；R

本发明还提供了一种上述6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸的前药在制备治疗肿瘤药物中的应用。

本发明还提供了一种治疗肿瘤的药物，包括上述的6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸的前药。

优选的，还包括血管阻断剂和/或免疫检查点抑制剂。

本发明提供了一种6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸的前药，如式(I)所示；其中，n为0～5的整数；R

附图说明

图1为本发明实施例1中6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸的前药的合成步骤(a)、EOC-NBC的核磁氢谱表征图(b)、EOC-NBC的核磁碳谱表征图(c)及EOC-NBC的质谱表征图(d)；

图2为本发明实施例1中6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸的前药HDON的核磁氢谱表征图(a)、核磁碳谱表征图(b)、质谱表征图(c)及HPLC谱图(d)；

图3为本发明实施例1中6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸的前药HDON在25℃不同缓冲液中的稳定性结果图(a)、在37℃PBS-7.4缓冲液中的稳定性结果图(b)、在37℃血浆中的稳定性结果图(c)及在血浆中代谢产物的质谱表征图(d)；

图4为本发明实施例1中6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸的前药HDON的还原机制(a)、还原效率曲线图(b)、还原产物的HPLC谱图(c)、还原中间产物DON-Et LC-MS表征谱图(d)及还原产物DON LC-MS表征谱图(e)；

图5为本发明实施例1中DON及HDON的4T1细胞毒性实验图(a)、MC38细胞毒性实验图(b)及H22细胞毒性实验图(c)；

图6为本发明实施例1中HDON与DON连续给药一周后昆明鼠体重变化曲线图；

图7为本发明实施例1中CA4-NPs对4T1乳腺癌及MC38结肠癌血管影响的CD31免疫组化结果图(a)、HIF-1α免疫组化图(b)、细胞内硝基还原酶含量测试图(c)与肿瘤组织硝基还原酶含量测试图(d)；

图8为本发明实施例1中单药HDON与HDON+CA4-NPs不同时间的组织分布图；

图9为本发明实施例1中H22肝癌治疗方案示意图(a)、肿瘤体积变化曲线图(b)、小鼠体重变化曲线图(c)、生存期曲线图(d)、治疗结束后肿瘤大小图片(e)、治疗结束后肿瘤重量(f)及治疗后小鼠各脏器与肿瘤HE切片图(g)、肿瘤免疫细胞分析图(h)；

图10为本发明实施例1中MC38结肠癌治疗示意图(a)、肿瘤体积变化曲线图(b)、小鼠体重变化曲线图(c)、生存期曲线图(d)、治疗结束后肿瘤大小图片(e)、治疗结束后肿瘤重量(f)、肿瘤组织谷氨酰胺含量测试图(g)、治疗结束后小鼠肝肾功能指标分析、血清中碱性磷酸酶、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、尿酸、尿素氮和肌酐含量图(h)；

图11为本发明实施例1中MC38模型治疗后小鼠各脏器与肿瘤HE切片图；

图12为本发明实施例1中MC38模型肿瘤免疫细胞分析图(a)、血清细胞因子分析图(b)；

图13为本发明实施例1中4T1乳腺癌治疗方案示意图(a)、肿瘤体积变化曲线图(b)、小鼠体重变化曲线图(c)、生存期曲线图(d)、治疗结束后肿瘤重量图(e)、治疗结束后肿瘤大小图片(f)、小鼠肺转移印度墨水染色图(g)及小鼠肺转移结节数统计图(h)；

图14为本发明实施例2中Azo-DON的合成路线图(a)、Azo-NPC的氢谱表征图(b)、Azo-DON的氢谱表征图(c)及Azo-DON的ESI质谱表征图(d)。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸的前药，如式(I)所示：

其中，n为0～5的整数，优选为1～3的整数，再优选为1或2；R

R

所述取代的C1～C10的烷基与取代的C6～C20的芳基中的取代基各自独立地优选为C1～C10的烷胺基，更优选为C1～C8的烷胺基，再优选为C1～C6的烷胺基，再优选为C1～C4的烷胺基，最优选为C1～C2的烷胺基。

