取代的胍基试剂和取代的脒基试剂及其用于蛋白质变性的用途

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年6月12日提交的名称为“Substituted Guanidino andAmidino Reagents and The Use Thereof for Protein Denaturation”的美国临时申请号63/038,366的权益和优先权。该申请的内容全文以引用方式并入本文。

技术领域

本公开整体涉及使蛋白质变性。更具体地，本公开涉及使用取代的胍基试剂和取代的脒基试剂来破坏蛋白质结构。

背景技术

离子可以基于其对水的有序作用还是相反地无序作用而具有稳定或不稳定作用。在引起水配位增加的离子的情况下，发现蛋白质结构稳定。继而，可能需要各种样品制备方法使这些蛋白质结构变性以用于分析。

发明内容

一些蛋白质耐变性，这需要发现更强大的变性剂。然而，使用太多变性剂具有过程缺点。本公开描述了两种变性剂：取代的胍基试剂和取代的脒基试剂，这些试剂是非亲核的。这使得可以使用取代的胍基试剂和取代的脒基试剂，而不会对涉及亲电试剂的下游衍生化反应施加任何干扰。

在一些方面，本公开提供了一种用于蛋白质变性的组合物。组合物包含非亲核变性剂，该非亲核变性剂包括取代的胍。变性剂具有大于约10的pKa值，并且取代的胍的浓度小于250mM。

在一些实施方案中，取代的胍选自基本上由四甲基胍、叔丁基四甲基胍、三氮杂双环癸烯或它们的组合组成的组。在一些实施方案中，取代的胍包括来自四甲基胍、叔丁基四甲基胍、三氮杂双环癸烯或它们的组合的组中的至少一者。在一些实施方案中，四甲基胍的取代的胍是具有以下化学结构的1，1，3，3-四甲基胍：

在一些实施方案中，叔丁基四甲基胍的取代的胍是具有以下化学结构的2-叔丁基-1，1，3，3-四甲基胍：

在一些实施方案中，三氮杂双环癸烯的取代的胍是具有以下化学结构的1，5，7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯：

在一些实施方案中，取代的胍是胍盐阳离子。在一些实施方案中，组合物还包含来自十二烷基硫酸钠、n-月桂酰肌氨酸、月桂酸、胆酸或它们的组合的组中的至少一者的附加变性剂。

在一些方面，本公开提供了一种用于蛋白质变性的组合物。组合物包含非亲核变性剂，该非亲核变性剂包括取代的脒。变性剂具有大于约10的pKa值，并且取代的脒的浓度小于250mM。

在一些实施方案中，取代的脒选自基本上由己脒、乙脒、丙脒或它们的组合组成的组。在一些实施方案中，取代的脒包括来自己脒、乙脒、丙脒或它们的组合的组中的至少一者。

在一些方面，本公开提供了一种使包含蛋白质的样品变性的方法。该方法包括：用非亲核变性剂孵育样品；加热样品达预定时间量，以使蛋白质变性；以及将样品冷却到降低的温度。变性剂的浓度小于约250mM，并且变性剂具有大于约10的pKa值。

在一些实施方案中，非亲核变性剂包括取代的胍、取代的脒或它们的组合。在一些实施方案中，取代的胍包括四甲基胍、叔丁基四甲基胍、三氮杂双环癸烯或它们的组合。在一些实施方案中，取代的脒包括己脒、乙脒、丙脒或它们的组合。在一些实施方案中，当温度降低到降低的温度时，变性的蛋白质被展开并且保持展开。在一些实施方案中，非亲核变性剂选自基本上由四甲基胍、叔丁基四甲基胍、三氮杂双环癸烯或它们的组合组成的组。在一些实施方案中，加热样品包括将样品加热到至少40℃的温度。在一些实施方案中，加热样品包括将样品加热到在约40℃至约100℃范围内的温度。在一些实施方案中，降低的温度在约30℃至75℃的范围内。在一些实施方案中，该方法包括稀释冷却的样品以及/或者消化冷却的样品。在一些实施方案中，该方法包括用蛋白酶消化样品。在一些实施方案中，蛋白酶是胰蛋白酶、Lys-C、Arg-C、Glu-C、Asp-N、胰凝乳蛋白酶或它们的组合。在一些实施方案中，该方法包括用内切糖苷酶或外切糖苷酶处理冷却的样品。

