一种辣椒全基因组SNP-Panel及其应用

技术领域

本发明涉及辣椒分子育种技术领域，具体涉及一种辣椒全基因组SNP-Panel及其应用。

背景技术

辣椒是一种重要的蔬菜作物，全国各地均有种植，2019年栽培面积约3400万亩。目前辣椒品种选育仍然以传统的表型选择为主要的技术手段，通过田间个体的表型观察来进行目标单株的选择，工作量大，育种周期长，精准度也不足。分子设计育种技术将实现对农艺性状的精确改良，显示出比其他育种手段更为突出的优越性，是今后作物育种技术发展的方向。

近年来随着高通量测序技术的飞速发展，辣椒基因组信息越来越丰富，为开展辣椒分子设计育种打下了良好的基础。目前分子标记辅助育种的技术有SSR/InDel、KASP和基因芯片，SSR/InDel和KASP可用的标记少，单价高，不适合全基因组范围的分子标记辅助育种；基因芯片价格高且核心技术为国外所有，不能大规模应用且不能满足个性化的需求，同时存在技术壁垒，鉴于当前的国际形势，不利于国内育种的安全。因此，开发一种覆盖全基因组的通量高、成本低的分子标记检测体系对于开展辣椒分子育种具有重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种辣椒全基因组SNP-Panel，通过一次扩增反应，可实现550个SNP位点的同时检测，检测覆盖度广，分析速度快，检测成本低。

为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种辣椒全基因组SNP-Panel，包括550个SNP位点以及所述SNP位点的扩增引物，所述550个SNP位点信息及扩增引物序列如表1所示。

本发明还提供了上述辣椒全基因组SNP-Panel在辣椒育种中的应用，所述应用包括以下一种或多种：

(1)建立辣椒DNA指纹数据库及遗传多样性分析；

(2)辣椒品种真实性及种子纯度鉴定；

(3)辣椒表型关联分析；

(4)辣椒分子设计育种、回交育种及其背景选择、全基因组育种。

优选的，所述建立辣椒DNA指纹数据库及遗传多样性分析包括如下步骤：

利用上述550个SNP位点的引物对辣椒的基因组DNA进行混合PCR扩增，扩增产物经测序、分型获得辣椒在所述550个SNP位点上的的基因组数据，即构成辣椒的DNA指纹数据库；

根据所述辣椒的DNA指纹数据库信息建立聚类树状图，即可进行辣椒的遗传多样性分析。

优选的，所述辣椒品种真实性鉴定的方法包括如下步骤：

分别提取待测辣椒品种样本和对照样本的基因组DNA；

利用上述的550个SNP位点的引物对待测辣椒样本和对照样本的基因组DNA进行扩增和测序，从而获取上述待测辣椒样本和对照样本各自在550个SNP位点的基因型数据进行品种真实性鉴定。

优选的，所述种子纯度鉴定的方法包括如下步骤：

根据上述方法获得待检测品种杂交种子双亲本在550个SNP位点基因型数据，分析并选择在双亲本中呈现多态性的SNP位点引物；

利用筛选出的多态性SNP引物对F1杂交种子进行PCR扩增测序分析检测，分析F1种子与双亲本的关系，从而鉴定辣椒品种种子纯度。

更优选的，所述选择的多态性SNP数量不少于2个。

优选的，所述辣椒表型关联分析的方法包括如下步骤：

选定极端表型个体，根据权利要求3所述方法获得极端表型个体在550个SNP位点基因型数据，分析并筛选在差异表型个体中呈现多态性的SNP位点信息；

利用筛选的SNP在分离群体中进行关联分析，确定与目标性状紧密连锁的SNP。

优选的，所述辣椒分子设计育种、回交育种及其背景选择的方法包括如下步骤：

根据上述方法获得待转育辣椒品种在550个SNP位点基因型数据，获得背景基因型；

根据育种目标选择目标基因供体亲本，与待转育品种进行杂交建立杂交分离群体或回交分离群体；

在分离群体中，通过目标性状进行前景筛选；

在选择的分离群里中，按照上述方法获得群体个体在550个SNP位点基因型数据；

比较个体基因型与所述获得的背景基因型，选择变异位点数最少的个体进行进一步转育，直至获得含有目标性状基因、背景基因型完全恢复的稳定个体。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种辣椒全基因组SNP-Panel，包括550个SNP位点以及所述SNP位点的扩增引物，所述SNP位点均匀分布于辣椒12条染色体上，覆盖面广，密度高。利用所述SNP-Panel通过一次扩增反应，可实现550个SNP位点的同时检测，能够实现辣椒分子设计育种的流程化、信息化，大幅度提高我国辣椒育种效率，缩短育种周期。本发明所述辣椒全基因组SNP-Panel体系稳定性好，操作简单，成本低，很好的解决了之前全基因组分子标记成本过高的问题，能够显著促进农业发展，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为挑选的SNPs在基因组上的分布情况。

