一种用于外泌体的高效制备装置及制备方法

技术领域

本发明属于外泌体制备技术领域，具体涉及用于外泌体的高效制备装置及制备方法。

背景技术

1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，后经研究多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，而外泌体的主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中；

所有培养的细胞类型也可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中，外泌体被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，对外泌体的研究日益增长，研究其功能还是了解如何将其运用于其它领域；比如外泌体在免疫中抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等生理病理上起着重要的作用，同时，不同细胞分泌的外泌体具有不用的组成成分和功能，可作为疾病诊断的生物标志物；

目前提取外泌体的方法比较多，流行的提取试剂盒、超速离心法等等，超速离心法主要利用外泌体大小、密度等与周围环境物质的差异进行分离，其缺点是对离心设备要求高，成本高，需反复离心，操作步骤复杂，离心力大，可能破坏外泌体结构，因此获得的外泌体吸收率不高，而提取试剂盒最大的问题是试剂成本高，提取量较小，根本无法实现量产，外泌体由于存在种类多、含量低、不易保存等特点，一直属于实验室研究阶段；

因些，需要研发一种提取生物外泌体的高效制备装置及制备方法来解决现有的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于外泌体的高效制备装置及制备方法，以解决外泌体制备过程中产量较少且时间长的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于外泌体的高效制备装置，包括：