本公开提供了许多优点，包括：使用非亲核的取代的胍基试剂和取代的脒基试剂作为变性剂，而不会对涉及亲电试剂的下游衍生化反应施加任何干扰。虽然不希望受理论的束缚，但可以合理认为，取代的胍基试剂和取代的脒基试剂具有独特的能力：能够与阴离子蛋白质位点形成强离子对，并且同时将疏水性引入蛋白质结构域的局部微环境。据信这种两亲特性破坏离子配对的蛋白质结构域的溶剂化，使得熵不再有利于其在其天然结构中折叠。这些取代的胍基试剂和取代的脒基试剂对于实现酸性结构的完全变性可能是特别有利的，同时足够两亲以会聚到胶束体系中，该胶束体系可以固有地破坏蛋白质结构。取代的胍基试剂可以在温度循环和小稀释因子下有效使用，以将来自苛刻变性条件的样品转变为仅部分变性的样品，使得可以容易地采用酶。并且取代的脒基试剂可能对高温样品制备步骤提供足够的变性力，并且然后在较低温度下足够温和，以便不干扰随后的酶促反应。

附图说明

通过以下结合附图所作的详细描述，将更充分地理解本技术，在附图中：

图1是消化工作流程的示例的流程图。

图2展示了根据本公开的通过兔IgG的天然荧光随盐酸胍浓度的变化观察到的蛋白质变性。

图3展示了根据本公开的在不同温度下用不同取代的胍试剂(试剂1、试剂2和试剂3)孵育之后的兔IgG的荧光发射强度比。

图4展示了根据本公开的在不同温度下用不同取代的脒基试剂(试剂4、试剂5和试剂6)孵育之后的兔IgG的荧光发射强度比。

图5A至图5E展示了根据本公开的在用各种试剂进行变性和PNGase F去糖基化之前和之后的

图6展示了根据本公开的由衍生于

图7A至图7D是展示根据本公开的消化缓冲液中的用于通过通用LC-MS方法分析肽图的1mM每种四甲基胍变性剂(图7A是空白；试剂#1，图7B；试剂#2，图7C；和试剂#3，图7D)的曲线图。

图8是展示用于蛋白质变性的取代的胍试剂和取代的脒试剂的化学名称和结构的表格。

具体实施方式

一些蛋白质耐变性，这需要发现更强大的变性剂。两种变性剂是取代的胍基试剂和取代的脒基试剂，这些试剂是非亲核的。这使得可以使用取代的胍基试剂和取代的脒基试剂，而不会对涉及亲电试剂的下游衍生化反应施加任何干扰。

由不同取代基构成的胍衍生物被示出为蛋白质结构的强大效应物。作为变性剂，已经发现这些化合物可以在亚毫摩尔浓度下破坏常见蛋白质结构。在一些实施方案中，将这种变性力有利地用于展开难降解的三级蛋白质结构和四级蛋白质结构，并且制备其用于酶促处理，诸如蛋白质消化或聚糖释放。

取代的胍基试剂包括其中试剂的一个或多个N-H被烷基、芳基、环、含杂原子、烯烃、炔烃、PEG、PEO等部分替代。在一些示例中，取代可以互连以形成环状环。同样适用于取代的脒基试剂。一个N-H但不一定全部N-H被取代为非氢官能团。取代的脒基试剂可以另选地用作实现更温和、更有利于酶的变性的选项。取代的胍基试剂和取代的脒基试剂两者可以与涉及亲电试剂的衍生化反应和亲核取代反应结合。

当本文所述时，取代的胍基试剂和取代的脒基试剂的浓度是指缓冲溶液。缓冲溶液可以包括常见缓冲液和离子强度调节盐。常见缓冲液包括磷酸盐、三(羟甲基)氨基甲烷、BIS-TRIS丙烷、三乙胺和其他常见缓冲液。常见离子强度调节盐包括NaCl、KCl、Ca

图1是示出肽图工作流程100的概述的流程图。在一些示例中，肽图工作流程100包括四个部分。第一部分102包括具有感兴趣分析物(诸如蛋白质)的样品，该蛋白质是展开的。蛋白质展开的难度各不相同。在一些示例中，取代的胍基试剂和取代的脒基试剂可以用于帮助展开蛋白质。第二部分104包括使样品脱盐，该样品包含展开的感兴趣分析物。在此，脱盐装置和耐压上浆介质可以用于使样品脱盐。第三部分106包括消化样品的感兴趣分析物。例如，脱盐样品可以被酶消化，该酶可以被固定，诸如固定的蛋白酶或固定的糖苷酶。在消化感兴趣分析物之后，第四部分108包括收集具有消化的感兴趣分析物的样品。