图2为14份高代自交系辣椒的系统发生树。

具体实施方式

本发明提供了一种辣椒全基因组SNP-Panel，包括550个SNP位点以及所述SNP位点的扩增引物，所述550个SNP位点信息及扩增引物序列如表1所示：

表1 550个SNP位点信息及扩增引物序列

本发明中，所述550个SNP标记的分布如下：Chr01染色体62个SNPs；Chr02染色体26个SNPs；Chr03染色体61个SNPs；Chr04染色体44个SNPs；Chr05染色体44个SNPs；Chr06染色体48个SNPs；Chr07染色体43个SNPs；Chr08染色体35个SNPs；Chr09染色体46个SNPs；Chr10染色体42个SNPs；Chr11染色体47个SNPs；Chr12染色体52个SNPs。

本发明还提供了上述辣椒全基因组SNP-Panel在辣椒育种中的应用，所述应用包括以下一种或多种：

(1)建立辣椒DNA指纹数据库及遗传多样性分析；

(2)辣椒品种真实性及种子纯度鉴定；

(3)辣椒表型关联分析；

(4)辣椒分子设计育种、回交育种及其背景选择、全基因组育种。

本发明中，所述建立辣椒DNA指纹数据库及遗传多样性分析包括如下步骤：利用上述550个SNP位点的引物对辣椒的基因组DNA进行混合PCR扩增，扩增产物经测序、分型获得辣椒在所述550个SNP位点上的的基因组数据，即构成辣椒的DNA指纹数据库；根据所述辣椒的DNA指纹数据库信息建立聚类树状图，即可进行辣椒的遗传多样性分析。本发明中，所述辣椒基因组DNA的提取对象优选为辣椒的幼嫩组织，更优选为辣椒干种子、新鲜叶片、幼穗老叶、幼苗或幼嫩茎段。

本发明中，所述辣椒品种真实性鉴定的方法包括如下步骤：分别提取待测辣椒品种样本和对照样本的基因组DNA；利用上述的550个SNP位点的引物对待测辣椒样本和对照样本的基因组DNA进行扩增和测序，从而获取上述待测辣椒样本和对照样本各自在550个SNP位点的基因型数据进行品种真实性鉴定。

本发明中，所述种子纯度鉴定的方法包括如下步骤：根据上述方法获得待检测品种杂交种子双亲本在550个SNP位点基因型数据，分析并选择在双亲本中呈现多态性的SNP位点引物；利用筛选出的多态性SNP引物对F1杂交种子进行PCR扩增测序分析检测，分析F1种子与双亲本的关系，从而鉴定辣椒品种种子纯度。本发明中，所述选择的多态性SNP数量优选的不少于2个。

本发明中，所述辣椒表型关联分析的方法包括如下步骤：选定极端表型个体，根据权利要求3所述方法获得极端表型个体在550个SNP位点基因型数据，分析并筛选在差异表型个体中呈现多态性的SNP位点信息；利用筛选的SNP在分离群体中进行关联分析，确定与目标性状紧密连锁的SNP。

本发明中，所述辣椒分子设计育种、回交育种及其背景选择的方法包括如下步骤：根据上述方法获得待转育辣椒品种在550个SNP位点基因型数据，获得背景基因型；根据育种目标选择目标基因供体亲本，与待转育品种进行杂交建立杂交分离群体或回交分离群体；在分离群体中，通过目标性状进行前景筛选；在选择的分离群里中，按照上述方法获得群体个体在550个SNP位点基因型数据；比较个体基因型与所述获得的背景基因型，选择变异位点数最少的个体进行进一步转育，直至获得含有目标性状基因、背景基因型完全恢复的稳定个体。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

辣椒特定SNP筛选及SNP-Panel开发

1.核心资源重测序：

挑选不同类型、表型差异大、遗传距离较远的核心辣椒资源进行重测序，以公布的辣椒品种zunla基因组为参考基因组(版本：Zunla-1v2.0，网址：https://ftp.cngb.org/pub/CNSA/data2/CNPhis0000547/pepper/)，形成核心辣椒种质数据库。

