用于农残检测的羧酸酯酶1特异性近红外荧光探针及应用

技术领域

本发明属于一种羧酸酯酶1特异性近红外荧光探针的合成与应用，具体涉及荧光探针及其在农药残留检测中的应用。

背景技术

从上世纪90年代至今，国内农药使用量总体呈快速上升趋势，同时中国的农药施用强度也在不断增加。杀虫剂、杀菌剂、除草剂等农药被广泛使用，尤其是有机磷与氨基甲酸酯类高毒性杀虫剂的使用，致使蔬菜水果质量安全控制过程面临着严峻挑战。因此，探索快速高通量、低检测限高准确度农药残留的检测方法对于保障食品安全具有重要意义。目前，国内外传统的农药残留检测技术主要包括气相色谱法、高效液相色谱法及其和质谱技术的联用等，上述方法对样品的前处理过程繁琐、具有破坏性，尤其是检测仪器笨重、价格昂贵的缺点，导致无法实现市场迫切需要的农药残留的快速检测。近年来随着荧光检测技术的快速发展，荧光探针被广泛应用于生物体内酶活性检测。将酶抑制法原理与荧光探针技术相结合，为实现快速高通量、低检测限高准确度检测农药残留提供了新的思路。中国发明专利(ZL201810408171.6)是基于胆碱酯酶和检测其活性的荧光探针的酶抑制方法，开发的一种快速检测氨基甲酸酯和有机磷类农药残留。

羧酸酯酶1(CES1)是人体内羧酸酯酶最主要的亚型之一，主要分布于肝脏中，参与多种外源性物质(如致癌物等环境毒物)的代谢，在机体解毒过程中发挥重要作用。已有报道证实羧酸酯酶1的活性可以被多种农药抑制，并且抑制率与农药浓度之间存在线性关系。但已报导的羧酸酯酶1的荧光探针波长较短，其荧光强度容易受到多种环境因素影响。国家标准GB2763-2021(食品安全国家标准食品中农药最大残留限量，气相色谱及高效液相色谱法)关于农残检出限提出了更高的标准，因此开发具有长波长的可用于农残检测的羧酸酯酶1荧光探针具有十分重要的意义。并且基于羧酸酯酶1酶抑制原理和荧光探针技术开发的农药残留快速检测方法，具有检测快速、操作方便、检测限低等优点

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种用于农残检测的羧酸酯酶1特异性近红外荧光探针及应用，

本发明采用的技术方案为：.一种用于农残检测的羧酸酯酶1特异性近红外荧光探针，所述羧酸酯酶1特异性近红外荧光探针分子结构式如下：

一种羧酸酯酶1特异性近红外荧光探针的合成方法，包括以下步骤：

(1)

将4-羧基苯肼盐酸盐溶于乙醇中，向内加入3-甲基-2-丁酮与浓硫酸，乙醇回流；反应结束，冷却至室温，旋蒸除去部分乙醇，过滤，淋洗，烘干，得到化合物1；

(2)

将化合物1溶于乙腈中，加入2-溴乙醇，回流；反应结束，旋干，得到化合物2；

(3)

将4-(二乙氨基)水杨醛与丙二酸二乙酯溶于乙醇中，加入哌啶，回流；反应结束后旋干，然后将反应物溶于乙酸与浓盐酸混合溶液，回流；反应结束后，将反应液加入冰水中，用氢氧化钠溶液调节pH至有固体析出，抽滤，烘干，得到化合物3；

(4)

将三氯氧磷与DMF混合加热，将化合物3溶于DMF中，在氮气保护下滴加到反应液中，加热；反应结束后，将反应液加入冰水中，用氢氧化钠调节pH至有固体析出，抽滤，烘干，得到化合物4；

(5)

将化合物2与化合物4溶于四氢呋喃与乙醇的混合溶剂中，加入醋酸铵，加热；反应结束后，旋干，采用硅胶层析柱色谱分离法分离提纯得到化合物5；

(6)

将化合物5溶于甲醇中，加入浓硫酸，回流；反应结束后，旋干，采用硅胶层析柱色谱分离法分离提纯得到化合物CHC-CE1。

所述步骤(1)中4-羧基苯肼盐酸盐与3-甲基-2-丁酮的摩尔比为1:1.5～2.5；加入浓硫酸的量为1～3毫升；

所述步骤(2)中化合物1与溴乙醇的摩尔比为1：5～10；

所述步骤(3)中4-(二乙氨基)水杨醛与丙二酸二乙酯的摩尔比为1：1.5～2.5；加入哌啶的量为1～3毫升；乙酸与浓盐酸的体积比为1：0.5～1.5；氢氧化钠溶液浓度为30％～50％；

