一种从巴西橡胶树胶乳提取和纯化小橡胶粒子蛋白的方法

技术领域

本公开涉及蛋白质组学技术领域，尤其涉及一种从巴西橡胶树胶乳提取和纯化小橡胶粒子蛋白的方法。

背景技术

胶乳是割胶后从巴西橡胶树乳管(由乳管细胞形成的网状组织)中流出的白色汁液，是天然橡胶的主要来源。橡胶粒子是存在于胶乳中的亚细胞结构，负责合成和储存天然橡胶；小橡胶粒子特指直径小于200nm，需较大离心力方可收集的橡胶粒子。小橡胶粒子蛋白是小橡胶粒子中含量最高的蛋白，分子量约24kDa，占小橡胶粒子总蛋白含量的60％以上。

目前，唯一报道(Wititsuwannakul et.al.,2008)的从橡胶树胶乳纯化小橡胶粒子蛋白的方法是：首先从胶乳分离出小橡胶粒子(含大量小橡胶粒子蛋白)，再从小橡胶粒子提取和纯化小橡胶粒子蛋白。具体如下：通过差速离心从胶乳分离小橡胶粒子，从小橡胶粒子提取总蛋白(用含0.2％ Triton X100溶液提取过夜)，使用丙酮沉淀提取的蛋白，再用50mM Tris–HCl溶液溶解总蛋白，70℃加热5min沉淀大部分非目标蛋白，收集上清(上清中含目标蛋白和橡胶延伸因子)，上清中的蛋白经浓缩，先后进行凝胶过滤层析和DEAE离子交换层析，最终获得纯化的小橡胶粒子蛋白。

上述提取和纯化方法存在以下缺陷：(1)需先差速离心收集小橡胶粒子，通常还需对小橡胶粒子进行多次洗涤，由于小橡胶粒子需在较高的离心力多次离心，易发生凝固并造成样品损失，且这些步骤繁琐且耗时；(2)使用低浓度的去垢剂长时间提取蛋白质(0.2％Triton X100提取过夜)，低效费时；(3)原方法作者称在70℃加热沉淀蛋白可选择性沉淀其它蛋白，而小橡胶粒子蛋白和橡胶延伸因子蛋白保持溶解，其他的研究者则指出小橡胶粒子蛋白和橡胶延伸因子蛋白(橡胶粒子的另一个高丰度蛋白)有自聚集而发生沉淀的倾向，即在不加热的情况下这两个蛋白也会自发沉淀，因此加热并不能选择性地将目标蛋白与大部分非目标蛋白分离。需有一种高效、省时的分离目标蛋白与非目标蛋白的方法。