在本发明中，最优选地，所述R

其中，R

在本发明中，最优选地，所述R

其中，R

在本发明中，进一步优选地，所述6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸的前药如式(II)或式(III)所示：

在本发明中，进一步优选地，所述6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸的前药如式(II-1)或式(III-1)所示：

本发明提供的前药为乏氧激活前药，可在肿瘤乏氧部位被还原成原药，发挥抑制肿瘤生长的作用，同时减少原药对其它正常细胞的影响，降低了该类药物对胃肠的毒副作用，与血管阻断剂联合治疗效果显著，与aPD-1和血管阻断剂三药联合治疗在4T1模型上显著的抑制了肿瘤的生长和转移。

本发明提供的前药在乏氧条件下可被硝基还原酶以及酯酶还原成DON，从而减轻DON对胃肠的毒副作用，实现药物的选择性还原。

本发明还提供了一种上述6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸的前药的制备方法，包括：S1)将式(IV)所示的化合物与式(V)所示的化合物反应，得到式(VI)所示的化合物；S2)将所述式(VI)所示的化合物在低温条件下与三甲基硅基重氮甲烷及烷基锂反应，得到式(I)所示的6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸的前药。

将式(IV)所示的化合物与式(V)所示的化合物反应；在本发明中，该反应优选在有机溶剂中进行；所述式(IV)所示的化合物与式(V)所示的化合物的摩尔比优选为1：(1.8～2.2)，更优选为1：2；所述有机溶剂为本领域技术人员熟知的有机溶剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为乙腈；该反应优选在氨基吡啶类化合物与有机胺存在的条件下进行；所述氨基吡啶类化合物优选为4-二甲氨基吡啶；所述有机胺优选为N,N-二异丙基乙胺；所述式(IV)所示的化合物、氨基吡啶类化合物与有机胺的摩尔比优选为1：(0.8～1.2)：(1.8～2.2)，更优选为1：1：2；在本发明中，所述式(IV)所示的化合物与式(V)所示的化合物优选先在冰浴的条件混合，然后升至室温反应；所述混合的时间优选为1～3h；在本发明中，此步骤更优选为将式(IV)所示的化合物、氨基吡啶类化合物与有机胺在有机溶剂中及冰浴的条件下混合搅拌，然后加入式(V)所示的化合物在冰浴条件下混合，然后升至室温反应；所述混合搅拌的时间优选为10～20min，更优选为15min；所述室温反应的时间优选为30～60h，更优选为40～50h，再优选为45～48h。

反应后，优选浓缩得到固体，然后用二氯甲烷溶解后，饱和食盐水洗涤，干燥、浓缩后，经柱层析得到粗产品；所述柱层析的洗脱液优选为乙酸乙酯与己烷；所述乙酸乙酯与己烷的体积比优选为1：20～2：1。

将所述粗产品溶于乙酸乙酯后，加入冰乙醚重结晶后，得到式(VI)所示的化合物。

将式(VI)所示的化合物在低温条件下与三甲基硅基重氮甲烷及烷基锂反应；所述烷基锂优选为正丁基锂；所述式(VI)所示的化合物、三甲基硅基重氮甲烷与烷基锂的摩尔比优选为1：(1～1.2)：(1～1.5)，更优选为1：1.18：1.22；在本发明中，优选先将三甲基硅基重氮甲烷与烷基锂在低温的条件下混合反应，然后加入式(VI)所示的化合物的有机溶液中反应；所述混合反应的温度优选为-100℃～-90℃，更优选为-98℃；所述混合反应的时间优选为20～40min，更优选为30min；式(VI)所示的化合物的有机溶液中的溶剂优选为四氢呋喃；所述反应的温度优选为-80℃～-70℃，更优选为-78℃；所述反应的时间优选为20～40min，更优选为30min。

反应后，优选加入水淬灭反应后，用乙酸乙酯萃取，经柱层析纯化后，得到式(I)所示的6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸的前药；所述柱层析的洗脱液优选为氯仿与丙酮；所述氯仿与丙酮的体积比优选为20：1。

