一株可降解微囊藻毒素的寡养单胞菌、固定化菌剂及应用

技术领域

本发明涉及一种寡养单胞菌，具体涉及一株可降解微囊藻毒素的寡养单胞菌、固定化菌剂及应用。属于水处理技术领域。

背景技术

随着社会经济水平的逐步提高和人类活动的不断扩张，水体富营养化和全球气候变暖日益严重，最终导致有害藻华的频繁爆发。有害藻华污染会产生不同种类的藻毒素，藻毒素通常会在藻类自然衰亡或物理压力引起细胞裂解时释放出来

MCs是一组具有共同结构cyclo-(D-Ala-X-D-MeAsp-Z-Adda-D-Glu-Mdha)的环七肽肝毒素，其中X和Z为两个可变的L-氨基酸。迄今为止已经发现了250多种 MC异构体，其中MC-LR是毒性最大、数量最多的MC异构体。MC-LR可抑制真核生物的蛋白磷酸酶(ProteinPhosphatase 1)和蛋白磷酸酶2A(Protein Phosphatase 2A) 的活性，在真核细胞中引起氧化应激，威胁真核生物的健康。MC-LR通过饮用水供应、日常活动和食物链等途径富集进入人体后，诱发人类肝脏、肠道和肾脏等不同器官的疾病。因此，找到一种高效的MC-LR去除方法迫在眉睫。

MC-LR的环状结构使其在环境中特别稳定，可以抵抗各种自然因素，包括高温、极端pH值、阳光和非特异性酶，因此，城市水处理厂不得不采取一系列措施处理水中的MC-LR。活性炭吸附、氯化、臭氧化等一系列物理和化学方法

目前尚无将寡养单胞菌用于微囊藻毒素降解的相关报道。

发明内容

本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一株可降解微囊藻毒素的寡养单胞菌、固定化菌剂及应用。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

1、一株可降解微囊藻毒素的寡养单胞菌(Stenotrophomonas geniculate)DMC-X3，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2022年7月4日，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC NO.62597。

2、上述寡养单胞菌在微囊藻毒素污染水处理中的应用。

3、一种固定化菌剂，是以海藻酸钠为载体，氯化钙为交联剂，包埋前述寡养单胞菌而得。

4、上述一种固定化菌剂的制备方法，具体步骤如下：

(1)先将所述的寡养单胞菌DMC-X3接种于MSM无机盐液体培养基中，以微囊藻毒素-LR(MC-LR)为唯一碳氮源，摇床培养，离心取沉淀，再用MSM无机盐液体培养基重悬，获得菌悬液；

(2)然后将质量浓度2％海藻酸钠水溶液和等体积的菌悬液充分混匀，得到混合液，接着将混合液逐滴滴至质量浓度2％氯化钙水溶液中，在4℃条件下固定化交联 4～6小时，即得小球状的固定化菌剂，无菌水清洗，室温风干，即可。

5、上述一种固定化菌剂在微囊藻毒素污染水处理中的应用。

6、上述一种固定化菌剂在蓝藻藻华处理中的应用。

本发明的有益效果：

本发明从福建省漳州市南靖县南一水库爆发蓝藻水华的表层水体样品中分离、筛选得到一株微囊藻毒素降解菌Stenotrophomonas geniculate DMC-X3，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO.62597。菌株DMC-X3对低浓度和高浓度的MC-LR都具有良好的降解性能，且随着DMC-X3接种量的增加，降解速率也逐渐提高。同时，DMC-X3能极端pH和温度的环境压力下高效降解微囊藻毒素，其最适合的微囊藻毒素降解温度和pH值分别为30℃和pH＝7。

本发明还以海藻酸钠和氯化钙为固定化材料，对DMC-X3进行固定，获得的固定化菌剂能够多次重复高效降解微囊藻毒素。DMC-X3固定化菌剂具有良好的生物活性和化学稳定性，且具有制备工艺简单、成本低、利于保存和大规模现场应用等优点，有望用于工业上大规模治理微囊藻毒素污染。

附图说明

图1为MC-LR降解菌DMC-X3的生长曲线及对MC-LR的降解曲线。

图2为菌株DMC-X1的系统发育进化树和形态图，其中，(A)为菌株DMC-X3 基于16SrRNA基因序列构建的系统发育进化树，由(A)可知，菌株DMC-X3隶属于Stenotrophomonas属，命名为Stenotrophomonas geniculate DMC-X3；(B)为MC-LR 降解菌DMC-X3的平板菌落形态，(C)为MC-LR降解菌DMC-X3的扫描电镜图。由(B)和(C)可知，菌株DMC-X3菌落呈黄色，不透明，边缘光滑；细胞呈杆状，长约1.0-2.0μm，直径约0.20-0.30μm。