发明内容

本公开提供了一种从巴西橡胶树胶乳提取和纯化小橡胶粒子蛋白的方法，以至少解决现有技术中存在的操作步骤过于繁琐费时的问题。

本公开提供了一种从巴西橡胶树胶乳提取和纯化小橡胶粒子蛋白的方法，所述方法包括：

向橡胶树胶乳中加入碱性缓冲溶液以稳定胶乳；

先后加入强阴离子去垢剂和有机溶剂，沉淀胶乳中除小橡胶粒子蛋白外的大部分蛋白质和以橡胶烃为主的固体物质；离心收拢固形物，并转移澄清的液体部分即蛋白粗提液；

向蛋白粗提液中加入硫酸铵并振荡使蛋白质沉淀，析出的沉淀为蛋白粗提物；

通过离子交换层析分离蛋白粗提物，收集主洗脱峰；

沉淀离子交换主洗脱峰所含蛋白质，小橡胶粒子蛋白为主要成分；

通过凝胶过滤层析对离子交换主洗脱峰所含蛋白质进一步分离，获得纯化的小橡胶粒子蛋白。

在一可实施方式中，先后加入强阴离子去垢剂和有机溶剂，沉淀胶乳中除小橡胶粒子蛋白外的大部分蛋白质和以橡胶烃为主的固体物质，包括：

向橡胶树胶乳中加入强阴离子去垢剂至其浓度为0.5-2％，在冰上振荡孵育10-60min；

再加入有机溶剂，振荡10-60min，沉淀胶乳中除小橡胶粒子蛋白外的大部分蛋白质和以橡胶烃为主的固体物质。

在一可实施方式中，所述橡胶树胶乳与有机溶剂的体积比为1:0.3至1:2。

在一可实施方式中，所述蛋白粗提液中含有小橡胶粒子蛋白，从蛋白粗提液沉淀蛋白成分，沉淀后得到蛋白粗提物，包括：

向蛋白粗提液中加入硫酸铵并振荡，离心收集并转移上层有机相和下层水相之间的蛋白沉淀；

加入超纯水，分散并洗涤所述蛋白沉淀，以除去盐份；

再将除盐的蛋白沉淀溶解，得到蛋白粗提物。

在一可实施方式中，离子交换层析为阴离子交换或阳离子交换。

在一可实施方式中，通过阴离子交换层析分离蛋白粗提物，流动相包括：A，3-9M尿素，10-50mM Tris-HCl，pH 6-9；B：3-9M尿素，10-50mM Tris-HCl，1M氯化钠，pH 6-9。

在一可实施方式中，通过阳离子交换层析分离蛋白粗提物，流动相包括：A：3-9M尿素，10-50mM乙酸或丁二酸、棕檬酸、乳酸，pH 2-4.2；B：3-9M尿素，10-50mM乙酸或丁二酸、棕檬酸、乳酸，1M氯化钠，pH 2-4.2。

在一可实施方式中，沉淀离子交换主洗脱峰所含蛋白，包括：

将离子交换主洗脱峰组分、硫酸铵、醇类试剂混匀，离心后转移中间层的蛋白沉淀；

将蛋白沉淀分散于超纯水中，洗去盐份，再次离心收拢蛋白沉淀。

在一可实施方式中，离子交换主洗脱峰组分、4M硫酸铵、醇类试剂的体积比为1：(0.1-0.5)：(0.2-2)。

在一可实施方式中，通过凝胶过滤层析对离子交换主洗脱峰所含蛋白质进一步分离，获得纯化的小橡胶粒子蛋白，包括：

将蛋白沉淀溶解于流动相中，进行凝胶过滤层析并收集洗脱组分，其中流动相包括：1)50-250mM氯化钠，2)3-9M尿素或0.2-2％在280nm波长下无紫外吸收的去垢剂；

沉淀主洗脱组分中的蛋白并脱盐，得到纯化的小橡胶粒子蛋白。

本发明提供一种从巴西橡胶树胶乳提取和纯化小橡胶粒子蛋白的方法，先采集橡胶树中的胶乳，向橡胶树胶乳中加入碱性缓冲溶液以稳定胶乳；加入强阴离子去垢剂和有机溶剂，选择性地沉淀胶乳中小橡胶粒子蛋白以外的大部分蛋白，同时沉淀以橡胶烃为主的固体物质；通过离心收拢固体物质，并转移澄清的液体部分即蛋白粗提液，向蛋白粗提液中加入硫酸铵并振荡使蛋白沉淀，析出的沉淀为蛋白粗提物；通过离子交换层析分离蛋白粗提物，收集主洗脱峰；再沉淀离子交换主洗脱峰所含蛋白质，小橡胶粒子蛋白为主要成分；最后通过凝胶过滤层析对离子交换主洗脱峰所含蛋白质进一步分离，获得纯化的小橡胶粒子蛋白。本发明直接从橡胶树胶乳中提取和纯化小橡胶粒子蛋白，通过使用强阴离子去垢剂(低浓度)和有机溶剂沉淀胶和去除大部分胶乳蛋白质，仅保留以小橡胶粒子蛋白为主的少数几种蛋白质，减少了柱层析纯化前蛋白样本的复杂性；在蛋白提取和层析组分浓缩时均采用三相法沉淀蛋白，简化了操作步骤，极大节省了操作时间。因此，本发明的提取和纯化方法，高效省时地分离目标蛋白与非目标蛋白。

