一种卵巢器官芯片、制作方法及其应用

技术领域

本申请涉及生殖医学技术领域，尤其涉及一种卵巢器官芯片、制作方法及其应用。

背景技术

随着经济水平的快速发展和医疗技术的巨大进步，进入二十一世纪以后，人类的寿命显著延长。据估计，2050年老年人口总数将是十九世纪五十年代的5倍。中国作为全球人口数目最多的国家，早已步入老龄化社会，根据最新的人口普查数据，中国老年群体的规模和增速均远超国际一般水平，伴随带来了巨大的社会养老负担和器官衰老引发的健康问题。此外，器官衰老与肿瘤、糖尿病、心血管疾病和肥胖也息息相关，上述情况将共同导致生活质量的下降，延长调整伤残年。因此，如何延缓器官衰老尤为重要。

卵巢是人体内最早发生衰老的器官之一，其特征为卵泡数目和质量的显著降低，并最终表现为绝经。卵巢的主要功能在于分泌性激素和产生卵子，当卵巢逐渐衰老时，卵巢分泌的雌激素和孕激素水平下降，同时伴随着卵泡刺激素和黄体生成素水平增高，在激素的影响下，女性骨质疏松、阿尔茨海默病和心血管疾病的风险均显著增加，因此，卵巢衰老亦被称为女性机体衰老的“起搏器”。对卵巢展开广泛而深入的研究，有助于寻找延缓卵巢衰老的策略。

另一方面，越来越多的女性选择推迟婚育，但卵巢衰老随着增龄却在不断加速，卵子数量和质量骤减，女性的生育能力受到极大挑战。目前，全球有超过15％的夫妻面临不孕不育问题。对卵泡的存活和闭锁展开研究，有望为女性不孕症提供新的解决方案。除此之外，卵巢原因导致的不孕也会受到卵巢性疾病的影响，如卵巢纤维化、子宫内膜异位症、卵巢癌等疾病，它们通过细胞外基质过度沉积、炎症因子和免疫细胞浸润，或者受到疾病治疗过程中的医源性干预影响，最终将导致不同程度的卵巢损害。

发明内容

本发明的目的在于提供一种卵巢器官芯片、制作方法及其应用，以改善上述问题。

为了实现上述目的，本申请实施例提供了如下技术方案：

一方面，本申请实施例提供了一种卵巢器官芯片，包括：

所述卵巢器官芯片由四层结构封接而成，自上而下依次为卵巢芯片上层、卵泡培养层、多孔滤膜层和卵巢芯片下层，所述卵巢芯片上层包括上层入口池、上层培养基灌流室、上层出口池和上层灌流通道；所述上层培养基灌流室上端通过上层灌流通道与上层入口池相通，下端通过上层灌流通道与上层出口池相通；所述卵巢芯片下层包含下层入口池、下层培养基灌流室、下层出口池和下层灌流通道，所述下层培养基灌流室上端通过下层灌流通道与下层入口池相通，下端通过下层灌流通道与下层出口池相通；所述卵巢芯片上层(1)和卵巢芯片下层(4)的灌流通道所在方向互相垂直；所述卵泡培养层上设有圆孔或圆柱。

可选地，所述卵巢芯片上层、所述卵泡培养层和所述卵巢芯片下层所用材料选自聚二甲基硅氧烷PDMS、聚苯乙烯、玻璃或聚己内酯PCL中的至少一种或组合。

可选地，分别使用独立的微泵对所述卵巢芯片上层和所述卵巢芯片下层进行控制，所述微泵的流速为10-1000μL/h。

可选地，所述卵巢器官芯片的封接方式包括但不限于PDMS胶体粘合连接、氧气等离子体不可逆封接或环氧树脂封接中的任意一种。

可选地，所述圆孔或圆柱呈阵列通量，个数为10-200。

可选地，所述卵泡培养层上设有圆孔，构成蜂巢状卵巢芯片，圆孔与多孔滤膜层形成细胞培养小室，细胞培养小室具有不同孔径结构，孔径直径为30-700μm，深度为50-700μm，越靠近上层入口池，细胞培养小室直径越小、深度越浅。

可选地，所述卵泡培养层上设有圆柱，构成栅格状卵巢芯片，圆柱与多孔滤膜层形成细胞培养栅格，通过阻挡卵泡进行培养，圆柱之间具有不同的间距，间距范围为30-700μm，高度为50-700μm，圆柱直径为30-100μm，越靠近上层入口池，圆柱之间的间距越大。

