一种抑制黑色素形成的益生菌组合物及其应用

技术领域

本发明涉及益生菌组合物技术领域，尤其是涉及一种抑制黑色素形成的益生菌组合物及其应用。

背景技术

益生菌是通过定殖在人体内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物。益生菌具有调理肠胃、缓解抑郁、预防龋齿、降三高、减肥等作用已广为人知，如今护肤品行业也有很多产品加入了益生菌，功能多为修复肌肤屏障、改善湿疹、痤疮、肌肤敏感等问题。

在化妆品工业中，正在开发使用益生菌微生物作为原料的皮肤美容产品，益生菌可起到美白、淡斑的作用已有报道。美白、祛斑有两种途径：1.抑制体内黑色素形成；2.抑制体内黑色素转运。抑制黑色素形成的途径主要有：①控制酪氨酸酶活性；②控制酪氨酸酶基因的表达；③促进酪氨酸酶降解；④阻断黑色素生成号通路。现有的益生菌美白产品中，已披露的美白祛斑途径有通过益生菌的具有抗氧化功效，增加体内产氧化物歧化酶的基因表达，提高机体抗氧化水平，瓦解色斑，通过抗氧化能力推断益生菌具有抑制黑色素的功效，无直接实验验证。有研究表明，益生菌生长代谢产生的胞外多糖具有抑制黑色素形成的作用，但对酪氨酸酶活性的抑制无明显效果，对于清除自由基也无明显作用。细胞中黑色素的合成包括多个步骤，可针对的靶点较多，因此抑制黑色素形成的活性成分在作用机制上具有高度多样性。

有研究表明，不同菌株其功能差异较大，例如Chin-Feng Chan等人在《Molecules》发表的文章《Fermented Broth in Tyrosinase-and Melanogenesis Inhibition》中，不同种的菌株对酪氨酸酶活性抑制作用不同，同一株菌，能抑制酪氨酸酶活性，却对黑色素细胞B16无抑制作用，说明不同菌株作用通路不同，效果也不同。再例如邓逸琳等人的研究了6株乳酸菌的酪氨酸酶活性的抑制作用，其中5株植物乳杆菌对酪氨酸酶抑制率差异显著，说明同种不同株之间的功能性也有差异。

文献1：1.Chin-Feng Chan,Ching-Cheng Huang...Fermented Broth inTyrosinase-and Melanogenesis Inhibition.Molecules 2014,19,13122-13135.

文献2：邓逸琳,王斌,曹辉.6种乳酸菌发酵液对皮肤抗氧化及美白功能的评价[J].日用化学工业,2020,50(05):325-330.

目前，关于益生菌抑制黑色素的相关研究目前还较少，目前的研究还不清楚益生菌抑制黑色素的具体机制，因此，亟需一种抑制黑色素机制明确，有效效果稳定的益生菌组合物。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种抑制黑色素形成的益生菌组合物及其应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

第一目的，本发明提供了一种抑制黑色素形成的益生菌组合物，所述益生菌组合物由以下益生菌组成：

青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)Y54、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)K9、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)K43和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)W68；

所述青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)Y54已于2018年4月28 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15709；

所述副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)K9已于2017年12月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15025；

所述嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)K43已于2018年4月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15705；

所述长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)W68已于2017年12月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15028。

本申请的发明人经过大量研究筛选出本发明的益生菌组合物，发现该益生菌组合物具有抑制黑色素形成的功效，研究发现组合物中的益生菌在生长繁殖过程中所产生的胞外多糖具有抑制B16细胞的黑色素形成。灭活后的益生菌组合物也具有抑制黑色素的作用。在食用益生菌组合物后，益生菌在体内定殖，其代谢产物在调理肠道的同时，影响人体细胞的代谢过程。