或者将式(VII)与式(VIII)所示的化合物反应，得到式(I)所示的6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸的前药。

将式(VII)所示的化合物与式(VIII)所示的化合物反应；所述反应优选在有机溶剂中进行；所述有机溶剂优选为N，N-二甲基甲酰胺；所述反应优选为有机胺存在的条件下进行；所述有机胺优选为三乙胺；在本发明中，优选分别将式(VII)所示的化合物及式(VIII)所示的化合物与有机溶剂混合，得到各自的溶液，然后在低温条件下将两者的溶液混合进行反应；所述反应的温度优选为-10℃～10℃，更优选为0℃；所述反应的时间优选为1～3h，更优选为2h。

反应结束后，优选加入乙酸乙酯，依次用水、饱和食盐水洗涤后，干燥，经柱层析纯化后，得到式(I)所示的6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸的前药；所述柱层析的洗脱液优选为正己烷与乙酸乙酯；所述正己烷与乙酸乙酯的体积比优选为3：1。

本发明提供的6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸的前药制备方法简单且产率较高。

本发明还提供了一种上述6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸的前药在制备治疗肿瘤药物中的应用。

本发明还提供了一种治疗肿瘤的药物，包括上述的6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸的前药。

优选的，所述治疗肿瘤的药物还包括血管阻断剂和/或免疫检查点抑制剂。

优选的，所述血管阻断剂为CA4-NPs；所述免疫检查点抑制剂为aPD-1。

优选的，所述6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸的前药与血管阻断剂的质量比为1：10～20，更优选为1：(15～20)，再优选为1：(18～20)。

优选的，所述6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸的前药与免疫检查点抑制剂的质量比优选为1：(0.05～0.2)，更优选为1：(0.08～0.12)，再优选为1：0.1。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸的前药、其制备方法及应用进行详细描述。

以下实施例中所用的试剂均为市售。

实施例1

6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸的前药(HDON)合成如图1a所示。

1.1中间体EOC-NBC的合成：向圆底烧瓶中加入EOC(5-氧吡咯烷-2-羧酸乙酯)(5g,31.8mmol,1equiv)，DMAP(4-二甲氨基吡啶)(3.9g,31.8mmol,1equiv)，DIPEA(N,N-二异丙基乙胺)(8.2g,63.6mmol,2equiv)溶于90mL的无水ACN(乙腈)中，冰水浴中搅拌15min，接着缓慢向圆底烧瓶中加入NBC(氯甲酸对硝基苄酯)(2.96M in ACN,13.7g,63.6mmol,2equiv)，冰水浴中继续搅拌2h后恢复至室温反应48h。反应完成后，旋转蒸发浓缩得到棕色固体。用200mL二氯甲烷将固体溶解，用饱和食盐水洗涤(200mL×3)，无水硫酸镁进行干燥，旋转蒸发，经柱层析(乙酸乙酯/己烷1:20 2个柱体积、1:10 2个柱体积、1:2 5个柱体积、1:1 4个柱体积、2:1 2个柱体积)得到粗产品。粗产品溶于适量乙酸乙酯中，加入冰乙醚进行重结晶得到白色固体EOC-NBC。并使用CDCl

1.2HDON的合成：在圆底烧瓶中加入EOC-NBC(450mg,1.34mmol,1.00equiv)，用12mL无水四氢呋喃溶解，并在杜瓦瓶中冷至-116℃。另外将TMS(三甲基硅基重氮甲烷)(0.79mL,2M in hexane,1.58mmol,1.18equiv)溶于7mL的无水四氢呋喃中，并冷至-98℃。将n-BuLi(0.65mL,2.5M in hexane,1.63mmol,1.22equiv)缓慢滴加到TMS溶液中，反应30分钟。接着将TMS与n-BuLi混合溶液加入到EOC-NBC溶液中，温度缓慢从-116℃升至-78℃，继续反应30分钟。反应结束后加入15mL的水溶液淬灭反应。使用乙酸乙酯萃取三次(10mL×3)。接着用饱和食盐水洗涤三次(20mL×3)，洗涤后的溶液使用无水硫酸镁干燥。用柱层析的方法进行纯化(氯仿/丙酮20:1)。并使用CDCl