可选地，所述多孔滤膜层包括一个多孔滤膜，所述多孔滤膜的成分包括聚碳酸酯膜、纤维素膜、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜、聚醚砜、细胞培养膜或聚四氟乙烯膜中的至少一种，所述多孔滤膜的厚度为10-200μm，所述上层灌流通道和下层灌流通道的高度均为200-1000μm。

第二方面，本申请实施例提供了一种卵巢器官芯片的制作方法，包括：

选用生物3D打印方法或牺牲层制造浇注方法制作所述卵巢器官芯片。

第三方面，本申请实施例提供了一种卵巢器官芯片的应用，用于构建卵巢生理模型、卵巢病理模型和卵巢干预模型，所述卵巢生理模型包括卵巢排卵模型和卵巢衰老模型。

可选地，构建卵巢排卵模型的方法，包括：

将上述卵巢器官芯片进行高温湿热灭菌处理，之后进行烘干处理；

从组织中分离得到卵巢第一体细胞和卵巢卵巢第二体细胞，并通过免疫荧光的方法对其细胞类型进行鉴定。池注入芯片，倒置，卵巢第一体细胞贴附于多孔滤膜层生长，将卵巢器官芯片平移放入37℃培养箱中静置培养2小时，然后将DMEM培养基从下层入口池缓慢注入，冲出未贴壁的细胞；

正置芯片，将卵巢第二体细胞从上层入口池注入芯片，卵巢第二体细胞贴附于多孔滤膜层生长，将卵巢器官芯片平移放入37℃培养箱中静置2小时，然后将M5a培养基从上层入口池缓慢注入，冲出未贴壁的细胞，正置过夜；其中，卵巢第一体细胞和卵巢第二体细胞均需要通过

将各级别卵泡从上层入口池(5)注入卵巢器官芯片，以5-15mIU/mL卵泡刺激素加入卵泡生长培养基中，从上层入口池(5)注入芯片，应用微流体泵保持一定的灌流，避免卵泡沉降贴壁成2D状态，培养7-14天后，给予一次性的5-15mIU/mL人绒毛膜促性腺激素，培养14-18小时后，观察排卵的发生，完成卵巢排卵模型的构建。

可选地，构建卵巢衰老模型的方法，包括：

按照构建卵巢排卵模型的方法，添加同一年龄段的卵巢第一体细胞、卵巢第二体细胞和卵泡，将所述卵巢排卵模型中的全部培养基全部替换为通用培养基，使用通用培养基进行培养；

使用不同年龄段的卵巢第一体细胞、卵巢第二体细胞和卵泡，使用通用培养基进行培养，观察增龄对卵泡数量和质量的影响研究，完成卵巢衰老模型的构建。

可选地，所述通用培养基包括基础培养基、营养因子、重组蛋白、激素、抗生素和生长因子，所述基础培养基包括但不限于DMEM、DMEM/F12、αMEM和M199，所述激素包括但不限于雌激素、孕激素、雄激素、人绒毛膜促性腺激素、卵泡刺激素和黄体生成素，所述生长因子包括血管表皮生长因子、表皮生长因子和胰岛素样生长因子。

可选地，构建卵巢病理模型的方法，包括：

在所述卵巢排卵模型的基础上，将所述卵巢排卵模型中的全部培养基全部替换为通用培养基，并在通用培养基中添加各种重组蛋白、生长因子、趋化因子、炎症因子或肿瘤细胞，得到卵巢病理模型，用于模仿各种病理性卵巢。

卵巢病理模型包括但不限于纤维化模型、卵巢细胞衰老模型、卵巢癌模型和外界环境损伤模型，具体的构建方法为：

纤维化模型：在注入通用培养基之前，注入细胞外基质液体于培养腔室，将卵巢器官芯片平移放入培养箱中孵育30min，促使凝胶，后将细胞外基质液体冲刷出来，其余步骤同卵巢排卵模型的构建步骤一样；其中，细胞外基质液体包含不同浓度的I型胶原、纤连蛋白、明胶、基质胶Matrigel等天然或人工合成的细胞外基质水溶液，其成分包括但不限于上述物质及它们的组合；或