第一部分102和第二部分104可以被认为是预处理步骤。第一部分102和第二部分104可以取决于感兴趣分析物。在一些示例中，可以容易地被热变性并且在消化期间引入的蛋白质不需要预处理。对于需要预处理的蛋白质，变性与随后的还原和烷基化是用于完全展开蛋白质的常见步骤。在其中样品的蛋白质被展开的第一部分102之后，通常需要第二部分104来使样品脱盐。除了蛋白质之外，感兴趣分析物可以是核酸、核蛋白复合物、肽或病毒颗粒。

胍和十二烷基硫酸钠(SDS)长期以来被用于使蛋白质变性。继而，在需要完全变性以便实现准确和精确分析的各种样品制备方法中，它们变得普遍存在。

离子可以基于其对水的有序作用还是相反地无序作用而具有稳定或不稳定作用。在引起水配位增加的离子的情况下，发现蛋白质结构稳定。这些类型的离子被称为kosmotropes。相反地，被称为离液剂的一组离子破坏有序的水，并且由此通过使稳定蛋白质的熵力最小化来使蛋白质不稳定。最有效且广泛使用的离液剂之一是胍。在胍盐离子的形式中，该试剂能够消除大多数蛋白质结构。然而，有时需要使用高浓度的胍，诸如浓度超过6M。这些高浓度可能需要使样品在酶样品制备步骤(诸如蛋白质消化和去糖基化)之前充分脱盐。

可以利用SDS的表面活性剂特性来实现变性。在大多数情况下，仅通过高温孵育(例如，＞70℃)的组合使用利用表面活性剂来实现变性。蛋白质通常用SDS煮沸。在展开之后，通过SDS分子的两亲性质使蛋白质稳定在其变性状态。SDS离子的硫头基与碱性氨基酸残基配对，而亲脂尾部与变性结构的更疏水部分相互作用。这是有助于促进基于大小的凝胶电泳分离的SDS的特性。

不幸的是，类似于SDS的大多数表面活性剂太疏水，其他常见蛋白质表征技术(例如C18反相色谱)不能容忍。并且C18反相色谱用于肽图。

因此，需要用于实现蛋白质变性的另选试剂，该另选试剂促进完全变性并且对随后的酶促反应、衍生化反应或下游色谱无害。

本公开提供取代的胍作为新型试剂，以用于热活化的蛋白质变性以及后续的蛋白质消化和蛋白质去糖基化步骤。取代的胍基试剂包括其中试剂的一个或多个N-H被烷基、芳基、环、含杂原子、烯烃、炔烃、PEG、PEO等部分替代。在一些示例中，取代可以互连以形成环状环。同样适用于取代的脒基试剂。一个N-H但不一定全部N-H被取代为非氢官能团。如本文所述，胍是共享通用结构(R

在其共轭酸形式中，胍以胍盐阳离子形式存在，该胍盐阳离子是平面的、带有高度稳定的1+电荷的对称离子。电荷的共振稳定导致水的高效溶剂化和通常大于12的高pKa值。在中性水溶液中，胍几乎仅以胍盐阳离子形式存在。三个示例性取代的胍包括但不限于四甲基胍、叔丁基四甲基胍和三氮杂双环癸烯(图8)。图8提供了示出去质子化状态下的化学结构的表格，尽管本公开中的试剂已经以其质子化形式使用，如缓冲溶液中所制备。

本公开还提供了取代的脒作为用于蛋白质变性的新型试剂。在本文中用通用结构(R

在一些示例中，第一部分102可以是使包含感兴趣分析物(诸如蛋白质)的样品变性的方法。该方法可以包括：用非亲核变性剂孵育样品；加热样品达预定时间量，以使蛋白质变性；以及将样品冷却到降低的温度。变性剂的缓冲溶液浓度可以小于约250mM，并且变性剂可以具有大于约10的pKa值。非亲核变性剂可以包括取代的胍、取代的脒或它们的组合。

加热样品包括将样品加热到至少40℃的温度或在约40℃至约100℃范围内的温度。当温度降低到降低的温度时，样品的变性的蛋白质被展开并且保持展开。冷却的样品的降低的温度可以是约30℃至75℃。可以进一步稀释和/或消化冷却的样品。

