一种桑蚕丝丝素重链蛋白多克隆抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种桑蚕丝丝素重链蛋白多克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

桑蚕丝是一种天然高分子蛋白质纤维，主要分为家蚕丝和野蚕蚕丝两大类。我国是最早利用野蚕丝制作服饰且驯化野蚕成家蚕的国家，拥有近5000年的栽桑养蚕的文化历史。桑蚕丝是熟蚕结茧时分泌丝液凝固而成的连续长纤维，是一种天然纤维，也是人类利用最早的动物纤维之一，主要用于纤维服饰材料被制作成衣物及家纺类纺织品；目前，从桑蚕丝中提取出的丝素和丝胶蛋白等物质因具有消炎、抗菌、抗氧化活性及良好的生物兼容性被广泛应用于医药、化工、食品及材料等领域。

桑蚕丝是由两部分构成，外围的胶原蛋白所构成的部分，称为丝胶(sericin)；内芯由结晶蛋白构成的部分称为丝素(fibroin)；丝胶包裹两根丝素纤维就构成了一根蚕丝。丝胶与丝素均属大分子蛋白，但两者结构与氨基酸成分存有差异。丝素蛋白是蚕丝中主要的组成部分，约占质量的70％左右，丝胶约占25％左右，还有5％左右的其它介质。丝素蛋白主要由丝素重链(Fibroin heavy chain，Fib-h)、丝素轻链(Fibroin light chain，Fib-l)及分子量为25KDa的P25蛋白按摩尔比6:6:1组成。Fib-h蛋白含有5632个氨基酸残基，分子量约为400KDa，该蛋白由12个富含GSGSA重复序列的结晶区和11个非结晶区及NC两端构成。Fib-l由一个编码256个氨基酸残基，分子量为25KDa的无结构域的蛋白组成，其中，C末端的S键与丝素重链相互结合，6分子的重链和轻链与1分子的P25蛋白形成丝素分泌小体被分泌到丝腺腔内，然后在丝腺腔内从凝胶状态变成溶胶状态，在中部丝腺与丝胶蛋白混合后经前部丝腺的作用以纤维的形式从口器中分泌出来。

由于桑蚕丝丝素蛋白对人体的免疫原性低，目前，丝素蛋白经过溶解被制成各种形式的生物材料，如丝素海绵、丝素支架、纳米丝素颗粒等用于药物缓释载体、神经和血管再生支架等等。随着丝素蛋白的广泛应用，急需其成分进行定性检测的分子技术。同时，对目前市面上销售的蚕丝制品也缺失相应的分子检测手段，因此，消费者经常被蚕丝假冒产品欺骗而失去对蚕丝产品的信任。目前检测桑蚕丝的方法主要是物理方法，或者是利用巴氏消毒液对其进行溶解或者用火烧检测是否发出蛋白燃烧的味道来进行判断。但这些方法都可能误检。因蛋白类的纤维利用巴氏消毒液或者燃烧的方法都可得到类似的结果。由此，开发一种能检测桑蚕丝丝素蛋白的分子诊断方法势在必行。

发明内容

本发明的目的在于提供一种桑蚕丝丝素重链蛋白多克隆抗体及其制备方法和应用，解决现有技术中因蚕丝制品缺失相应的分子检测手段的技术问题。

本发明公开了一种桑蚕丝丝素重链蛋白多克隆抗体，其抗原包括多肽Fib-h-1、多肽Fib-h-2、多肽Fib-h-3或多肽Fib-h-4，所述的Fib-h-1氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，所述的Fib-h-2氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示，所述的Fib-h-3氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示，所述的Fib-h-4氨基酸序列为SEQ ID NO.N所示。

进一步的，其抗原包括多肽Fib-h-1、多肽Fib-h-2、多肽Fib-h-3或多肽Fib-h-4中的至少两种。

进一步的，其抗原包括多肽Fib-h-1、多肽Fib-h-2、多肽Fib-h-3或多肽Fib-h-4中的至少三种。

进一步的，其抗原包括多肽Fib-h-1、多肽Fib-h-2、多肽Fib-h-3和多肽Fib-h-4。

上述多肽序列分别如下所示：

SEQ ID NO.1：GGYSRSDGYEY

SEQ ID NO.2：AWSSESDFGT

SEQ ID NO.3：SASSRSYDYSRRNV

SEQ ID NO.4：QITTKKMQRKNK

一种桑蚕丝丝素重链蛋白多克隆抗体的制备方法，将多肽抗原与KLH载体蛋白，并使用多肽-KLH免疫动物，采血检测后进行最终采血制备抗血清，然后进行纯化。

进一步的，所述动物免疫为皮下免疫，2-3周免疫一次，免疫4次。

进一步的，所述纯化为将多肽抗原与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，将所得抗血清与PBS等量混合后缓慢上样，待抗原抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体。