在通用培养基中加入TGFB、IL6或者IL11等因子，静置过夜后添加各级卵泡。其余步骤同卵巢排卵模型的构建步骤一样；

卵巢细胞衰老模型：在通用培养基中加入诱导衰老试剂或抗衰老药物，前者包括但不限于5％的过氧化氢和D-半乳糖等，后者包括但不限于非司酮、达沙替尼、槲皮素和雷帕霉素等，其余步骤同卵巢排卵模型的构建步骤一样；

卵巢癌模型：将卵巢第二体细胞换为卵巢癌细胞系，包括但不限于OVCAR3、OVCAR5、SKOV3、OVHM、ID8、UWB1.289、SVOG、MES-OV等卵巢肿瘤细胞系，使用通用培养基培养，其余步骤同卵巢排卵模型的构建步骤一样；

外界环境损伤模型：在通用培养基中加入外界环境成分，包括但不限于大气颗粒物、微塑料、环境内分泌干扰物、四氯化碳等，其余步骤同卵巢排卵模型的构建步骤一样；

所述的通用培养基能够适用于多种不同细胞的混合培养，以满足不同细胞的生长和功能需求。通用培养基的基础培养基包括但不限于DMEM、DMEM/F12、αMEM、M199等，通过添加与培养细胞对应的营养因子、重组蛋白、激素和生长因子，按照适当的比例进行组合，并添加所需的抗生素等构成完全培养基。与培养细胞对应的因子包括但不限于雌激素、孕激素、雄激素、人绒毛膜促性腺激素、卵泡刺激素、黄体生成素、血管表皮生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子等。

可选地，构建卵巢干预模型的方法，包括：

在所述卵巢排卵模型的基础上，将所述卵巢第一体细胞、卵巢第二体细胞替换为年轻的卵巢第一体细胞和卵巢第二体细胞，将所述卵泡替换为年老的卵泡，利用年轻的卵巢第一体细胞和卵巢第二体细胞，观察对年老卵泡的逆转作用；或

在所述卵巢排卵模型的基础上，将所述卵巢第一体细胞、卵巢第二体细胞替换为年老的卵巢第一体细胞和卵巢第二体细胞，将所述卵泡替换为年轻的卵泡，利用年老的卵巢第一体细胞和卵巢第二体细胞，观察对年轻的卵泡的损伤作用；或

在所述卵巢生理模型或卵巢病理模型的基础上，添加干预措施，观察所述卵巢的反应；所述干预措施包括添加小分子化合物、药物、纳米靶向肽、植物提取物和病毒载体。

本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：

1、细胞成分完整。本发明使用到了卵巢第一体细胞(包括颗粒细胞和各种来源干细胞)、卵巢第二体细胞(包括卵泡膜细胞、间质细胞、血管内皮细胞和各种来源干细胞)和各级卵泡(包括原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、窦前卵泡、窦状卵泡和排卵前卵泡)，涵盖了真实卵巢内的所有细胞成分，在器官芯片的设计下排布，模仿了卵巢体细胞为卵泡提供适宜生长环境的情况，更能模仿体内卵巢的真实情况。

2、卵巢功能全面。本发明通过使用多种细胞类型、改变培养基成分和生长环境等，既能实现卵巢的激素合成、卵巢发育与成熟等卵巢的重要功能，还能探究疾病发生机制、肿瘤的发生发展与侵袭转移等卵巢状态，甚至通过干预措施，可用于研发药物、肿瘤的个体化治疗、生育力保存等研究。

3、建模覆盖广泛。本发明包含了生理性卵巢建模(包括卵巢排卵模型和卵巢衰老模型等)、卵巢病理模型(包括纤维化模型、卵巢细胞衰老、卵巢癌模型和外界环境损伤模型等，模拟了卵巢纤维化、子宫内膜异位囊肿、卵巢单纯性囊肿和卵巢癌等疾病)和卵巢干预模型(小分子化合物、药物、纳米靶向肽、植物提取物和病毒载体)。

4、卵巢研究转化高效。目前，卵巢细胞培养多采取2D培养的方式，且目前3D培养的体系不够成熟，使得相关科学研究成果向临床转化困难，患者卵巢功能受损情况无法得到有效延缓，甚至是逆转。而本发明采用卵巢器官芯片构建了一个新的3D培养体系，并可通过调整以模仿卵巢在生理、病理和干预三种状态下的情况，可以实现对卵巢生理发育的研究、对卵巢发病机制的探讨，以及使用各种方式干预后的效果，将从根本上改良卵巢领域的研究方法，提高临床转化效率。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例中卵泡培养层上设有圆孔时卵巢器官芯片整体结构的爆炸图。