消化样品可以包括用蛋白酶消化样品。在一些示例中，蛋白酶包括胰蛋白酶、Lys-C、Arg-C、Glu-C、Asp-N、胰凝乳蛋白酶或它们的组合。也可以用内切糖苷酶或外切糖苷酶处理冷却的样品。糖苷酶可以是肽-N-糖苷酶F(PNGase F)、EndoS、EndoS2、OpeRATOR

图2展示了通过兔IgG的天然荧光随盐酸胍浓度的变化观察到的蛋白质变性。为了从图8的表格确定胍试剂和脒试剂的有效性，使用兔IgG建立了天然荧光测定。在280nm处激发之后，在两个波长376nm和360nm处以比度量测量了发射。如图2所见，这种方法允许生成针对使样品经受胍浓度的增加的变性曲线。

在280nm的激发波长处采集荧光光谱，并且发射强度被报告为376nm强度除以360nm强度的比率。I376/I360的增加代表色氨酸残基的微环境的变化：特别地，其从疏水包围的天然状态到溶剂暴露的变性状态的变化。

使IgG样品经受0.5mM、5mM和50mM浓度以及环境、50℃、70℃或90℃的温度。用这种方法，测试图8所示的六种试剂。图3展示了在室温(RT)、50℃、70℃和90℃下用不同取代的胍试剂进行孵育之后的兔IgG的荧光发射强度比，包括在室温下用8M胍进行孵育所产生的强度比(针对变性的历史基准)。用280nm的激发波长进行荧光。

如图3所示，50mM浓度的试剂1、试剂2和试剂3被证明具有高度变性。随着室温下的孵育，试剂1、试剂2和试剂3产生具有在1.5至1.55范围内的激发强度比的IgG样品，这指示部分变性效果。在孵育温度为50℃的情况下，试剂产生在1.55至1.6范围内的增加的强度比。并且在孵育温度为70℃和90℃的情况下，激发强度比增加到介于1.62至1.72之间的值，这指示完全变性。

图3还示出了至少当与70℃或90℃孵育结合时，5mM的浓度在使IgG蛋白质变性方面仍然非常有效。在5mM浓度和较低温度下，试剂1、试剂2和试剂3的变性力显著降低。

这些结果示出了关于四甲基胍(试剂#1)、叔丁基四甲基胍(试剂#2)和三氮杂双环癸烯(试剂#3)的变性能力的若干有趣特性。首先，数据表明，试剂#1、试剂#2和试剂#3是强效变性剂，如通过在浓度仅为50mM的情况下在室温下其有效性所证实。其次，试剂#1、试剂#2和试剂#3可以在温度循环和小稀释因子下有效使用，以将来自苛刻变性条件的样品转变为仅部分变性的样品，使得可以容易地采用酶。

在一个示例中，四甲基胍在0.1mM至250mM或0.5mM至100mM范围内的浓度和大于50℃任选孵育下使用。在一些示例中，叔丁基四甲基胍或三氮杂双环癸烯被用作变性剂。

可以在用取代的胍进行变性之后进行2至10倍稀释，以便提供更有利于酶的反应条件。然后，用蛋白酶消化稀释的样品，该蛋白酶包括但不限于胰蛋白酶、Lys-C、Arg-C、Glu-C、Asp-N和胰凝乳蛋白酶。稀释的样品也可以经受糖苷酶处理，该糖苷酶包括但不限于PNGase F。

在一些示例中，将四甲基胍、叔丁基四甲基胍或三氮杂双环癸烯以大于50mM的浓度施加于蛋白质。可能需要增加浓度来使最难降解的蛋白质结构变性。

有趣的是，取代的脒基试剂未示出其本身在使IgG测试样品变性方面如取代的胍试剂一样有效。然而，取代的脒基试剂具有作为温和变性剂的价值。

针对对兔IgG的变性效果测试了三个示例性取代的脒基试剂(己脒、乙脒、丙脒)，如图4所示。

图4展示了在室温(RT)、50℃、70℃和90℃下用不同取代的脒基试剂进行孵育之后的兔IgG的荧光发射强度比，包括被展示为参考的在室温下用8M胍进行孵育所产生的强度比(针对变性的历史基准)。用280nm的激发波长进行荧光。

使用脒基试剂，即使在高达50mM的浓度和高达50℃的热变性温度的情况下，也很少或没有发现可观察到的变性。然而，当在50mM浓度下使用并结合60℃至90℃的变性温度时，看出脒基试剂能够诱导部分变性。实际上，观察到其在此类温度下进行变性的程度与RapiGest