通过实验验证，本发明的益生菌组合物具有较优的抑制黑色素形成的功效，从根源处解决肤色暗沉，泛黄，色斑等肌肤问题，从而起到美白，提亮肤色的作用。

并且，本发明的益生菌组合物能有效提高小鼠皮肤组织中含水量、SOD活性，降低MDA含量，延缓皮肤衰老。

作为本发明所述益生菌组合物的优选实施方式，所述益生菌组合物中青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)Y54、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)K9、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)K43和长双歧杆菌 (Bifidobacterium longum)W68的质量比为(1-4):(1-4):(1-4):(1-4)。

作为本发明所述益生菌组合物的优选实施方式，所述益生菌组合物中青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)Y54、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)K9、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)K43和长双歧杆菌 (Bifidobacterium longum)W68的质量比为(2-4):(1-3):(2-4):(1-3)。

作为本发明所述益生菌组合物的优选实施方式，所述益生菌组合物中青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)Y54、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)K9、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)K43和长双歧杆菌 (Bifidobacterium longum)W68的质量比为3:2:3:2。

采用上述重量比的益生菌组合物抑制黑色素功效的效果较好。

第二目的，本发明提供了一种含有上述益生菌组合物的发酵产物。含有本发明益生菌组合物的发酵产物具有较佳抑制黑色素的功效。

第三目的，本发明提供了一种益生菌发酵产物，所述益生菌发酵产物包括上述的益生菌组合物和以下重量份数的组分：甘草1-5份、沙棘1-4份、白芷1-3 份和茯苓1-2份。

优选地，组分包括：甘草4份、沙棘1份、白芷3份和茯苓2份。

本发明的益生菌组合物可以搭配其他组分制成益生菌发酵产物，组分包括甘草、沙棘、白芷和茯苓。其中，甘草中含有的去氢粗毛甘草素C、甘草黄酮等成分可降低酪氨酸酶的活性、抑制酪氨酸酶基因的表达，抑制环状单磷酸腺苷 (cAMP)/反应元件结合蛋白(CREB)信号通路诱导黑色素生成调节因子(MITF) 下调，从而抑制黑色素生成。本发明的益生菌组合物能有效提高小鼠皮肤组织中含水量、SOD活性，降低MDA含量，延缓皮肤衰老。

益生菌组合物发酵产物中其他组分时，可降低植物提取物中甘草，白芷等带来的苦味和辛辣味，使得整个发酵产物的味道更容易让人接受，感官实验结果表明，随着接种量的变化，感官评分也有相应的变化。

在《神农本草经》中，茯苓被列为“上品”，白芷被列为“中品”，两者广泛应用在临床上，具有消除组织中过度色素堆积促进皮肤细胞新陈代谢的能力。白芷水提物是发挥其美白功能的主要活性物质，它还可以有效抑制光敏毒性，其水提液比醇提液显示出更强的酪氨酸酶抑制活性。

沙棘富含丰富维生素C，有维生素C之王的美称，具有较强抗氧化作用，还可增加肠道双歧杆菌的活性，其中含有的大量维生素E、维生素A、黄酮和 SOD活性成分能够有效延缓皮肤老化，黄酮也是具有较好的抑制黑色素生成的一类活性成分。

经过合理搭配的益生菌冻干粉具有更优抑制黑色素形成作用。

第四目的，本发明提供了一种益生菌植物提取物发酵液的制备方法，包括以下步骤：

1)将甘草、沙棘、白芷和茯苓加8-12倍重量体积的水，加热回流提取，获得提取液，在提取液中加入葡萄糖作为营养底物，搅拌溶解，获得水提物；

2)将上述益生菌组合物和水混合，加入葡萄糖活化，获得活化后的菌液，将菌液按照添加量为1％-3％加入水提物中发酵过滤，取上清液，获得益生菌植物提取物发酵液。

本发明获得的益生菌植物提取物发酵液具有抑制酪氨酸酶的功效，通过益生菌发酵，可提升抑制黑色素形成作用的效果，说明在发酵过程中，益生菌生长代谢产生的一些代谢产物如胞外多糖、细菌素等成分，提升了植物提取物本身的功效。