图2是本发明实施例中卵泡培养层上设有圆柱时卵巢器官芯片整体结构的爆炸图。

图3是卵巢第一体细胞和卵巢第二体细胞的细胞类型鉴定图。

图中标记：1、卵巢芯片上层；2、卵泡培养层；3、多孔滤膜层；4、卵巢芯片下层；5、上层入口池；6、上层培养基灌流室；7、上层出口池；8、上层灌流通道；9、圆孔；10、圆柱；11、多孔滤膜；12、下层入口池；13、下层培养基灌流室；14、下层出口池；15、下层灌流通道；16、细胞培养小室。

具体实施方式

为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

实施例1

如图1和图2所示，本实施例提供了一种卵巢器官芯片，所述卵巢器官芯片由四层结构封接而成，自上而下依次为卵巢芯片上层1、卵泡培养层2、多孔滤膜层3和卵巢芯片下层4，所述卵巢芯片上层1包括上层入口池5、上层培养基灌流室6、上层出口池7和上层灌流通道8；所述上层培养基灌流室6上端通过上层灌流通道8与上层入口池5相通，下端通过上层灌流通道8与上层出口池7相通；所述卵巢芯片下层4包含下层入口池12、下层培养基灌流室13、下层出口池14和下层灌流通道15，所述下层培养基灌流室13上端通过下层灌流通道15与下层入口池12相通，下端通过下层灌流通道15与下层出口池14相通；所述卵泡培养层2上设有圆孔9或圆柱10。

在本公开的一种具体实施方式中，所述卵巢芯片上层1、卵泡培养层2和所述卵巢芯片下层4所用材料选自聚二甲基硅氧烷PDMS、聚苯乙烯、玻璃或聚己内酯PCL中的至少一种或组合。

在本公开的一种具体实施方式中，分别使用独立的微泵对所述卵巢芯片上层1和所述卵巢芯片下层4进行控制，微泵可使用程序进行参数的调节，所述微泵的流速为10-1000μL/h。

在本公开的一种具体实施方式中，所述卵巢器官芯片的封接方式包括但不限于PDMS胶体粘合连接、氧气等离子体不可逆封接或环氧树脂封接中的任意一种。

在本公开的一种具体实施方式中，所述圆孔9或圆柱10呈阵列通量，个数为10-200，阵列可进行编码，对卵泡发育过程，病理生理改变进行原位追踪观察。

在本公开的一种具体实施方式中，所述卵泡培养层2上设有圆孔9，构成蜂巢状卵巢芯片，圆孔9与多孔滤膜层3形成细胞培养小室16，细胞培养小室16具有不同孔径结构，孔径直径为30-700μm，深度为50-700μm，越靠近上层入口池5，细胞培养小室16直径越小、深度越浅，所述细胞培养小室16底部为多孔滤膜层(3)，细胞培养小室16的上层灌流通道8和下层灌流通道15可同时添加流体，可以实现上下层营养物和代谢产物的物质交换。

在本公开的一种具体实施方式中，所述卵泡培养层2上设有圆柱10，构成栅格状卵巢芯片，圆柱10与多孔滤膜层3形成细胞培养栅格，通过阻挡卵泡进行培养，圆柱10之间具有不同的间距，间距范围为30-700μm，高度为50-700μm，圆柱直径为30-100μm，越靠近上层入口池5，圆柱10之间的间距越大。

在本公开的一种具体实施方式中，所述多孔滤膜层3包括一个多孔滤膜11，所述多孔滤膜11的成分包括聚碳酸酯膜、纤维素膜、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜、聚醚砜、细胞培养膜或聚四氟乙烯膜中的至少一种，所述多孔滤膜11的厚度为10-200μm，所述上层灌流通道8和下层灌流通道15的高度均为200-1000μm。

本实施例通过构建卵巢器官芯片，在体外模仿卵巢内实质细胞的生理环境和病理改变，从而进行激素合成、卵巢发育与成熟、疾病发生机制、肿瘤的发生发展与侵袭转移等研究，并将其用于研发药物、肿瘤的个体化治疗、生育力保存。该器官芯片亦可构建卵巢纤维化、子宫内膜异位囊肿、卵巢单纯性囊肿和卵巢癌模型，通过对这些疾病的发生机制进行研究，在治疗疾病的同时，也可探究生育力保护的策略。