应当理解，本部分所描述的内容并非旨在标识本公开的实施例的关键或重要特征，也不用于限制本公开的范围。本公开的其它特征将通过以下的说明书而变得容易理解。

附图说明

通过参考附图阅读下文的详细描述，本公开示例性实施方式的上述以及其他目的、特征和优点将变得易于理解。在附图中，以示例性而非限制性的方式示出了本公开的若干实施方式，其中：

在附图中，相同或对应的标号表示相同或对应的部分。

图1示出了本公开实施例提供的一种从橡胶树胶乳提取和纯化小橡胶粒子蛋白的方法的流程示意图；

图2示出了本公开实施例提取胶乳蛋白与纯化小橡胶粒子蛋白过程中蛋白样本的SDS凝胶电泳图；

图3示出了本公开实施例小橡胶粒子蛋白的柱层析纯化过程，A图为阴离子交换分离过程；B图为凝胶过滤层析分离过程。

具体实施方式

为使本公开的目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将结合本公开实施例中的附图，对本公开实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本公开一部分实施例，而非全部实施例。基于本公开中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本公开保护的范围。

本发明提供一种从巴西橡胶树胶乳提取和纯化小橡胶粒子蛋白的方法，如图1示出了该方法的流程示意图，该方法包括如下步骤：

S1、向橡胶树胶乳中加入碱性缓冲溶液以稳定胶乳；

本发明的橡胶树以巴西橡胶树为例进行说明，在胶园割胶并收集胶乳，收集胶乳的离心管置于冰上，向胶乳中加入碱性缓冲溶液，例如Tris-HCl缓冲液(pH>7)，使胶乳呈碱性以保持胶乳稳定。

S2、先后加入强阴离子去垢剂和有机溶剂，沉淀胶乳中除小橡胶粒子蛋白外的大部分蛋白(小橡胶粒子蛋白未沉淀)和以橡胶烃为主的固体物质；离心收拢固体物质，并转移澄清的液体部分即蛋白粗提液；

具体的，先后加入强阴离子去垢剂和有机溶剂，沉淀胶乳中除小橡胶粒子蛋白外的大部分蛋白质和以橡胶烃为主的固体物质，包括：

S21、向橡胶树胶乳中加入强阴离子去垢剂至其浓度为0.5-2％，在冰上振荡孵育10-60min；

S22、再加入有机溶剂，振荡10-60min，沉淀胶乳中除小橡胶粒子蛋白外的多数蛋白和橡胶烃为主的固体物质。

优选强阴离子去垢剂，例如十二烷基硫酸钠(SDS)或十二烷基磺酸钠，阴离子去垢剂的浓度在0.05％-2％之间，加入阴离子去垢剂后，将离心管置于冰上振荡10-60min，振荡提取过程中低浓度的强阴离子去垢剂的负电基团与蛋白质的正电基团结合，去垢剂与蛋白质发生共沉淀。再按胶乳与有机溶剂(如乙腈)体积比1:0.3至1：2加入有机溶剂，振荡10-60min，使橡胶烃、膜碎片、蛋白质等凝聚和沉淀，振荡结束，对离心管内的混合液进行离心，直至离心管内的液体澄清(小橡胶粒子蛋白主要在液体部分)。通过强阴离子去垢剂和有机溶剂沉淀胶乳中大部分蛋白质，保留以小橡胶粒子蛋白为主的少数几种蛋白质，从而减少了后续纯化过程样本的复杂性。