所述步骤(4)中三氯氧磷与DMF混合溶液的体积比为1：0.5～1.5；氢氧化钠浓度为15％～30％；

所述步骤(5)中化合物4与化合物2的摩尔比为1：1.5～2.5；柱层析所用洗脱剂为体积比20：1的二氯甲烷：甲醇；

所述步骤(6)中加入浓硫酸体积为0.5～1.5毫升；柱层析所用洗脱剂为体积比50：1的二氯甲烷：甲醇。

所述探针通过酶抑制法定性或定量检测食品中的农药残留。

酶抑制定量检测食品中的农药残留的方法为：先将待测样品溶液与磷酸盐缓冲液和二甲基亚砜的缓冲溶液混合，加入羧酸酯酶1溶液反应，再加入探针溶液，利用荧光强度与空白对照组的强度差值计算抑制率，判断样品中农药残留的浓度。

荧光强度是指荧光光谱中670nm处荧光峰值。

本发明的有益效果：

本申请通过改变探针的水解基团，开发了羧酸酯酶1特异性荧光探针CHC-CE1。该探针具有发射波长较长(最大发射波长为670nm)能够避免检测体系自发荧光的干扰；具有对羧酸酯酶1的高选择性与较强的抗干扰能力(探针对羧酸酯酶1的响应是其他内源性物质的10倍以上)。将该探针应用于农残检测中，能够快速准确的测定给定样品中的农药含量，回收率在80％-110％。

附图说明

图1是羧酸酯酶1与荧光探针CHC-CE1的荧光响应机制。

图2是羧酸酯酶1与荧光探针CHC-CE1反应前后测试体系的吸收与发射光谱。

图3是不同浓度羧酸酯酶1与荧光探针CHC-CE1反应后荧光强度曲线。

图4是荧光探针CHC-CE1选择性与抗干扰能力图。

图5是17种农药在标准浓度下对羧酸酯酶1的抑制率图。

图6是四种农药与羧酸酯酶1抑制率的标准曲线图。

图7是18种常用二元联合农药在标准浓度下对羧酸酯酶1的抑制率图。

图8是24种常用三元联合农药在标准浓度下对羧酸酯酶1的抑制率图。

具体实施方式

实例1：荧光探针CHC-CE1的合成

合成路线：

具体实施步骤如下：

(1)将4-羧基苯肼盐酸盐(9.4g，50mmol)溶于100毫升乙醇中，向内加入3-甲基-2-丁酮(8.6g，100mmol)与2毫升浓硫酸，回流6h。反应结束，冷却至室温，旋蒸除去部分乙醇，过滤，并用少量水淋洗，烘干，得到7.82g化合物1，产率68％。

(2)将化合物1(4.6g，20mmol)溶于50毫升乙腈中，加入2-溴乙醇(12.5g，100mmol)，回流12h。反应结束，旋干，得到化合物2。

(3)将4-(二乙氨基)水杨醛(10.6g，55mmol)与丙二酸二乙酯(17.6g，110mmol)溶于110毫升乙醇中，加入2毫升哌啶，回流3h。反应结束后旋干，然后将反应物溶于50毫升乙酸与50毫升浓盐酸混合溶液，回流3h。反应结束后，将反应液加入冰水中，用40％氢氧化钠溶液调节pH至有大量固体析出，抽滤，烘干，得到10.2g化合物3，产率85％。

(4)将10毫升三氯氧磷与10毫升DMF混合，50℃加热0.5h，将化合物3(4.4g，20mmol)溶于20毫升DMF中，在氮气保护下滴加到反应液中，50℃加热5h。反应结束后，将反应液加入冰水中，用20％氢氧化钠溶液调节pH至有大量固体析出，抽滤，烘干，得到3.3g化合物4，产率67％。

(5)将化合物2(8.5g，26mmol)与化合物4(3.2g，13mmol)溶于10毫升四氢呋喃与40毫升乙醇的混合溶剂中，加入醋酸铵(7.7g，100mmol)，50℃加热24h。反应结束后，旋干，采用硅胶层析柱色谱分离法分离提纯，所用洗脱剂为体积比20：1的二氯甲烷：甲醇，得到1.2g化合物5，产率17％。

(6)将化合物5(110mg，0.2mmol)溶于20毫升甲醇中，加入1毫升浓硫酸，回流5h。反应结束后，旋干，采用硅胶层析柱色谱分离法分离提纯，所用洗脱剂为体积比50：1的二氯甲烷：甲醇，得到33mg化合物CHC-CE1，产率29％。

实施例2：羧酸酯酶1与荧光探针CHC-CE1反应前后测试体系的吸收与发射光谱的测定将探针分子CHC-CE1加入到100mM磷酸缓冲液(pH 7.4)中，使得探针终浓度为10μM，同时孵育体系中加入一定浓度的CES1，两者于37℃共孵育60min，随后加入100μL冰乙腈终止反应，然后20000g,4℃离心20min,上清液于酶标仪进行吸收光谱(400-700nm)和荧光发射光谱(ex:600nm,em:626-800nm)扫描，绘制其光谱曲线。