实施例2

一种卵巢器官芯片的制作方法，包括：

选用生物3D打印方法或牺牲层制造浇注方法制作上述卵巢器官芯片。当采用生物3D打印的方法时，需要提前建立好卵巢芯片的模型，通过计算机切片软件完成对模型的切片，最终得到3D打印路径数据，通过挤出式或光固化打印机进行打印即可。当采用牺牲层制造浇注方法，根据构建的三维模型，制作模具和牺牲层材料即可。

实施例3

一种卵巢器官芯片的应用，用于构建卵巢排卵模型，构建方法包括：

步骤一、将上述的卵巢器官芯片进行高温湿热灭菌处理，烘干温度为65-80℃；

步骤二、从组织中分离得到卵巢第一体细胞和卵巢卵巢第二体细胞，并通过免疫荧光的方法对其细胞类型进行鉴定，细胞类型鉴定图如图3，将卵巢第一体细胞从下层入口池注入芯片，倒置，卵巢第一体细胞贴附于多孔滤膜层生长，将卵巢器官芯片平移放入37℃培养箱中静置培养2小时，然后将DMEM培养基从下层入口池缓慢注入，冲出未贴壁的细胞；其中，卵巢第一体细胞包括颗粒细胞和各种来源干细胞；

步骤三、正置芯片，将卵巢第二体细胞从上层入口池5注入芯片，卵巢第二体细胞贴附于多孔滤膜层3生长，将卵巢器官芯片平移放入37℃培养箱中静置2小时，然后将M5a培养基从上层入口池5缓慢注入，冲出未贴壁的细胞，正置过夜；其中，卵巢第二体细胞包括卵泡膜细胞、间质细胞、血管内皮细胞和各种来源干细胞。所述卵巢第一体细胞和卵巢第二体细胞可为动物来源，包括但不限于猴、小鼠、大鼠、猪、牛、羊等哺乳动物，从实验动物中心和屠宰场获得动物的子宫标本。也可为临床患者标本来源的原代细胞，以及各种来源的细胞系，包括但不限于KGN、COV434等。所有的细胞在进入卵巢器官芯片之前，均已消化成单细胞悬液，细胞悬液密度为1-8×10

步骤四、将各级别卵泡从上层入口池(5)注入卵巢器官芯片，以5-15mIU/mL卵泡刺激素加入卵泡生长培养基中，从上层入口池(5)注入芯片，应用微流体泵保持一定的灌流，避免卵泡沉降贴壁成2D状态，培养7-14天后，给予一次性的5-15mIU/mL人绒毛膜促性腺激素，培养14-18小时后，观察排卵的发生，完成卵巢排卵模型的构建。各级卵泡包括原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、窦前卵泡、窦状卵泡和排卵前卵泡；所述卵泡生长培养基的主体为αMEM培养基，同时添加有胎牛血清、青霉素、链霉素、重组人卵泡刺激素和ITS，其中胎牛血清占总体积的10％，青霉素和链霉素合计占总体积的0.1％，重组人卵泡刺激素在培养基中的浓度为10mIU/mL，ITS由胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠构成，在培养基中的浓度分别为胰岛素5μg/mL、转铁蛋白5μg/mL和亚硒酸钠5ng/mL；

实施例4

一种卵巢器官芯片的应用，用于构建卵巢衰老模型，构建方法包括：

按照构建卵巢排卵模型的方法，添加同一年龄段的卵巢第一体细胞、卵巢第二体细胞和卵泡，将所述卵巢排卵模型中的全部培养基全部替换为通用培养基，使用通用培养基进行培养；使用不同年龄段的卵巢第一体细胞、卵巢第二体细胞和卵泡，使用通用培养基进行培养，观察增龄对卵泡数量和质量的影响研究，完成卵巢衰老模型的构建。

具体为：按照构建卵巢排卵模型的方法步骤(所有的步骤都与构建卵巢排卵模型的步骤相同)，区别点在于，第一，首先添加年轻(1-3月龄)的卵巢第一体细胞、卵巢第二体细胞和卵泡，再添加年老(1.5-2年龄)的卵巢第一体细胞、卵巢第二体细胞和卵泡；第二，将构建卵巢排卵模型的方法中的培养基全部替换为通用培养基进行培养。通过添加不同年龄段的卵巢第一体细胞、卵巢第二体细胞和卵泡，来观察增龄对卵泡数量和质量的影响研究。