1.3对HDON的化学稳定性和血浆稳定性进行评价。首先评价了HDON在25℃下的化学稳定性，将1mg HDON使用1mL乙腈溶解，用不同pH值的缓冲液稀释至浓度为0.27mM，置于25℃恒定的条件下，使用HPLC检测0h、6h、12h、24h和48h HDON的浓度。结果表明HDON在不同pH值的PBS缓冲液中均具有较好的稳定性，如图3a所示，在48h PBS-8.5,7.4,6.8,5.5中HDON的剩余含量分别为95.80±0.33％，98.76±1.17％，98.77±1.42％，99.33±0.99％。为了模拟生理条件，接着在37℃PBS-7.4的溶液中进行了稳定性实验，如图3b所示，24h后溶液中剩余的HDON含量为96.17±0.82％。接着，在37℃C57BL/6小鼠血浆中进行了稳定性的实验，同样的将1mg/mL的HDON乙腈溶液用PBS-7.4稀释到0.2mg/mL，然后将其与小鼠血浆等体积混合，在0h、0.5h、1h、3h检测血浆中HDON的浓度，如图3c所示，HDON在血浆中快速被代谢，并对其代谢后的产物进行了ESI质谱测试，如图3d所示，发现HDON没有被代谢为DON，而是生成了新的中间体产物，其乙酯的键被酶水解了。

HDON的还原机制如图4a所示。首先，本发明测试了在37℃不同浓度硝基还原酶的作用下HDON的还原情况，使用氮气将PBS-7.4溶液除氧，将5mg HDON溶解在1mL乙醇蓖麻油(1/1，V/V)中，然后用PBS-7.4稀释以获得0.13mM溶液，在1.5mL离心管中，混合200μL HDON(0.13mM)和60μL NADH(2.35mM)，然后在缺氧状态下向样品溶液中添加40μL硝基还原酶(0.25mg/mL或0.50mg/mL)溶液，将混合样品置于37℃的恒温振荡室中，在0h、0.5h、1h、3h、6h、12h检测HDON的含量。如图4b所示，随着酶浓度的增加，HDON的还原速率也增加。接着本发明测试了HDON在酯酶和硝基还原酶作用下的HPLC，在1.5mL离心管中，混合200μL HDON(0.13mM)和60μL NADH(2.35mM)，然后在缺氧状态下向样品溶液中添加40μL硝基还原酶(0.50mg/mL)溶液，1h后向上述反应混合物中添加400μL酯酶(5U/mL)，并继续孵育3h，反应结束后将样品溶液使用氮吹仪在室温下浓缩，并使用柱前衍生化的方法对其产物进行分析(浓缩后的样品管中加入10μL水，50μL pH＝9的0.2M碳酸氢钠缓冲液，100μL 10mM的DABS-Cl(丹磺酰氯)丙酮溶液，接着60℃水浴15min)。如图4c所示，并利用LC-MS对其还原产物进行了验证(在25℃下，以1mL/min的流速梯度洗脱，通过HPLC或LC-MS检测样品。流动相为水+0.1％甲酸和乙腈+0.1％甲酸。乙腈+0.1％甲酸梯度为20％至95％，持续30分钟)，如图4d与图4e所示。HDON可以在硝基还原酶的作用下还原成DON-Et中间体(图4d)，接着在酯酶的作用下被还原成DON(图4e)。通过体外的实验表明HDON可以在硝基还原酶和酯酶的作用下还原成DON原药。

本发明进行了不同细胞系的细胞毒性实验，通过CCK8实验评价HDON和DON在体外的细胞毒性，将H22细胞、4T1细胞或MC38细胞(每孔8.0×10

在昆明鼠上进行了HDON的毒副作用评价，雌性昆明小鼠随机分为7组，分别腹腔注射DON(0.66,1.32,2.64μmol/kg)或HDON(0.00,0.66,1.32,2.64μmol/kg)一周，连续8天每天观察体重变化。如图6所示，HDON与DON连续不同剂量给药一周，HDON组昆明鼠体重没有降低，DON组小鼠的相对体重分别为93.35±16.15％(0.66μmol/kg)、78.80±4.96％(1.32μmol/kg)和69.77±6.83％(2.64μmol/kg)，DON两个剂量组出现明显的体重下降。实验结果表明，在正常的昆明鼠上，HDON与同等剂量下的DON相比，无显著的毒副作用。