通过碳纳米管复合滤层将细胞外液中需去除的物质层析后得到外液半成品的层析机构；

与层析机构相连接，用于将外液半成品纯化得到外泌体的纯化单元；

与层析机构和纯化单元相连接用于实时获取检测参数并将此检测参数发送给控制器的检测单元；

与检测单元相连接用于发送控制指令的控制器。

优选的，所述层析机构包括：

第一层析管,所述第一层析管内设置有孔径为1400 nm -1200 nm的碳纳米管复合滤层；

第二层析管,所述第二层析管内置有孔径为900nm-1000 nm的碳纳米管复合滤层；

第三层析管,所述第三层析管内置有孔径为600nm-800 nm的碳纳米管复合滤层；

其中，所述碳纳米管复合滤层为碳纳米管复合石墨烯滤层。

优选的，所述检测单元包括：

与层析机构相连接并用于检测流经的气泡数量的气泡检测组件；

与层析机构相连接并用于获取检测体的PH数值的PH检测组件；

与层析机构相连接并用于获取检测体的电导率数值的电导检测组件；

与层析机构相连接并用于通过特定波长入射光进入检测体内根据吸光度获取波长数值的UV检测组件；

设置在纯化单元内并用于获取检测体的温度数值的温度传感器；

设置在纯化单元内并用于获取压力数值的压力传感器。

优选的，所述纯化单元包括：

用于将输入的外液半成品纯化处理后获得直径小于200nm外泌体的第一纯化机构；

用于将输入的外液半成品纯化处理后获得直径小于150nm外泌体的第二纯化机构；

用于根据控制器的指令使外液半成品流入第一纯化机构或者第二纯化机构的流路选择阀；

与流路选择阀相连接并用于将外液半成品吸入到流路选择阀的输入端的转料泵。

优选的，所述第一纯化机构包括：

第一纯化箱体；

与流路选择阀相连接使外液半成品喷入第一纯化箱体内的第一喷头；

用于获取第一纯化箱体内外泌体的流出速度数值并发送给控制器的第一纯化流速传感器；

第一纯化载体，所述第一纯化载体的截留值为500kD；

第二纯化载体，所述第二纯化载体的孔径为200nm；

用于接收控制器的指令控制高压气体的输入第一纯化箱体内的第一自清洗控制阀；

所述第二纯化机构包括：

第二纯化箱体；

与流路选择阀相连接使并外液半成品喷入第二纯化箱体内的第二喷头；

用于获取第二纯化箱体内外泌体的流出速度数值并发送给控制器的第二纯化流速传感器；

第三纯化载体，所述第三纯化载体的截留值为500kD；

第四纯化载体，所述第四纯化载体的孔径为200nm；

用于接收控制器的指令控制高压气体的输入第二纯化箱体内的第二自清洗控制阀。

优选的，所述第一纯化箱体为内部空心结构，其顶部中心位置安装第一喷头，第一喷头距离第一纯化载体的距离的为整个箱体高度的2/5,所述第一纯化载体与第二纯化载体的间距为整个箱体高度的1/5, 所述第二纯化载体和第一纯化载体呈同轴分布，且所述第二纯化载体距离底部的高度为整个箱体高度的1/5，所述第一纯化箱体的底部设置第一纯化流速传感器，所述第一纯化流速传感器获取当前的外泌体流出速度，并将此数值实时发送给控制器，所述控制器将第一纯化流速传感器的数据与检测单元的数值处理后发送调节指令给上样泵，并且获取的第一纯化流速传感器的数据与设定的参数对比，达到触发条件时发送指令给流路选择阀或第一自清洗控制阀，所述第一自清洗控制阀接收到指令后打开阀门高压气体从上部依次对第一纯化载体、第二纯化载体清洗；所述第一自清洗控制阀的输出端设置于第一纯化箱体的顶部，所述第一纯化箱体的内壁上设置有用于获取箱体内温度的温度传感器，所述温度传感器将获取数值发送给控制器；且所述第一纯化箱体的底部设置有获取箱体压力的压力传感器，所述压力传感器将获取数值发送给控制器；

其中，所述第一喷头的喷洒面的为弧面结构，其弧面与水平面的最大角度为15度，且所述喷洒面的喷孔的数量为50-80目。

优选的，所述第一层析管为空心的圆柱体结构，且其输入端和输出端均设置有用于连接管塞的连接部，所述连接部的开口内径是管体内径的1.2-1.5倍，所述第一层析管的壁体设置有倒勾型用于限位碳纳米管复合石墨烯的阻塞环，且所述阻塞环距离输入端的长度为整个管体长度的2/5。

优选的，所述第一层析管通过层析支架安装于安装集成板上，所述安装集成板上还通过层析支架安装第二层析管以及第三层析管，且所述第二层析管、第三层析管、第一层析管呈平行分布，并与所述安装集成板的水平面平行，所述第一层析管的内径是第二层析管的2倍，且所述第二层析管的内径是第三层析管内径的1.2倍，所述第一层析管、第二层析管、第三层析管的高度均相同。

优选的，所述第一层析管的输入端与上样泵的输出端相连接，所述上样泵与第一层析管的管路上设置有气泡检测组件，所述气泡检测组件将获取气泡数据发送给控制器，控制器将执行指令发送给上样泵，且所述第一层析管的输出端设置有电导检测组件并与第二层析管的输入端相连接，所述第二层析管的输出端设置有PH检测组件，所述PH检测组件将获取PH数值发送给控制器，且所述PH检测组件与第三层析管的输入端之间设置第一流量传感器，所述第三层析管的输出端与转料泵相连接，所述转料泵与第三层析管之间设置有UV检测组件，所述UV检测组件将液体中的波长数值发送给控制器，所述转料泵与流路选择阀相连接；

其中，所述流路选择阀的输出端设置有第二流量传感器,所述第二流量传感器将管道流速数值发送给控制器。

本发明另提供一种用于外泌体的高效制备装置及制备方法，包括以下步骤：

步骤1、细胞外液通过上样泵吸入到第一层析管中，吸入时气泡检测组件获取流过的气泡数值并发送给控制器第一层析管中孔径为1400nm-1200 nm的碳纳米管复合石墨烯滤层将较大杂质层析后流入到电导检测组件内，电导检测组件获取电导数值发送给控制器；

步骤2、步骤1中处理后的细胞外液流入到第二层析管中, 第二层析管中孔径为900nm-1000 nm的碳纳米管复合石墨烯滤层层析掉细胞碎片后流入到PH检测组件中，获取PH值数值后，此时设置在PH检测组件输出端的第一流量传感器获取实时流量信息并发送给控制器，所述控制器根据气泡数值、电导数值、PH数值以及流量数据对上样泵的功率调整；