图3为不同浓度的菌株DMC-X3对MC-LR的降解率。随着初始菌液浓度增加，菌株DMC-X3对MC-LR的降解效率提高。

图4为菌株DMC-X3对不同浓度MC-LR的降解率。菌株DMC-X3能高效降解低浓度和高浓度的MC-LR。

图5为不同pH值对菌株DMC-X3降解MC-LR的影响。DMC-X3的最适MC-LR 降解pH值为7。

图6为不同温度对菌株DMC-X3降解MC-LR的影响。DMC-X3的最适MC-LR 降解温度为30℃。

图7为DMC-X3固定化菌剂小球的表观效果图以及对MC-LR降解的影响。其中， (A)、(B)为DMC-X3固定化菌剂小球的表观效果图，(A)为不风干状态的固定化小球，(B)为在30℃环境中风干的固定化小球；(C)为投放不同个数的固定化小球对MC-LR降解的影响。菌剂小球对MC-LR的降解率仅稍弱于同剂量下的游离菌的降解率。

图8为固定化菌剂循环利用能力检测的结果图。使用三次后的小球仍具有较好的MC-LR降解能力，说明该菌剂具有良好的循环利用能力。

保藏信息

分类命名：寡养单胞菌

拉丁文学名：Pseudomonas geniculata

保藏单位名称：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)

保藏单位地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼

保藏日期：2022年7月4日

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

一、菌株的分离筛选与鉴定

(1)取福建省漳州市南靖县南一水库爆发蓝藻水华的表层水体样品，以MSM 无机盐液体培养基(MgSO

(2)根据菌落形态、大小、颜色等差异，挑取不同菌落分别接种于20mL MSM 无机盐液体培养基中(MC-LR终浓度为200μg/L)，置于摇床内(30℃,150rpm)，避光培养至培养基浑浊；

(3)将培养物重新划线于LB固体平板(酵母粉5g/L,胰蛋白胨10g/L,NaCl 10 g/L,琼脂粉15g/L)，30℃下避光培养2-3d；

(4)重复步骤(3)多次，直至得到纯培养物；

(5)将纯化后的单菌落接种于20mL MC-LR终浓度为200μg/L的MSM液体培养基中，置于30℃摇床，150rpm震荡培养8天，以未接种单菌的MSM-MC-LR为空白对照；每隔1天取培养液，测定其600nm波长的吸光值，同时用微囊藻毒素检测试剂盒检测MC-LR的浓度，分别根据MC-LR浓度和OD

(6)由图1可知，分离到一株具有良好MC-LR降解能力的菌株DMC-X3，该菌株在含有在MC-LR的MSM液体培养基中缓慢生长，第8天到达生长稳定期，此时OD

(7)MC-LR降解菌DMC-X3形态特征见图2中(B)、(C)。对菌株DMC-X3 进行基因组提取并进行16S rRNA基因扩增，PCR产物送至厦门铂瑞生物科技测序，序列去引物后上传至韩国EzBioCloud网站(https://www.ezbiocloud.net/)进行比对分析，采用MEGA7.0软件的Neighbor-Joining法构建系统发育树，结果见图2中(A)。经比对鉴定，菌株DMC-X3与Stenotrophomonas geniculata的相似率高达100％，因此菌株DMC-X3属于寡养单胞菌属，命名为Stenotrophomonas geniculate DMC-X3，其16S rRNA序列上传至NCBI数据库，GenBank登录号为ON999189。

二、菌株DMC-X3降解特性的研究

1、不同浓度DMC-X3对MC-LR的降解

将菌株DMC-X3接种于LB液体培养基中，在30℃，150rpm恒温摇床中避光培养36h，经6000rpm高速离心6min后收集菌体沉淀，用MSM无机盐液体培养基洗涤3次后加入适量MSM无机盐培养基制备成一定浓度的菌悬液，备用。

将DMC-X3菌悬液分别以3×10

降解率(％)＝(C

其中C

由图3可知，DMC-X3对MC-LR的降解效果存在浓度梯度效应，随着菌液浓度的升高，降解效果增强。24h时，3×10

水体中的细菌总数常作为评价水体污染程度的一个重要指标，在利用MC-LR降解菌进行大规模水体净化时，菌株接种量过高会对环境水体造成一定的污染，与其他寡养单胞菌相比(表1)，本发明所使用的DMC-X3在接种量低的情况下仍能高效降解MC-LR，具有一定的优势。

表1 DMC-X3与其他寡养单胞菌的降解能力比较

表1中各菌株的文献来源如下：

1.Yang,F.,Zhou,Y.L.,Yin,L.H.,et al.Microcystin-degrading activity ofan indigenous bacterial strain Stenotrophomonas acidaminiphila MC-LTH2isolated from Lake Taihu.Plos One,2014,9(1):e86216. http://doi.org/10.1371/journal.pone.0086216.

2.Idroos,E.S.,De Silva,B.,Manage,P.M.Biodegradation of microcystinanalogues by Stenotrophomonas maltophilia isolated from Beira Lake SriLanka.Journal of the National Science Foundation of Sri Lanka,2017,45(2):91-99.http://doi.org/10.4038/jnsfsr.v45i2.8175.