类似于RapiGest

虽然不希望受理论的束缚，但可以合理认为，取代的胍基试剂和取代的脒基试剂具有独特的能力：能够与阴离子蛋白质位点形成强离子对，并且同时将疏水性引入蛋白质结构域的局部微环境。据信这种两亲特性破坏离子配对的蛋白质结构域的溶剂化，使得熵不再有利于其在其天然结构中折叠。

由于取代的胍基试剂和取代的脒基试剂的离子配对作用，这些取代的胍基试剂和取代的脒基试剂可能特别有利于实现酸性结构的完全变性，诸如用包含聚糖的唾液酸或磷酸化翻译后修饰进行广泛修饰的蛋白质结构域。另选地，取代的胍基试剂和取代的脒基试剂也可能是足够两亲的，以会聚到胶束体系中，该胶束体系可以固有地破坏蛋白质结构。

在实施过程中，取代的胍基试剂或取代的脒基试剂可以与另一变性剂一起使用，该另一变性剂包括但不限于十二烷基硫酸钠、n-月桂酰肌氨酸、月桂酸、RapiGest

同样，取代的胍基试剂或取代的脒基试剂可以在有或没有加热步骤的情况下使用。此外，本文所呈现的取代的胍试剂和取代的脒试剂可以在酶促反应之前在有和没有脱盐步骤的情况下使用。

图5A至图5E展示了在用各种试剂进行变性和PNGase F去糖基化之前和之后的

图5D展示了阳性对照样品，其中用8M盐酸胍在室温下处理阿巴西普，通过大小过滤进行脱盐，并且然后用糖苷酶进行处理，这导致在8.68分钟处针对阿巴西普的新的更强保留峰。图5E展示了在大约8.12分钟处产生针对未修饰的阿巴西普的峰的阴性对照。

对于图5D，该新峰被更强地保留表明蛋白质的亲水N-聚糖被成功地裂解。此外，质谱数据支持将该峰识别为阿巴西普的N-去糖基化形式。

针对比较，三氮杂双环癸烯(试剂#3，图5A)、叔丁基四甲基胍(试剂#2，图5B)和四甲基胍(试剂#1，图5C)各自在5mM浓度和90℃短时孵育下单独施加于阿巴西普。在冷却之后，然后用PNGase F孵育样品，并且发现所得样品被广泛去糖基化为盐酸胍变性的对照。因此，这些结果示出三氮杂双环癸烯(试剂#3，图5A)、叔丁基四甲基胍(试剂#2，图5B)和四甲基胍(试剂#1，图5C)对使糖蛋白变性和促进糖苷酶的活性的有效性。

图6展示了由衍生于

图6是对实现阿巴西普的N-去糖基化不需要脱盐的演示。5mM试剂浓度在其50℃孵育期间不会对PNGase F反应性造成任何显著干扰。因为所述的胍基试剂和脒基试剂是非亲核的，所以其用途也可以与需要亲电试剂的衍生化反应和亲核取代反应直接结合。当N-聚糖通过PNGase F从糖蛋白裂解时，首先将N-聚糖以N-葡基胺的形式释放到溶液中，该N-葡基胺可以用亲电试剂快速衍生化，该亲电试剂包括但不限于RapiFluor-MS

然而，在一些示例中，期望能够从N-去糖基化样品制备步骤直接进行到衍生化反应，使得整个样品制备时间最小化。因此，如取代的胍基试剂和取代的脒基试剂的非亲核变性剂用于帮助使整个样品制备时间最小化。对于图6的样品，观察到高水平的信号和聚糖种类的多样性，这证明了该方法的有效性。因此，在一些示例中，取代的胍基试剂或取代的脒基试剂可以用于使随后用亲电衍生化试剂去糖基化和处理的糖蛋白变性。

胍、SDS和RapiGest

将多克隆兔IgG(rIgG)用作评估各种试剂的变性力的测试蛋白质。溶解rIgG蛋白质并用水稀释至0.25mg/mL的浓度，同时还使其经受感兴趣化合物和在室温、50℃、70℃或90℃下进行的孵育。为了产生用于完全变性的阳性对照，在0和高达8M浓度下用盐酸胍使rIgG样品经受室温孵育。然后，使用280nm的激发波长测量所得样品的天然荧光。随后检测到376nm和360nm处的发射强度并报告为作为rIgG变性和色氨酸残基局部环境变化的敏感量度的比。这些数据展示在图2中并且代表经典变性曲线。针对天然状态rIgG观察到的荧光强度比被测定为大约1.3，然而观察到8M胍变性状态的荧光强度比为大约1.6。同时，发现用1％(w/v)RapiGest SF[～24mM]处理之后的rIgG的荧光强度比为大约1.4，这表明其仅产生部分变性。