步骤3、步骤2处理后的细胞外液进入第三层析管中孔径为600nm-800 nm的碳纳米管复合石墨烯滤层将凋亡小体过滤掉流入到UV检测组件，UV检测组件若检测到波长小于400nm，则流路选择阀切换至第一纯化箱体，否则切换至第二纯化箱体；

步骤4、流入第一纯化箱体后通过截留值为500kD的第一纯化载体，去除掉小颗粒后流入到孔径为200nm的第二纯化载体；如果流入第二纯化箱体后通过截留值为500kD的第三纯化载体，除去小颗粒后流入到孔径为150nm的第四纯化载体，即可得到外泌体。

本发明的技术效果和优点：该用于外泌体的高效制备装置及制备方法，实现了流水线生产，大大提高外泌体生产效率，减少人力物力消耗，占地少；是传统制备时间的1/4，效率提高8倍，获得率提高两倍,在羊膜干细胞工程化收集外泌体已经能达到100ml可制备8mlCB溶液；具体有如下优点：

1、通过第一层析管、第二层析管、第三层析管逐步对大分子的层析，提高了层析的效果，减少了层析中不彻底对纯化工艺的影响；

2、通过第一层析管、第二层析管、第三层析管设置的不同规格的碳纳米管复合石墨烯滤层，石墨烯和碳纳米管具有非常优良的物理化学性质，由于石墨烯和碳纳米管间得协同效应，使得石墨烯、碳纳米管复合材料的导电性，机械性等性能得到增强，提高了层析的速度；

3、通过检测单元对层析过程中的实时数据获取经控制器的处理，解决了制备过程中生产周期长的问题；

4、通过流路选择阀将半成品实行不同的纯化工艺，提高了纯化的速度；

5、通过设置的第一纯化载体和第二纯化载体，提高了制备的纯度；

6、通过第一自清洗控制阀，解决了纯化工作过程的堵塞造成纯化效果降低，使用高压气体实现了自清洗。

附图说明

图1为本发明的结构示意图；

图2为本发明正视图；

图3为本发明右视图；

图4为本发明左视图；

图5为本发明第一纯化机构和第二纯化机构未安装盖板的结构图；

图6为本发明用电部件连接示意图；

图7为本发明制备方法流程图。

图中：11、第一层析管；12、第二层析管；13、第三层析管；14、上样泵；15、第一层析泵；16、第二层析泵；20、流路选择阀；21、第一纯化机构；22、第二纯化机构；23、转料泵；30、层析支架；40、连接部；50、控制器；51、交互终端；61、气泡检测组件；62、PH检测组件；63、电导检测组件；64、UV检测组件；65、压力传感器；66、温度传感器；67、第一流量传感器；68、第二流量传感器；211、第一纯化箱体；212、第一喷头； 213、第一纯化载体；214、第二纯化载体；215、第一自清洗控制阀；216、第一纯化流速传感器； 223、第三纯化载体；224、第四纯化载体；225、第二纯化流速传感器；226、第二自清洗控制阀。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了如图1中所示的一种用于外泌体的高效制备装置，包括：

层析机构，用于将细胞外液中需去除的物质通过碳纳米管复合石墨烯层析出并得到外液半成品；所述层析机构包括：

第一层析管11,设置有孔径为1400 nm -1200 nm的碳纳米管复合石墨烯滤层；

第二层析管12,内置有孔径为900nm-1000 nm的碳纳米管复合石墨烯滤层；

第三层析管13,内置有孔径为600nm-800 nm的碳纳米管复合石墨烯滤层；逐步对大分子的层析，提高了层析的效果，减少了层析中不彻底对纯化工艺的影响；设置的不同规格的碳纳米管复合石墨烯层析体提高了层析的速度；

值得注意的是，所述第一层析管11为空心的圆柱体结构，且其输入端和输出端均设置有用于连接管塞的连接部40，所述连接部40的开口内径是管体内径的1.2-1.5倍，所述第一层析管11的壁体设置有倒勾型用于限位碳纳米管复合石墨烯的阻塞环，且所述阻塞环距离输入端的长度为整个管体长度的2/5；