S3、向蛋白粗提液中加入硫酸铵并振荡使蛋白沉淀，析出的沉淀为蛋白粗提物；

在一个示例中，蛋白粗提液中含有小橡胶粒子蛋白，沉淀后得到蛋白粗提物，包括：

S31、向蛋白粗提液中加入硫酸铵并振荡，离心收集并转移上层有机相和下层水相之间的蛋白沉淀；

S32、加入超纯水，分散并洗涤所述蛋白沉淀，以除去盐份；

S33、再将除盐的蛋白沉淀溶解，得到蛋白粗提物。

澄清的蛋白粗提液转移至新离心管，然后按蛋白粗提液体积的10-100％加入4M硫酸铵，将离心管置于摇床振荡，使蛋白形成沉淀析出，离心后，蛋白沉淀位于有机相和水相之间。将两相界面处的蛋白沉淀(中间相)用移液器转移至新的离心管再次离心，收集蛋白沉淀。按照蛋白沉淀体积的4-20倍加入超纯水，分散并洗涤蛋白沉淀，然后离心收集蛋白沉淀，以去除盐份。也可先用含尿素或去垢剂的溶液溶解蛋白沉淀，再用有机溶剂沉淀出蛋白质，以去除盐份等杂质，去除盐份的蛋白质再用适当溶剂溶解。

S4、通过离子交换层析分离蛋白粗提物，收集主洗脱峰；

离子交换层析分离蛋白粗提物，可通过阴离子交换，也可通过阳离子交换层析。

若通过阴离子交换层析分离蛋白粗提物，使用强阴离子交换柱(Q，季铵盐树脂)或弱阴离子交换柱，流动相包括：A，3-9M尿素，10-50mM Tris-HCl，pH 6-9；B，3-9M尿素，10-50mM Tris-HCl，1M氯化钠，pH 6-9。上样后先用80mM NaCl清洗2个柱体积以去除部分非目标蛋白，再使用线性梯度洗脱，目标蛋白(即小橡胶粒子蛋白)的洗脱范围为80-200mMNaCl。

若通过阳离子交换层析分离蛋白粗提物，流动相包括：A：3-9M尿素，10-50mM乙酸或丁二酸、棕檬酸、乳酸，pH 2-4.2；B：3-9M尿素，10-50mM乙酸或丁二酸、棕檬酸、乳酸，1M氯化钠，pH 2-4.2。

S5、沉淀离子交换主洗脱峰所含蛋白质，小橡胶粒子蛋白为主要成分；

在一个示例中，沉淀离子交换主洗脱峰所含蛋白质，包括如下步骤：

S51、将离子交换主洗脱峰组分、硫酸铵、醇类试剂混匀，离心后转移中间层的蛋白沉淀；

S52、将蛋白沉淀分散于超纯水中，洗去盐份，再次离心收拢蛋白沉淀。

本发明通过三相法沉淀离子交换主洗脱峰所含蛋白质，洗脱液、4M硫酸铵、醇类试剂的体积比为1：(0.1-0.5)：(0.2-2)。将洗脱液、硫酸铵、醇类试剂按照上述比例加入离心管后，在摇床上混匀5-60min，然后在400-15000rpm转速下离心，所得中间层为蛋白沉淀。将两相界面处的蛋白沉淀(中间相)用移液器转移至更小的离心管，再次离心去除转移时带出的液体，获得蛋白沉淀。加入4-20倍于沉淀体积的超纯水，用移液器吸打分散沉淀，洗去盐份，再离心收集蛋白沉淀。

S6、通过凝胶过滤层析对离子交换主洗脱峰所含蛋白质进一步分离，获得纯化的小橡胶粒子蛋白。

在一个示例中，通过凝胶过滤层析对离子交换主洗脱峰所含蛋白质进一步分离，获得纯化的小橡胶粒子蛋白，包括：

S61、将蛋白沉淀溶解于流动相中，进行凝胶过滤层析并收集洗脱组分，其中流动相包括：1)50-250mM氯化钠，2)3-9M尿素或0.2-2％在280nm波长下无紫外吸收的去垢剂；