在图3中提供在用试剂#1、试剂#2和试剂#3并且在环境、50℃、70℃或90℃的温度下进行孵育之后获得的荧光强度比。同样，在图4中提供在用试剂#4、试剂#5和试剂#6并且在环境、50℃、70℃或90℃的温度下进行孵育之后获得的荧光强度比。在所有实验中，在与蛋白质样品一起孵育之前，将取代的胍和取代的脒滴定至中性pH和其质子化的电离状态。

为了证明使用取代的胍基变性与用PNGase F进行的酶促去糖基化的相容性，使

随后，通过抽吸混合每个孔的内容物。然后，每个样品在90℃下孵育3分钟以进行变性，并且然后从加热块中取出以在室温下冷却3分钟。将每种变性的糖蛋白样品用1.6μLGlycoWorks Rapid PNGase F在50℃下处理5分钟。提交包含10μL每种去糖基化样品的等分试样用于完整蛋白质分析，而对剩余的30μL样品进行RapiFluor-MS

另外，施加两个对照。对于阳性对照(图5D)，将5μL

如图5E所示，未修饰的

值得注意的是，可以看到取代的胍基处理的样品的反相色谱图(图5A至图5C)与阳性对照的反相色谱图(图5D)高度相似，这表明用5mM胍基和热孵育进行变性的蛋白质的后续去糖基化与使用传统的8M盐酸胍处理是一样高效的。此外，由于取代的胍基试剂的温度依赖性、强变性作用的有益效果，可以消除额外的脱盐步骤，而不会对PNGase F糖苷酶的活性造成负面影响，因为通常对酶促消化施加较低的温度。

为了证明上述取代的胍可以用作针对用RapiFluor-MS

图6示出从5mM四甲基胍变性的

预示地说，可以借助于在90℃下孵育5分钟，用50mM四甲基胍在50mM Tris(pH 7)、10mM氯化钙缓冲液中使蛋白质样品(50μg)变性。然后，可以将蛋白质样品冷却，任选地将其还原和/或烷基化并通过上浆介质脱盐，如可用SizeX 100脱盐吸头(可从IntegratedMicro-Chromatography Systems，Inc(IMCS)，Irmo，SC获得)完成。然后，可以用溶液中的胰蛋白酶在50mM Tris、10mM氯化钙缓冲液中在35℃至45℃下消化脱盐样品4小时或用固定的胰蛋白酶树脂在50℃至70℃下消化脱盐样品5分钟至20分钟。然后，可以通过反相色谱和UV或质谱检测来分析所得的肽消化物。

在另一预示实验中，可以在50mM Tris(pH 7)、10mM氯化钙缓冲液中用5mM四甲基胍在90℃下孵育蛋白质样品。在冷却之后，可以任选地还原和/或烷基化变性的蛋白质，并且然后用溶液中的胰蛋白酶在35℃至45℃下将其消化4小时。

另选地，来自上述过程中的任一过程的变性的蛋白质样品可以用固定的蛋白酶在45℃至75℃范围内的温度下消化短于4小时的时限。

通过用于肽图的通用LC-MS方法分析消化缓冲液中的1mM每种四甲基胍变性剂(图7A是空白；试剂#1，图7B；试剂#2，图7C；和试剂#3，图7D)。示出在图7B和图7D中，试剂1和试剂3似乎没有示出跨梯度(1％-40％乙腈)的显著干涉峰，其中肽正常洗脱。图7C中的试剂2示出在保留时间为～10min和18.72min处的两个突出峰。如果在LC-MS分析之前没有从样品中去除试剂2，这可能导致对在这个时间窗中共洗脱的肽的强干扰。然而，不受理论限制，可以通过利用更高级的试剂来减少或去除这些干扰。表3示出针对BioAccord

虽然本公开已经参考其示例性实施方案具体示出和描述，但是本领域技术人员将理解，在不脱离所附权利要求所涵盖的本技术的范围的情况下，可以在形式和细节上进行各种改变。例如，可以使用其它色谱系统或检测系统。