如图2、图3、图4所示，所述第一层析管11通过层析支架30安装于安装集成板上，所述安装集成板上还通过层析支架30安装第二层析管12以及第三层析管13，且所述第二层析管12、第三层析管13、第一层析管11呈平行分布，并与所述安装集成板的水平面平行，所述第一层析管11的内径是第二层析管12的2倍，且所述第二层析管12的内径是第三层析管13内径的1.2倍，所述第一层析管11、第二层析管12、第三层析管13的高度均相同；

所述第一层析管11的输入端与上样泵14的输出端相连接，所述上样泵14与第一层析管11的管路上设置有气泡检测组件61，所述气泡检测组件61将获取气泡数据发送给控制器50，控制器50将执行指令发送给上样泵14，且所述第一层析管11的输出端设置有电导检测组件63并与第二层析管12的输入端相连接，所述第二层析管12的输出端设置有PH检测组件62，所述PH检测组件62将获取PH数值发送给控制器50，且所述PH检测组件62与第三层析管13的输入端之间设置第一流量传感器67，所述第三层析管13的输出端与转料泵23相连接，所述转料泵23与第三层析管13之间设置有UV检测组件64，所述UV检测组件64将液体中的波长数值发送给控制器50，所述转料泵23与流路选择阀20相连接；

其中，所述流路选择阀20的输出端设置有第二流量传感器68,所述第二流量传感器68将管道流速数值发送给控制器50；

本实施例中，第一层析管11与第二层析管12之间的管道上还设置有第一层析泵15,提高层析的速度；第二层析管12与第三层析管13之间还设置有第二层析泵16,提高层析的速度；第一层析泵15和第二层析泵16均与控制器50相连接；

如图5所示，纯化单元，与层析机构相连接，用于将外液半成品纯化得到外泌体；所述纯化单元包括：

第一纯化机构21，用于将输入的外液半成品纯化处理后获得直径小于200nm外泌体；所述第一纯化机构21包括：

第一纯化箱体211；

第一喷头212，与流路选择阀20相连接使外液半成品喷入第一纯化箱体内211；流路选择阀20将半成品实行不同的纯化工艺，提高了纯化的速度；

第一纯化流速传感器216，用于获取第一纯化箱体211内外泌体的流出速度数值并发送给控制器50；

第一纯化载体213，所述第一纯化载体213的截留值为500kD；

第二纯化载体214，所述第二纯化载体214的孔径为200nm；

第一自清洗控制阀215，用于接收控制器50的指令控制高压气体的输入第一纯化箱体211内；解决了纯化工作过程的堵塞造成纯化效果降低，使用高压气体实现了自清洗；

所述第一纯化箱体211为内部空心结构，其顶部中心位置安装第一喷头212，第一喷头212距离第一纯化载体213的距离的为整个箱体高度的2/5,所述第一纯化载体213与第二纯化载体214的间距为整个箱体高度的1/5, 所述第二纯化载体214和第一纯化载体213呈同轴分布，且所述第二纯化载体214距离底部的高度为整个箱体高度的1/5，所述第一纯化箱体211的底部设置第一纯化流速传感器216，所述第一纯化流速传感器216获取当前的外泌体流出速度，并将此数值实时发送给控制器50，所述控制器50将第一纯化流速传感器216的数据与检测单元的数值处理后发送调节指令给上样泵14，并且获取的第一纯化流速传感器216的数据与设定的参数对比，达到触发条件时发送指令给流路选择阀20或第一自清洗控制阀215，所述第一自清洗控制阀215接收到指令后打开阀门高压气体从上部依次对第一纯化载体213、第二纯化载体214清洗；所述第一自清洗控制阀215的输出端设置于第一纯化箱体211的顶部，所述第一纯化箱体211的内壁上设置有用于获取箱体内温度的温度传感器66，所述温度传感器66将获取数值发送给控制器50；且所述第一纯化箱体211的底部设置有获取箱体压力的压力传感器65，所述压力传感器65将获取数值发送给控制器50，如图6所示；