在细胞水平和动物水平，本发明验证了HDON显著降低了DON的毒副作用。本发明将其与血管阻断剂CA4-NPs联合应用。首先，本发明检测了CA4-NPs对4T1乳腺癌(20mg/kg，以CA4计算)和MC38结肠癌(18mg/kg，以CA4计算)血管的影响，小鼠尾静脉注射CA4-NPs后，24h后处死取肿瘤组织，保存在4％的多聚甲醛溶液中，使用CD31免疫组化确定肿瘤组织血管密度情况，如图7a所示，CA4-NPs能够降低肿瘤的血管密度，这有利于加深肿瘤的乏氧情况。接着，本发明用免疫组化确认了HIF-1α的表达，如图7b所示表明CA4-NPs能提升肿瘤的乏氧程度，增加HIF-1α的表达。同时，也验证了H22肝癌肿瘤的乏氧程度比4T1乳腺癌，MC38结肠癌模型深。更加有利于HDON的选择性还原。接着，本发明在细胞水平验证了乏氧能够增加硝基还原酶的表达，如图7c所示。同样的，在动物水平也进行了验证。CA4-NPs能增加4T1乳腺癌(20mg/kg，以CA4计算)和MC38结肠癌(18mg/kg，以CA4计算)肿瘤组织中硝基还原酶的表达，如图7d所示。

为了验证HDON在体内的还原，本发明在4T1乳腺癌上进行了生物分布实验。当4T1肿瘤达到约250mm

H22肝癌模型是一类乏氧程度深的肿瘤模型，本发明首先单独使用HDON进行了抗肿瘤研究。当肿瘤体积达到100mm

本发明接着研究了乏氧激活的谷氨酰胺拮抗剂(HDON)与CA4-NPs联用在MC38结肠癌模型上的抗肿瘤作用，如图10所示。当肿瘤体积达到100mm

接着对MC38结肠癌模型进行了免疫微环境的分析，如图12a所示，经HDON与CA4-NPs联合治疗后，肿瘤细胞内检测到了更多的CD4

同样，本发明在4T1模型上联合CA4-NPs与aPD-1进行了抗肿瘤研究，如图13所示。当肿瘤体积达到100mm

实施例2

首先，按照文献的方法合成了Azo-OH。将Azo-OH(500mg,1.96mmol,1equiv)溶于5mL的DCM(二氯甲烷)中，冷至0℃。向Azo-OH溶液中加入DMAP(23.95mg,0.196mmol,0.1equiv)和三乙胺(327μL,2.352mmol,1.2equiv)。将NPC(474.26mg,2.352mmol,1.2equiv)溶于5mL的DCM中，溶解后的NPC溶液滴加到Azo-OH溶液中，恢复至室温，继续反应2h。反应结束后用饱和氯化铵洗1次(10mL)，水洗3次(10mL×3)。用乙酸乙酯与正己烷进行重结晶得到纯品Azo-NPC(图14a)。并使用CDCl

Azo-DON的合成：首先参考文献合成DON-Et。Azo-NPC(116mg,0.276mmol,1.1equiv)溶于5mL的DMF(N,N-二甲基甲酰胺)溶液中，冷至0℃。另外，将DON-Et(50mg,0.251mmol,1equiv)溶于1mL的DMF溶液中，快速加入到Azo-NPC溶液中。接着加入TEA(三乙胺)(38.4μL,0.276mmol,1.1equiv)。0℃下反应2h，恢复至室温后过夜反应。反应结束后，加入50mL的乙酸乙酯，再用水洗2次(50mL×2)，饱和食盐水洗2次(50mL×2)，无水硫酸镁干燥。用柱层析进行纯化(正己烷：乙酸乙酯3:1)得到产物。并使用CDCl