2.变异检测：

利用高通量测序数据变异数据分析软件GATK(version 3.7)进行变异分析，按照如下条件进行了筛选：1)各样品测序深度不小于5；2)所有样品基因型缺失比例不超过50％；3)较小等位基因频率不低于5％。共获得了26084029个为SNP，其中17440583个是转换类型(A/G和C/T)，8643446个是颠换类型(A/C、A/T、C/G和G/T)，转换颠换比(Ts/Tv)为2.02。

3.特异SNP筛选及SNP-Panel开发：

根据如下标准筛选可用SNPs：1)SNP间隔大于100Kb；2)SNP对应的MAF不小于0.1；3)没有基因型缺失，共得到20376个SNPs。使用Primer3软件(version 2.5.0)来设计各目标SNP位点的扩增引物，设置的参数包括：1)引物序列的长度在17-32bp之间；2)Tm值在60-64℃之间；3)产物大小不超过500bp；4)测序reads必须能够覆盖目标位点。

对每个目标位点，设计3对引物，然后使用e-PCR软件(version 2.3.12)检测每对引物的扩增特异性，去掉非特异引物后共剩余34881对引物。检测引物之间形成二聚体的可能性，最终获得了550个SNP位点的扩增引物，这550个SNP位点即组成了本发明所述最终的SNP-Panel。这550个SNP位点在基因组上分布情况如附图1所示。

实施例2

辣椒资源DNA指纹图谱

1.辣椒资源DNA提取：

采用CTAB法提取辣椒组织的DNA：

1)选取辣椒幼嫩组织提取基因组DNA。

2)试剂配制：

CTAB缓冲液：2％CTAB，1.4M NaCl，l00mM Tris-HCl，l0mM EDTA，pH＝8.0；

洗涤缓冲液：76％乙醇，l0mM乙酸铵；

TE缓冲液：20mM Tris-HCl，lmM EDTA，pH8.0；

冰无水乙醇：将无水乙醇预先存放于-20℃，存放时间大于1小时。

3)提取辣椒组织中的DNA：

将取自辣椒的幼嫩组织剪碎，并在液氮环境中研磨；加入与组织的量相当的预热CTAB，并迅速置于65℃水浴，水浴30min至lh，每隔5min摇动一次；4℃、12000rpm/min离心l0min后，移出上清并加入等体积氯仿和异戊醇(氯仿和异戊醇体积比为24︰1)混合液，混匀；4℃、12000rpm/min离心15min后，移出上清并加入两倍体积冰无水乙醇，于-20℃放置lh；4℃、12000rpm/min离心l0min后，弃上清，沉淀经洗涤缓冲液洗涤后风干；加入5μL至l00μL的TE缓冲液，充分溶解；用琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，并用紫外分光光度计检测浓度和纯度；将检测后的DNA保存于-20℃。

2.文库构建与测序:

使用实施例1中表1所述550个SNP引物捕获各目标位点的DNA序列，然后回收产物并质检合格后依据Illumina文库构建流程完成Paired-end(PE)测序文库构建，取各个样本等量DNA构建一个PE文库并在Illumina Hiseq测序仪上进行PE150测序。

3.目标位点基因型分析:

对测序获得的原始数据进行数据质控，得到高质量的clean data，然后使用BWA软件将clean data分解到各目标位点，得到SAM格式的比对结果，然后使用软件samtools将SAM格式的文件转换成BAM格式，接着使用Picard工具中的SortSam对BAM文件中的reads进行排序，得到最终的BAM文件。使用GATK确定各目标位点的基因型，即构成辣椒种质资源DNA指纹图谱，如表2显示部分辣椒资源图谱信息。

表2显示部分辣椒资源图谱信息

统计发现，25份辣椒资源群体中需要检测的基因型共有13750个，最终获得了有效数据(Depth≥30)的基因型比例为96.41％，平均测序深度为1990.26倍。

实施例3

辣椒资源遗传多样性分析

为了验证SNP-Panel的可靠性和应用价值，挑选14份不同类型的辣椒自交系，对其550个SNP标记进行了检测。参照实施例2的实验方法，得到了14份辣椒自交系的SNP基因型，然后基于SNP基因型构建系统发生树。使用MEGA7(version 7.0)软件中的邻接法(neighbor-joining methods)构建系统发生树，并使用ggtree(version 1.7.10)进行可视化。结果如图2所示。

可以看出，14份辣椒自交系能被本发明所述的辣椒全基因组SNP-Panel清晰区分，相同类型的辣椒能被聚到一起，表明亲缘关系更近。系统发生树的结果揭示了14份辣椒资源的亲缘关系，将有效指导下一步的辣椒育种研究。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。