其中，所述第一喷头212的喷洒面的为弧面结构，其弧面与水平面的最大角度为15度，且所述喷洒面的喷孔的数量为50-80目；

第二纯化机构22，用于将输入的外液半成品纯化处理后获得直径小于150nm外泌体；所述第二纯化机构22包括

第二纯化箱体；

第二喷头；与流路选择阀20相连接使并外液半成品喷入第二纯化箱体内；其结构与第一喷头212相同；

第二纯化流速传感器225，用于获取第二纯化箱体内外泌体的流出速度数值并发送给控制器50；

第三纯化载体223，所述第三纯化载体223的截留值为500kD；

第四纯化载体224，所述第四纯化载体224的孔径为200nm；

第二自清洗控制阀226，用于接收控制器50的指令控制高压气体的输入第二纯化箱体内

流路选择阀20，用于根据控制器50的指令使外液半成品流入第一纯化机构21或者第二纯化机构22；第一纯化机构21或者第二纯化机构22工作原理相同，区别在于第二纯化机构22中不使用第二纯化载体214，更改为第四纯化载体224，所述第四纯化载体224的孔径为200nm；

转料泵23，与流路选择阀20相连接，用于将外液半成品吸入到流路选择阀20的输入端。

检测单元，用于与层析机构和纯化单元相连接，实时获取检测参数，并将此检测参数发送给控制器50；所述检测单元包括：

气泡检测组件61，与层析机构相连接，用于获取流经的气泡数量；

PH检测组件62，与层析机构相连接，用于获取检测体的PH数值；

电导检测组件63，与层析机构相连接，用于获取检测体的电导率数值；

UV检测组件64，与层析机构相连接，用于通过特定波长入射光进入检测体内根据吸光度获取波长数值；

温度传感器66，设置在纯化单元内，用于获取检测体的温度数值；

压力传感器65，设置在纯化单元内，用于获取压力数值。

控制器50，控制器50为内置人工智能处理器的数据处理装置，具有存储与联网接口，用于将获取的检测参数分析处理，并与设定的工艺参数相比对后发送控制指令，本实施例中，控制器与交互终端51相连接；交互终端51用于输入工艺流程，并设置有通讯接口与PC相连接；

本发明另提供一种用于外泌体的高效制备装置及制备方法，如图7所示，包括以下步骤：

步骤1、细胞外液通过上样泵14吸入到第一层析管11中，吸入时气泡检测组件61获取流过的气泡数值并发送给控制器50，第一层析管11中孔径为1400nm-1200 nm的碳纳米管复合石墨烯滤层将较大杂质层析后流入到电导检测组件63内，电导检测组件63获取电导数值发送给控制器50；

步骤2、步骤1中处理后的细胞外液流入到第二层析管12中, 第二层析管12中孔径为900nm-1000 nm的碳纳米管复合石墨烯滤层层析掉细胞碎片以及微囊泡后流入到PH检测组件62中，获取PH值数值后，此时设置在PH检测组件62输出端的第一流量传感器67获取实时流量信息并发送给控制器50，所述控制器50根据气泡数值、电导数值、PH数值以及流量数据对上样泵14的功率调整；

步骤3、步骤2处理后的细胞外液进入第三层析管13中孔径为600nm-800 nm的碳纳米管复合石墨烯滤层将凋亡小体过滤掉流入到UV检测组件64，UV检测组件64若检测到波长小于400nm，则流路选择阀20切换至第一纯化箱体211，否则切换至第二纯化箱体；

步骤4、流入第一纯化箱体211后通过截留值为500kD的第一纯化载体213，去除掉小颗粒后例如游离蛋白流入到孔径为200nm的第二纯化载体214；如果流入第二纯化箱体后通过截留值为500kD的第三纯化载体223，除去小颗粒后例如游离蛋白流入到孔径为150nm的第四纯化载体224，即可得到外泌体；

本发明实现了流水线生产，大大提高外泌体生产效率，减少人力物力消耗，占地少；是传统制备时间的1/4，效率提高8倍，获得率提高两倍,在羊膜干细胞工程化收集外泌体已经能达到100ml可制备8mlCB溶液。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。