一种桑蚕丝丝素重链蛋白多克隆抗体的应用，用于检测是否含有丝素蛋白。

一种桑蚕丝丝素重链蛋白多克隆抗体的应用，所述应用为制备检测桑蚕丝的试剂盒。

一种桑蚕丝丝素重链蛋白多克隆抗体的应用，用于面膜液中是否含有丝素蛋白的分子检测。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：

1.鉴于桑蚕丝丝素产品的广泛应用及目前桑蚕丝制品的检测方法，本发明利用桑蚕丝丝素纤维是蛋白的原理，利用抗原抗体亲和性结合原理，制备了桑蚕丝丝素蛋白主要成分丝素重链的多克隆抗体。

2.本发明分析桑蚕丝丝素蛋白可免疫多肽位点，人工合成丝素重链的多肽，然后将其与佐剂进行混合作为完全抗原注射至活体动物上，进行动物免疫，纯化后得到4个多肽片段的多克隆抗体。经WB实验，可定性的判断桑蚕丝丝素蛋白；可利用该抗体进行家蚕丝腺组织切片的免疫实验，研究丝蛋白分泌及结晶过程；同时，可鉴定含桑蚕丝纤维的生物制品，如面膜、化妆品及医用敷料，还可鉴定纤维中是否含桑蚕丝。

3.利用本抗体，可用于目前市面上用桑蚕丝纤维做基布的面膜的检测；也还可用于面膜液中是否含有丝素蛋白的分子检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅表示出了本发明的部分实施例，因此不应看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它相关的附图。

图1为本发明桑蚕丝丝素重链蛋白多肽抗体与对应抗原的特异性检测图；

图2为本发明桑蚕丝丝素重链蛋白多肽抗体与丝腺细胞内的抗原的原位免疫荧光检测图；

图3为本发明桑蚕丝丝素重链蛋白多肽抗体与丝腺细胞提取总蛋白的免疫印迹检测图；

图4为利用抗体检测不同种属茧及不同的蛋白纤维图其中A:各种蚕茧片及蛋白纤维形态图；B:兔Ig-G一抗作为WB阴性对照结果；C:Ab-Fib-h抗体的WB结果；D：各样品的上样蛋白的考染结果；

图5利用抗体检测蚕丝面膜基布含桑蚕丝蛋白情况结果图；

图6利用抗体检测面膜液中是否含丝素蛋白的结果图。

具体实施方式

为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。

实施例1

一种桑蚕丝丝素重链蛋白多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤，动物免疫

将多肽Fib-h-1，Fib-h-2，Fib-h-3和Fib-h-4分别偶联KLH载体蛋白，并使用多肽-KLH分别免疫2只新西兰白兔(2-2.5KG)，皮下免疫500ug/次，2-3周免疫一次，免疫4次。采血检测，通过间接ELISA方法确定抗血清针对蛋白的效价，待效价大于1:50,000进行最终采血制备抗血清，并准备纯化；

抗体纯化

将多肽Fib-h-1，Fib-h-2，Fib-h-3和Fib-h-4分别与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，将所得抗血清与PBS等量混合后缓慢上样，待抗原抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体，立即在PBS中进行4度透析过夜，隔日进行纯度，浓度和效价测定；

抗体鉴定

通过ELISA检测纯化抗体的效价分别为Ab-Fib-h-1>1:512,000；Ab-Fib-h-2>1:128,000；Ab-Fib-h-3>1:512,000,Ab-Fib-h-4>1:512,000，利用BCA蛋白浓度测定试剂盒对所得抗体进行浓度测定,其浓度分别为Ab-Fib-h-1为5.4mg/ml；Ab-Fib-h-2为2.1mg/ml；Ab-Fib-h-3为3.8mg/ml；Ab-Fib-h-4为1.45mg/ml，通过抗原多肽和抗体的点杂交，其结果如图1所示，表明各个抗体只识别自身抗原，有很好的抗原识别性。