作为本发明所述制备方法的优选实施方式，菌液的添加量为2.5％。

作为本发明所述制备方法的优选实施方式，益生菌组合物在菌液中的的浓度10％-20％。

第五目的，本发明提供了上述益生菌组合物、发酵产物或益生菌植物提取物发酵液在制备食品或化妆品中的应用。

优选地，食品包括固体饮料或酸奶等。

优选地，化妆品包括面膜、精华液，霜等化妆品常用的剂型。

本发明将上述的益生菌组合物、发酵产物或益生菌植物提取物发酵液添加至食品或化妆品中，使得食品或化妆品也具有抑制黑色素的作用。

第六目的，本发明提供了上述益生菌组合物在抑制黑色素形成中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种抑制黑色素形成的益生菌组合物及其应用，组合物中选用的益生菌均为肠道益生菌，在改善肌肤问题的同时可调节肠道，更有益于人体健康。通过食用本发明的益生菌组合，益生菌进入人体内，并在人体内存活并大量繁殖，分泌的细菌素对人体有益，作用于人体，达到抑制黑色素生成，提亮肤色，改善色斑等问题，同时益生菌组合物能有效提高小鼠皮肤组织中含水量、SOD活性，降低MDA含量，延缓皮肤衰老。益生菌组合可添加于食品中，益生菌灭活后同样具有抑制黑色素的功效，因此也可应用于日化行业，其灭活菌粉可应用于日化产品，如面膜，精华液等。

附图说明

图1为实施例3各样品发酵液抑制酪氨酸酶实验结果图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

在以下实施例和对比例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、益生菌的筛选

本实施例提及的青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)Y54已于2018年4月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.15709，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本实施例提及的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)K9已于2017年12 月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC No.15025，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本实施例提及的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)K43已于2018年4 月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCCNo.15705，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本实施例提及的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)W68已于2017年12 月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC No.15028，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本实施例提及的动物双歧杆菌乳亚种KS-06(Bifidobacterium animalissubsp.Lactis)Y6已于2017年12月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15026，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

实验模型：5天大AB品系斑马鱼。

益生菌样品：益生菌冻干粉。

灭活益生菌粉样品制备：将益生菌冻干粉于85℃烘箱内保温30min，得到灭活率>95％的益生菌灭活菌粉。

实验方法：采用平皿暴露于28℃恒温箱中进行，采用培养液(称取2940mg 无水氯化钙、1233mg七水硫酸镁、630mg碳酸氢钠、55mg氯化钾溶于10L水配制而成，培养液的pH值6.5～8.5)分别对上述益生菌(青春双歧杆菌Y54、副干酪乳杆菌K9、嗜酸乳杆菌K43、长双歧杆菌W68和动物双歧杆菌乳亚种 KS-06)进行稀释至浓度为10

表1单活菌株实验结果

表2单灭活菌株实验结果

由表1数据可得，本发明选用的益生菌对斑马鱼安全无毒，不影响其生长，斑马鱼死亡率均为0。其中，青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)Y54、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)K9、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)K43和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)W68这四株益生菌均有不同程度的抑制黑色素的效果，数据具有显著差异(P<0.05)。副干酪乳杆菌 (Lactobacillus paracasei)K9与青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis) Y54的抑制率与阳性对照维生素C钠接近。动物双歧杆菌乳亚种KS-06相比其他菌株抑制黑色素形成的效果则不显著。由表2数据可得，青春双歧杆菌 (Bifidobacterium adolescentis)Y54、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)K9、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)K43和长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)W68这四株益生菌灭活后仍有抑制黑色素形成的作用，抑制率与活菌相近。

实施例2、益生菌组合物抑制黑色素形成实验

本实施例对实施例1筛选出来的益生菌进行组合，本实施例的益生菌组合物由以下益生菌组成：

青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)Y54、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)K9、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)K43和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)W68。

实验模型：5天大AB品系斑马鱼。

益生菌样品：各益生菌组合冻干粉按照表3的重量比进行复配组合。灭活益生菌组合菌粉样品制备方法：将益生菌冻干粉于85℃烘箱内保温30min，得到灭活率>95％的益生菌灭活菌粉，在无菌环境下按照表3的重量比进行复配得到灭活益生菌组合菌粉。