S62、沉淀主洗脱组分中的蛋白并脱盐，得到纯化的小橡胶粒子蛋白。

将步骤S5获得的蛋白沉淀溶解于流动相中。由于小橡胶粒子蛋白可能发生自聚集沉淀，因此流动相中加入3-9M尿素或去垢剂Brij35(Brij35在280nm下无紫外吸收故与层析检测器兼容)以确保蛋白处于溶解状态，不在层析过程中析出。收集洗脱组分，主洗脱峰为小橡胶粒子蛋白，收集的洗脱组分使用前述三相法沉淀，将收集的洗脱组分、4M硫酸铵、醇类试剂按照1：(0.1-0.5)：(0.2-2)的比例加入离心管后，在摇床上混匀5-60min，然后在400-15000rpm转速下离心。将两相界面处的蛋白沉淀(中间相)用移液器转移至更小的离心管，再次离心去除转移时带出的液体，获得蛋白沉淀经水洗去除盐分即获得纯化的单一蛋白——小橡胶粒子蛋白。

本发明先采集橡胶树中的胶乳，向橡胶树胶乳中加入碱性缓冲溶液以稳定胶乳；加入强阴离子去垢剂和有机溶剂，选择性地沉淀胶乳中小橡胶粒子蛋白以外的大部分蛋白，同时沉淀以橡胶烃为主的固体物质；通过离心收拢固体物质，并转移澄清的液体部分即蛋白粗提液，向蛋白粗提液中加入硫酸铵并振荡使蛋白质沉淀，析出的沉淀为蛋白粗提物；通过离子交换层析分离蛋白粗提物，收集主洗脱峰；再沉淀离子交换主洗脱峰所含蛋白质，小橡胶粒子蛋白为主要成分；最后通过凝胶过滤层析对离子交换主洗脱峰所含蛋白质进一步分离，获得纯化的小橡胶粒子蛋白。本发明直接从橡胶树胶乳中提取和纯化小橡胶粒子蛋白(不需先分离小橡胶粒子)，通过使用强阴离子去垢剂(低浓度)和有机溶剂沉淀和去除大部分胶乳蛋白质，仅保留以小橡胶粒子蛋白为主的少数几种蛋白质，减少了柱层析纯化前蛋白样本的复杂性；在蛋白提取和层析组分浓缩时均采用三相法沉淀蛋白质，简化了操作步骤，极大节省了操作时间。因此，本发明的提取和纯化方法，高效省时地分离目标蛋白与非目标蛋白。

下面结合具体操作步骤，对本发明的提取和纯化小橡胶粒子蛋白的方法做详细说明。

一种从巴西橡胶树胶乳提取和纯化小橡胶粒子蛋白的方法，包括如下步骤：

1、在胶园割胶并收集胶乳，采集时将接收胶乳的离心管置于冰上，防止蛋白质降解；取15-20mL胶乳至50mL离心管，加入Tris-HCl缓冲液(pH>7)，使胶乳呈碱性以保持胶乳稳定；

2、向离心管中加入强阴离子去垢剂，如十二烷基硫酸钠或十二烷基磺酸钠的溶液或干粉，使其终浓度在0.05％-2％之间，将离心管置于冰上振荡10-60min；

3、向离心管内加入有机溶剂(如乙腈)，胶乳与有机溶剂的体积比为1：(0.3-2)，将离心管置于摇床上以最大转速振荡10-60min，以沉淀胶乳中的天然橡胶、其它固体物质及大部分蛋白，保留小橡胶粒子蛋白为主的少数蛋白；以5000rpm转速离心10min，使离心管内的混合液澄清，保留离心管内上层澄清的液体(简称蛋白粗提液)；

4、转移澄清的蛋白粗提液至新离心管，按蛋白粗提液体积的10-100％加入硫酸铵溶液(4M)，将离心管置于摇床振荡约10min，使蛋白形成沉淀析出；再以5000rpm转速离心10min，蛋白沉淀出现在水相-有机相界面处，将界面处的蛋白沉淀用移液器转移至更小的离心管再次离心，收拢蛋白沉淀。加入4-20倍体积于沉淀的超纯水分散并洗涤蛋白沉淀，然后离心收集蛋白沉淀，以去除盐份(也可先用尿素或含去垢剂的溶液溶解沉淀，再用有机溶剂沉淀出蛋白质，以去除盐份等杂质)；除盐的蛋白质可用合适的溶液溶解。