实施例3：不同浓度羧酸酯酶1与荧光探针CHC-CE1反应后荧光强度曲线的测定

在标准孵育体系中(100mM磷酸缓冲液，pH 7.4)，加入不同浓度的CES1(1-9μg/mL)与探针分子CHC-CE1于37℃共孵育30min，随后加入冰乙腈沉淀蛋白终止实验反应，并且对不同浓度CES1下荧光发射光谱响应进行检测；最后将探针分子反应后670nm处的荧光响应值与CES1的蛋白浓度进行线性回归，获得酶线性方程。

实施例4：荧光探针CHC-CE1选择性与抗干扰能力的测定

在标准孵育体系中，将探针分子CHC-CE1与不同内源性物质包括：Ser、Glu、Trp、Cys、Arg、Cys、Lys、Gly、Gln、myristic acid、GSH、glucose、和金属离子Ca

如图4所示，荧光探针CHC-CE1对羧酸酯酶1的响应是对其他内源性物质和金属离子响应的10倍左右，具有很好的抗外界干扰能力。

实施例5：农药的浓度与羧酸酯酶1活性抑制率标准曲线测定

(1)取PBS溶解后的17种农药(终浓度分别为标准浓度的0.5，1.0，2.0与3.0倍)475μL，加入25mL的1000μg/mL HLM水溶液(终浓度为50μg/mL)，在37℃孵育锅中预孵反应3min；

(2)取预孵溶液300μL加入荧光探针CHC-CE1(终浓度10μmol/L)进行反应；

(3)30分钟后加入200μL冰乙腈沉淀蛋白终止催化反应，然后在4℃，20000g条件下，离心10min，取上清液于比色皿中；

(4)启动荧光检测仪(Angelay-600A型，下同)，与手机APP连接，激发波长设置为600nm，发射信号采集为670nm；

(5)将比色皿放入检测仪，在手机APP上读取数据，保存；

(6)酶活性抑制率计算公式：抑制率(％)＝[(A

式中，A

(7)选取标准曲线R

(8)四种农药的线性方程、R

表1四种农药的线性方程、R

实施例6：二元与三元农药组合使用与羧酸酯酶1活性抑制率测定

(1)取PBS溶解后的多元农药组合(每种农药终浓度均为该农药标准浓度)475μL，加入25mL的1000μg/mL HLM水溶液(终浓度为50μg/mL)，在37℃孵育锅中预孵反应3min；

(2)取预孵溶液300μL加入荧光探针CHC-CE1(终浓度10μmol/L)进行反应；

(3)30分钟后加入200μL冰乙腈沉淀蛋白终止催化反应，然后在4℃，20000g条件下，离心10min，取上清液于比色皿中；

(4)启动荧光检测仪，与手机APP连接，激发波长设置为600nm，发射信号采集为670nm；

(5)将比色皿放入检测仪，在手机APP上读取数据，保存；

(6)酶活性抑制率计算公式：抑制率(％)＝[(A

式中，A

实施例7：果蔬中农残萃取方法

蔬菜、水果的可食用部分，称取试样0.3g于2mL的离心管中，加入1.5mL萃取液(乙酸乙酯/丙酮＝9:1)，在震荡混合器萃取5min。离心后，取100μL上清液至2mL离心管中，吹干。加入0.6mL PBS(100mM,pH＝7.4)溶解，待测。

实施例8：农药残留检测方法

(1)取PBS溶解后的萃取液475μL，加入25mL的1000μg/mL HLM水溶液(终浓度为50μg/mL)，在37℃孵育锅中预孵反应3min；

(2)取预孵溶液300μL加入荧光探针CHC-CE1(终浓度10μmol/L)进行反应；

(3)30分钟后加入200μL冰乙腈沉淀蛋白终止催化反应，然后在4℃，20000g条件下，离心10min，取上清液于比色皿中；

(4)启动荧光检测仪，与手机APP连接，激发波长设置为600nm，发射信号采集为670nm；

(5)将比色皿放入检测仪，在手机APP上读取数据，保存；

(6)酶活性抑制率计算公式：抑制率(％)＝[(A

式中，A

实施例9：测试果蔬样品中农药加标回收实验

称取一定质量的苹果、西红柿、青辣椒、芹菜各7份，其中2份做空白对照组(不喷洒农药)，5份作为实验组。在0.30g果蔬表面喷洒氯氰菊酯(甲醇溶，15mg/L)20μL，室温下晾干后(20-30min左右)，按照实施例7进行萃取，最后按照实施例8检测，根据抑制率计算结果再乘以总稀释倍数。将得到的抑制率代入到之前得到的抑制率-农药浓度标准曲线方程中，得到计算浓度，求得加标回收率。

表2 氯氰菊酯加标回收率

表3 高效氯氰菊酯加标回收率

表4 哒螨灵加标回收率

表5 咪鲜胺加标回收率

本发明的检测方法，对果蔬中农残的加标回收率达到行业80～110％标准。

表6 17种农药名称与其对应序号