试验方法：同实施例1。实验组为青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)Y54、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)K9、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)K43和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)W68这四株菌组合成的益生菌冻干粉/灭活益生菌组合菌粉，实验阳性对照为维生素C钠溶液，空白组为正常的斑马鱼培养液。

表3复合菌株实验验证分组

表4各益生菌组合冻干粉抑制黑色素形成实验结果

表5各灭活益生菌组合菌粉抑制黑色素形成实验结果

由表4可知，组合4的抑制率在4.25％，优于维生素C钠的效果，由此可推断出，该比例下益生菌组合对抑制黑色素有更好的效果。由表5可知，灭活的复合菌对黑色素形成的抑制作用相比活菌略低，但组合4的作用与其他组合相比仍有较明显的优势。因此，对黑色素形成抑制效果较优的益生菌组合为青春双歧杆菌Y54、嗜酸乳杆菌K43、副干酪乳杆菌K9、长双歧杆菌W68重量比为3:2:3:2。

实施例3、益生菌发酵植物提取物发酵液抑制黑色素功效的实验

试验例1：益生菌发酵植物提取物发酵液的配方：原料以重量份计，由甘草 4份、沙棘1份、白芷3份、茯苓2份和采用实施例2的益生菌组合冻干粉(青春双歧杆菌Y54、嗜酸乳杆菌K43、副干酪乳杆菌K9、长双歧杆菌W68，重量比为3:2:3:2。活菌数≥1×10

上述益生菌发酵植物提取物发酵液的制备方法，包括以下步骤：

(1)水提物制备：将沙棘、甘草、茯苓、白芷等物料加10倍量(按重量计)水，加热回流提取2小时，提取完成后，转移至已灭菌后的发酵罐中，按提取液液体量，加入2.0％葡萄糖做为营养底物，搅拌使溶解，调pH值5.5左右，灭菌，放冷至37℃，备用。

(2)益生菌活化：称取益生菌组合冻干粉，按重量比为10:1加入水和益生菌组合冻干粉混合，加入2％葡萄糖水与37℃下活化30min，备用。

(3)接种：将活化的益生菌加入(1)中灭菌后的水提物中，添加量为3％，于37℃发酵24h，获得发酵液。

(4)过滤：将发酵液用离心机离心，5000转离心30min，取上清液，得到益生菌植物提取物发酵液。

试验例2：与试验例1对比，益生菌接种量为2.5％，其余条件相同。

试验例3：与试验例1对比，益生菌接种量为2％，其余条件相同。

试验例4：与试验例1对比，益生菌接种量为1.5％，其余条件相同。

试验例5：与试验例1对比，益生菌接种量为1％，其余条件相同。

试验例6：益生菌发酵植物提取物发酵液的配方：原料以重量份计，由甘草 4份、沙棘1份、白芷3份、茯苓2份和分别接种实施例2的益生菌复合冻干粉中的各个单菌冻干粉进行发酵，发酵条件：接种量2％，37℃发酵24h，获得发酵液。过滤：将发酵液用离心机离心，5000转离心30min，取上清液，得到益生菌植物提取物发酵液。

对比例1为纯植物提取物组合，不含有益生菌，不进行发酵，其余试验条件与试验例1相同。

对比例2为纯益生菌发酵试验组，不含有沙棘、甘草、茯苓、白芷等物料，其余试验条件与试验例1相同。

取以上试验例1-6的样品，分别测菌落总数、pH值，对比发酵前后pH值情况。同时品尝发酵前后口感，具体见结果统计表6-表7。

表6试验例6样品的菌落总数、发酵前后pH值对比表

表7试验例1-5样品的菌落总数、发酵前后pH值对比表

根据表6、表7数据可知，4株益生菌均能在该植物提取物生长，能利用其中的营养物质。接种益生菌量越多，其活菌数越高，pH值越低，接种量至2.5％时，pH值达已到最低，说明发酵基料中的营养物质大部分被消耗，因此2.5％的益生菌接种量为最适接种量。复合菌株发酵后，活菌数相较单株菌株发酵更高，说明菌株之间存在交叉护养、协同发酵作用，对发酵底物的营养利用的更彻底。