5、阴离子交换层析分离蛋白粗提物：使用强阴离子交换柱(Q，季铵盐树脂)或弱阴离子交换柱进行分离，使用流动相如下：流动相A(如3-9M尿素，10-50mM Tris-HCl，pH 6-9)，流动相B(如3-9M尿素，10-50mM Tris-HCl，pH 6-9，1M NaCl)。上样后用80mM NaCl清洗2个柱体积以去除部分非目标蛋白。使用线性梯度洗脱，目标蛋白的洗脱溶液和浓度为80-200mM NaCl。

6、使用三相法沉淀阴离子交换主洗脱峰所含蛋白：按体积比1：(0.1-0.5)：(0.2-2)添加蛋白溶液、4M硫酸铵和叔丁醇(或正丁醇或戊醇)，摇床上混匀5-60min后离心(400-15000rpm，5-10min)，所得中间层为蛋白沉淀；将界面处的沉淀用移液器转移到更小的离心管进行再次离心，以去除转移时带出的液体并获得蛋白沉淀；加入4-20倍于沉淀体积的超纯水，用移液器吸打分散沉淀，洗去盐份，再离心收集蛋白沉淀。

7、使用凝胶过滤层析分离阴离子交换主洗脱峰中的蛋白：将步骤6获得的蛋白沉淀溶解于流动相(含3-9M尿素或0.2-2％ Brij35，50-250mM NaCl，pH7-10)。收集洗脱组分，主洗脱峰为小橡胶粒子蛋白，使用前述三相法沉淀之，经除盐即获得纯化的小橡胶粒子蛋白。

如图2所示为提取胶乳蛋白与纯化小橡胶粒子蛋白过程中蛋白样本的SDS凝胶电泳，泳道M为蛋白质分子量标准。

泳道1，使用本发明方法从胶乳提取的蛋白质样本(蛋白粗提物)，最粗的条带为小橡胶粒子蛋白(经质谱分析确认)。

泳道2，蛋白粗提物经阴离子交换分离后获得的主洗脱峰蛋白质，主要包含目标蛋白质(约24kDa)和一个约10kDa的小分子量蛋白质。

泳道3，阴离子交换主洗脱峰蛋白质经进一步凝胶过滤层析后获得了单一的小橡胶粒子蛋白。。

图3为小橡胶粒子蛋白的柱层析纯化过程，A图为阴离子交换分离蛋白粗提物，色谱曲线表示阴离子交换层析的分离过程(灰色区域示主洗脱峰)，折线为电导率(表示NaCl浓度变化)；B图为凝胶过滤层析分离过程，对离子交换主洗脱峰进一步进行凝胶过滤层析，获得纯化的小橡胶粒子蛋白(灰色区域标示)。

根据图2和图3的结果，本发明具备以下优势：

(1)通过使用强阴离子去垢剂(低浓度)和有机溶剂从橡胶树胶乳中沉淀并去除大部分蛋白质，择性地保留小橡胶粒子蛋白，简化了样本的复杂性，从而有利于提高后续提取和纯化过程的效率；

(2)目标蛋白(小橡胶粒子蛋白)与非目标蛋白的分离效果好，且过程易于操作、耗时短。

应该理解，可以使用上面所示的各种形式的流程，重新排序、增加或删除步骤。例如，本发公开中记载的各步骤可以并行地执行也可以顺序地执行也可以不同的次序执行，只要能够实现本公开公开的技术方案所期望的结果，本文在此不进行限制。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或隐含地包括至少一个该特征。在本公开的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

以上所述，仅为本公开的具体实施方式，但本公开的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本公开揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本公开的保护范围之内。因此，本公开的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。