3.Krishnan,A.,Zhang,Y.Q.,Mou,X.Z.Isolation and characterization ofmicrocystin-degrading bacteria from Lake Erie.Bulletin of EnvironmentalContamination and Toxicology,2018,101 (5):617-623.http://doi.org/10.1007/s00128-018-2468-4.

2、DMC-X3对不同浓度MC-LR的降解

将DMC-X3菌悬液分别接种至含有200、400、800、1000μg/L MC-LR的MSM 无机盐液体培养基中，菌株的接种剂量均为1.7×10

3、pH值和温度对DMC-X3降解MC-LR的影响

用HCl和NaOH分别调节MSM无机盐液体培养基的pH值为5、6、7、8、9。将DMC-X3菌悬液分别接种至上述不同pH值的含有200μg/L MC-LR的MSM无机盐液体培养基中，使其初始浓度为1.7×10

(1)将DMC-X3菌悬液接种至含有200μg/L MC-LR的MSM无机盐液体培养基中，使其初始浓度为1.7×10

三、固定化菌剂的制备及其MC-LR降解能力的检测

(1)菌悬液的制备：将菌株Stenotrophomonas geniculate DMC-X3接种于20mLMSM无机盐液体培养基中，以200μg/L的MC-LR为唯一碳氮源，置于摇床内(30℃ 150rpm)，避光培养至菌株生长处于稳定期。取稳定期菌液10mL，6000rpm离心6 min，弃上清，用MSM无机盐液体培养基进行重悬后获得DMC-X3菌悬液；

(2)海藻酸钠(SA)溶液的配制：称取2g海藻酸钠，将其溶于98mL蒸馏水中，使用磁力搅拌器加热搅拌至溶解，获得质量分数为2％的海藻酸钠溶液，高温高压灭菌后备用；

(3)CaCl

(4)固定化菌剂的制备：将2mL 2％的海藻酸钠溶液等量DMC-X3菌悬液混合，充分混匀后得到SA-DMC-X3混合液，备用。使用无菌注射器吸取SA-DMC-X3混合液从高处逐滴滴至装有50mL交联剂2％ CaCl

(5)固定化交联后，从4℃冰箱中取出烧杯，用无菌水多次清洗菌剂小球；

(6)将菌剂小球放在25-30℃环境中风干，室温储存备用；

(7)分别将2、4、6、8、20个DMC-X3菌剂小球加入到含有200μg/L MC-LR 的20mL的MSM无机盐培养基中，对应的的游离菌量分别为2.5×10

(8)如图7和表2所示，24h内，分别投放2个、4个、6个、8个和20个DMC-X3 菌剂小球的处理组对MC-LR的降解率分别为53.10％、64.84％、71.51％、78.42％和 87.92％，而对应游离菌的降解率则分别为56.61％、69.31％、76.12％、82.13％和90.31％，说明不同投放数量的固定化菌剂小球对MC-LR都具有高效降解能力，其降解率仅稍弱于同剂量下的游离菌的降解率，并且投放固定化菌剂小球数量越多，对MC-LR降解效果越好。随着处理时间的延长，在48h后，投放6个、8个和20个DMC-X3菌剂小球的处理组与游离菌的降解率无显著差异，均达到90％以上，分别为90.01％、 91.96％和96.29％。说明DMC-X3固定化菌剂小球具有高效降解MC-LR的能力，这有利于降解菌DMC-X3的保存和现场应用。

表2.MC-LR降解率比较

四、固定化菌剂的循环利用能力检测

(1)固定化菌剂的第一次使用：取制备好的固定化菌剂小球20个(每个菌剂小球包埋5.0×10

(2)固定化菌剂的第二次使用：将步骤(1)中所使用的固定化菌剂小球和空白小球从培养液中取出，使用无菌水清洗三次后将小球放在室温(25-30℃)中风干。风干后的固定化小球室温贮存3d后进行第二次MC-LR降解实验，具体步骤参考上述步骤(1)。从图8中(B)可知，固定化小球在第二次重复使用时，24h对MC-LR 的降解率为66.93％，48h对MC-LR的降解率为93.12％。

(3)固定化菌剂的第三次使用：将步骤(2)中所使用的固定化菌剂小球和空白小球从培养基中取出，使用无菌水清洗三次后将小球放在室温(25-30℃)中风干。风干后的固定化小球室温下贮存5d后进行第二次MC-LR降解实验，具体步骤参考 (1)。从图8中(C)可知，固定化小球在第三次重复使用时，24h对MC-LR的降解能力显著降低，降解率仅为55.35％，但48h后固定化菌剂小球对MC-LR仍然保持较高的降解能力，降解率为83.06％。

综上所述，以海藻酸钠为材料包埋MC-LR降解菌DMC-X3所形成的固定化菌剂在重复使用三次后仍保持较好的MC-LR降解能力，说明该菌剂有望用于大规模的污水处理。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。