取试验例2的益生菌发酵植物提取物发酵液对其进行抑制黑色素效果验证，并与对比例1-2的发酵液对比。采用抑制酪氨酸酶体外实验进行验证，如表8 所示。

抑制酪氨酸酶体外实验试验方法：

表8试剂用量表

按表8在K1、K2、T1、T2中分别添加PBS溶液、样品发酵液、L-酪氨酸溶液试剂，于37℃保温10min预热，再添加酪氨酸酶溶液，与37℃中保温20min。取出，以K2体系调零，测K1体系475nm波长处吸光值；以T2体系调零，测T1体系475nm波长处吸光值。5％曲酸溶液为阳性对照，测试样品浓度同样为 5％。

酪氨酸酶抑制率为：

实验结果见图1。

根据图1数据可知，试验例2对酪氨酸酶抑制率最高，优于对比例1与对比例2，即通过益生菌发酵，可提升抑制黑色素形成作用的效果，说明在发酵过程中，益生菌生长代谢产生的一些代谢产物如胞外多糖、细菌素等成分，提升了植物提取物本身的功效。

实施例4、延缓皮肤衰老实验

分别灌胃D-半乳糖致衰老模型小鼠，通过观察各组小鼠皮肤组织的形态学改变及检测皮肤中含水量、SOD(超氧化物歧化酶)活性、MDA(丙二醛)含量，作为评价受试样品的测试样品抗皮肤衰老作用的指标。

试验方法：小鼠25只，随机分5小组，每小组12只，除正常对照组外，各鼠每天在皮下注射D-半乳糖(1000mg/kg·d)，普通饲料常规喂养建立D-半乳糖衰老模型。45d后，每日灌喂相应样品(试验例2、对比例1、对比例2)，共给药30d。小鼠灌胃30d后，脱臼致死，用15％硫化钠溶液精密称取皮肤组织 0.5g左右，去除皮下脂肪及结缔组织，制备10％的皮肤组织匀浆，3500r/min离心20min，取上清液进行SOD和MDA测定。取小鼠背部皮肤，用电子天平精确称其湿重，80℃干燥箱中烘12h，称其干重，并记录，用以计算皮肤含水量。分组及剂量、实验结果见表9。

表9各实验组小鼠皮肤含水率、SOD活性、MDA含量的测定

实验结果显示：与模型组相比，实验组均有不同程度提高皮肤含水率、SOD 活性，降低MDA含量的作用，其中实施例2样品组效果较优，能有效提高小鼠皮肤组织中含水量、SOD活性，降低MDA含量，延缓小鼠皮肤衰老。

实施例5、感官实验

感官评定：以色泽、风味等四项为感官评价指标。

选择了10名志愿者(5名男性和5名女性)，他们的年龄在18至35岁之间。这10名志愿者在需进行培训，每份样品(试验例1-5的益生菌发酵植物提取物发酵液及对比例1的植物提取物。)均进行单次食用，并提供无盐饼干和过滤后的自来水作为味觉清洁剂，随机测试样品，满分为100分，感官评分标准见表10。感官评价结果见表11。

表10感官评价评分标准表

表11感官评价评分结果

相对于对比例1的益生菌发酵植物提取物发酵液，本发明试验例1-5的益生菌发酵植物提取物发酵液在风味、口感上更佳，在本发明中，益生菌组合物在发酵液中可降低益生菌发酵植物提取物发酵液中甘草，白芷等带来的苦味和辛辣味，使得整个益生菌发酵植物提取物发酵液的味道更容易让人接受，感官实验结果表明，随着益生菌接种量的变化，感官评分也有相应的变化。对比例1 感官评分结果最低，说明发酵具有改善植物提取物的风味、口感的作用，感官评分随接种量变化而变化，试验例2样品感官评分最高，说明不同发酵程度影响了发酵产物的风味、口感。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。