实施例2

抗原对桑蚕丝丝腺组织丝素重链蛋白的识别

利用实施例1中步骤获得的抗体，对桑蚕DZ品种5龄后部丝腺进行免疫荧光实验，如附图2所示，结果表明这些抗体都能明显的检测到丝腺细胞内的丝素蛋白和部分腺腔内的未组装蛋白。同时，提取DZ品种5龄后部丝腺总蛋白，利用3-8％梯度胶进行SDS-PAGE及免疫印迹实验，结果表明抗体都能特异的识别丝素重链，如附图3所示。以上研究结果表明，制备的丝素重链蛋白多肽抗体能很好的特异识别丝素重链蛋白。

实施例3

利用实施例1中的抗体，检测丝绸布料是否含桑蚕丝。

取蚕茧、蚕丝及各种布料各5㎎，离心管中剪碎，剪碎后加入600μl 9M饱和硫氢化锂，室温震荡30min，然后置入60℃烘箱溶解5h以上，4℃10000rpm离心10min，取上清，再用8M尿素进行10倍稀释进行点杂交实验。如图4所示，从点杂交实验结果可见，Fib-h的各个抗体可在茧、生丝、熟丝及佳华丝绸公司提供的丝绸制品中检测到很强的信号，而在淘宝网购的丝绸面料中未检测到信号，表明其不含桑蚕丝，是明显的桑蚕丝仿冒品。

实施例4

检测桑蚕丝面膜基布是否含桑蚕丝纤维

利用实施例1中的抗体，检测目前市面上用桑蚕丝纤维做基本的面膜。具体的操作步骤为：首先裁取各种面膜基布，水洗3次，60℃烘箱展平烘干，将这些基布在离心管中剪碎，加入200uL CaCl

实施例5

检测面膜液中是否含有丝素蛋白

利用实施例1中的抗体，检测目前市面上用桑蚕丝纤维做基布的面膜液或者其他面膜液中是否含丝素蛋白。取5龄7天的中部丝腺的前部内容物，用1ⅹPBS(PH＝7.4)进行25倍稀释后，与清透净颜蚕丝面膜、舒缓保湿蚕丝面膜及壳聚糖生物膜体3种面膜液的2倍稀释液进行点杂交实验。从点杂交实验结果图6所示，Fib-h的4个抗体在阳性对照DZ丝腺组织内容物25倍稀释液中检测到明显信号，在蚕丝面膜基布面膜液中检测到微弱信号，表明这两种蚕丝面膜基布的面膜液中含有微量的丝素蛋白，推测是面膜基布中的丝素蛋白有微量的溶解在面膜液中。另一种非蚕丝面膜中是完全不含有丝素蛋白。

以上即为本实施例列举的实施方式，但本实施例不局限于上述可选的实施方式，本领域技术人员可根据上述方式相互任意组合得到其他多种实施方式，任何人在本实施例的启示下都可得出其他各种形式的实施方式。上述具体实施方式不应理解成对本实施例的保护范围的限制，本实施例的保护范围应当以权利要求书中界定的为准，并且说明书可以用于解释权利要求书。

　　序列表

　　SEQUENCE LISTING

　　<110> 西南大学

　　<120> 一种桑蚕丝丝素重链蛋白多克隆抗体及其制备方法和应用

　　<160> 4

　　<170> PatentIn version 3.3

　　<210> 1

　　<211> 11 bp

　　<212> DNA

　　<213> 人工合成

　　<220>

　　<223> Fib-h-1

　　<400> 1

GGYSRSDGYEY 11

　　<210> 2

　　<211> 10 bp

　　<212> DNA

　　<213> 人工合成

　　<220>

　　<223> Fib-h-2

　　<400> 2

AWSSESDFGT 10

<210> 3

<211> 14 bp

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> Fib-h-3

<400> 3

SASSRSYDYSRRNV 14

　　<210> 4

　　<211> 17 bp

　　<212> DNA

　　<213> 人工合成

　　<220>

　　<223> Fib-h-4

　　<400> 4

QITTKKMQRKNK 12