在构建卵巢排卵模型和卵巢衰老模型期间，还可进行卵巢芯片功能的检测，检测方法为：

培养期间每天从细胞出口池收集培养基，检测雌激素、孕激素水平变化，以反映卵巢芯片上层1、卵泡培养层2和卵泡的功能；利用CCK-8试剂盒检测细胞活性；利用活死染色试剂盒检测细胞存活状态；利用CD31等指标做免疫荧光显示卵泡周围和卵巢体细胞中血管的形成情况；利用LYVE1等指标做免疫荧光显示卵泡周围和卵巢体细胞中淋巴管的形成情况。

实施例5

上述卵巢器官芯片的应用，在实施例3构建的卵巢排卵模型的基础上，用于构建卵巢病理模型，构建方法包括：

在所述卵巢排卵模型的基础上，将所述卵巢排卵模型中的全部培养基全部替换为通用培养基，并在通用培养基中添加各种重组蛋白、生长因子、趋化因子、炎症因子或肿瘤细胞，得到卵巢病理模型，用于模仿各种病理性卵巢。

卵巢病理模型包括纤维化模型、卵巢细胞衰老模型、卵巢癌模型和外界环境损伤模型等，具体的构建方法为：

纤维化模型：在注入通用培养基之前，注入细胞外基质液体于培养腔室，将卵巢器官芯片平移放入培养箱中孵育30min，促使凝胶，后用细胞外基质液体冲刷，其余步骤同卵巢排卵模型的构建步骤一样；其中，细胞外基质液体包含不同浓度的I型胶原、纤连蛋白、明胶、基质胶Matrigel等天然或人工合成的细胞外基质水溶液，其成分包括但不限于上述物质及它们的组合；或

在通用培养基中加入TGFB、IL6或者IL11等因子，静置过夜后添加各级卵泡。其余步骤同卵巢排卵模型的构建步骤一样；

卵巢细胞衰老模型：在通用培养基中加入诱导衰老试剂或抗衰老药物，前者包括但不限于5％的过氧化氢和D-半乳糖等，后者包括但不限于非司酮、达沙替尼、槲皮素和雷帕霉素等，其余步骤同卵巢排卵模型的构建步骤一样；

卵巢癌模型：将卵巢第二体细胞换为卵巢癌细胞系，包括但不限于OVCAR3、OVCAR5、SKOV3、OVHM、ID8、UWB1.289、SVOG、MES-OV等卵巢肿瘤细胞系，使用通用培养基培养，其余步骤同卵巢排卵模型的构建步骤一样；

外界环境损伤模型：在通用培养基中加入外界环境成分，包括但不限于大气颗粒物、微塑料、环境内分泌干扰物、四氯化碳等，其余步骤同卵巢排卵模型的构建步骤一样；

实施例6

上述卵巢器官芯片的应用，在上述构建的卵巢生理和病理模型的基础上，用于构建卵巢干预模型，构建方法包括：

在所述卵巢排卵模型的基础上，将所述卵巢第一体细胞、卵巢第二体细胞替换为年轻的卵巢第一体细胞和卵巢第二体细胞，将所述卵泡替换为年老的卵泡，利用年轻的卵巢第一体细胞和卵巢第二体细胞，观察对年老卵泡的逆转作用；或

在所述卵巢排卵模型的基础上，将所述卵巢第一体细胞、卵巢第二体细胞替换为年老的卵巢第一体细胞和卵巢第二体细胞，将所述卵泡替换为年轻的卵泡，利用年老的卵巢第一体细胞和卵巢第二体细胞，观察对年轻的卵泡的损伤作用；或

在所述卵巢生理模型和卵巢病理模型的基础上，添加干预措施，观察所述卵巢的反应；所述干预措施包括添加小分子化合物、药物、纳米靶向肽、植物提取物和病毒载体。

利用本实施例中的卵巢器官芯片，可以进行卵巢生理模型的构建，利用卵巢生理模型，可以对延缓卵巢衰老进行研究，以对应卵巢早衰和更年期等情况；可以进行卵巢病理模型的构建，利用卵巢病理模型，可以对卵巢纤维化、子宫内膜异位囊肿、卵巢单纯性囊肿和卵巢癌等情况进行研究；可以进行卵巢干预模型的构建，在卵巢生理和病理模型基础上，添加各种药物、小分子化合物、植物提取物等，以研究治疗各种疾病的情况。同时，在构建不同的模型时，还可以应用人的标本，做高质量研究，通过此种方式可以显著提升临床转化水平。

以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。