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1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油酯组合物及其制备方法

文献发布时间：2023-06-19 18:34:06

技术领域

本发明涉及功能性油脂制备及生物酶技术领域，尤其涉及一种1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油酯组合物及其制备方法。

背景技术

母乳是6月龄以下的婴幼儿的最佳食物，母乳为婴幼儿提供足够的能量和合适的营养素。脂肪是母乳中的重要成分，尽管只占母乳质量的3-5％，但是脂肪提供了母乳50％以上的能量。母乳中的脂肪主要以甘油三酯的形式存在(98％以上)，其中OPO是母乳脂肪中最主要的甘油三酯成分。母乳甘油三酯中的脂肪酸组成和分布较为特殊，主要是棕榈酸、油酸和亚油酸，其中70％以上的棕榈酸位于sn-2位，这与自然界植物油的脂肪酸分布恰好相反。Sn-2位的棕榈酸对于婴幼儿的生长发育具有重要的意义，它有助于婴幼儿吸收营养素，且可避免便秘。因此，向配方奶粉中添加OPO，提高sn-2位棕榈酸的含量，有利于婴儿的健康成长。

生物酶法制备OPO反应条件温和、过程绿色、副产物少，具有很大的前景。但目前大规模生产所采用的脂肪酶主要为Lipozyme RM IM脂肪酶(诺维信)等商业化脂肪酶，价格较高，导致生产成本高。针对上述问题，一些研究者提出了采用常见脂肪酶进行生产的技术，如专利CN109251943A提出了采用米曲霉脂肪酶、黑曲霉脂肪酶、米黑毛霉菌脂肪酶、洋葱假单胞菌脂肪酶、嗜热栖热菌脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶、皱褶假丝酵母脂肪酶或猪胰脂肪酶进行催化反应的技术，但其一者需要对脂肪酶进行较为复杂的修饰，二者需要在超临界条件进行反应，制备成本依然较高。又如专利CN111647593A采用氯化钙溶液固定化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶，用以进行催化反应，然而，该技术在反应过程中即引入了正己烷溶剂，而正己烷影响了该脂肪酶的活性，因此，正己烷的使用影响了脂肪酶的循环使用性能(需要提及一点是，反应产物中引入正己烷是提取分离过程，不涉及到脂肪酶的使用性能)。又如专利CN108913725A采用磁性纳米管固定化脂肪酶进行催化反应，但一者碳纳米管的成本较高，二者其在反应前需要进行电子辐照处理，也成本较高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油酯组合物及其制备方法，其可提升成品中OPO的含量，且成本较低。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油酯组合物的制备方法，其包括：

(1)将油酸、三棕榈酸甘油酯、固定化脂肪酶混合，在50-80℃反应3-15h，得到酸解反应产物；

(2)将酸解反应产物中的固定化脂肪酶分离；

(3)将步骤(2)得到的酸解反应产物中的游离脂肪酸脱除，得到1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油酯组合物；

其中，所述固定化酶的固定载体选用大孔树脂和/或介孔材料，所述大孔树脂选用ADS-17、DA-201、D3520中的一种或多种；

所述固定化酶的酶选用疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶和/或米赫根毛霉脂肪酶。

作为上述技术方案的改进，所述固定载体选用大孔树脂，所述固定化脂肪酶的制备方法包括：将脂肪酶、大孔树脂加入pH为4-5.5的磷酸缓冲溶液中，在10-50℃下水浴震荡固定0.1-5h，过滤，在20-40℃、真空度为-0.2--0.05MPa下真空干燥1-10h，即得到固定化脂肪酶。

作为上述技术方案的改进，所述固定载体选用有机功能基团修饰的SBA-15；

所述有机功能基团选用正十八烷基、3-(异丁烯酰氧)丙基、苯胺甲基、苯基、正丁基、3-氨丙基、N-氨乙基-γ-氨丙基、异氰酸丙基、3-脲丙基、3-巯丙基中的一种或多种。

作为上述技术方案的改进，所述有机功能基团选用正十八烷基、3-(异丁烯酰氧)丙基、苯胺甲基、苯基中的一种或多种。

作为上述技术方案的改进，所述固定化脂肪酶的制备方法包括：将脂肪酶、介孔材料加入pH为4-5.5的磷酸缓冲溶液中，在10-50℃下水浴搅拌条件下固定0.1-5h，过滤，在20-40℃、真空度为-0.2--0.05MPa下真空干燥1-10h，即得到固定化脂肪酶。

作为上述技术方案的改进，所述有机功能基团修饰的SBA-15的制备方法包括：

(i)将SBA-15分散于分散剂中，加入含有有机功能基团的硅烷偶联剂，在90-100℃下冷凝回流，并在氮气或惰性气体保护下反应4-10h，得到反应产物；

(ii)除去所述反应产物中的分散剂，采用清洗溶剂清洗，干燥，即得到有机功能基团修饰的SBA-15；

其中，所述分散剂选用甲苯；所述清洗溶剂选用乙醇和/或乙醚；

硅烷偶联剂的摩尔量与SBA-15的重量之比为3-8mmol：1g。

作为上述技术方案的改进，步骤(ii)中，将所述反应产物离心，除去分散剂，然后采用乙醇、乙醚各洗涤2-5次，最后在60-90℃下真空干燥2-8h，即得到有机功能基团修饰的SBA-15。

作为上述技术方案的改进，步骤(1)中，所述三棕榈酸甘油酯与所述油酸的摩尔比为1：(6-14)，所述固定化脂肪酶的加入量为所述油酸、三棕榈酸甘油酯总重量的6-12％。

作为上述技术方案的改进，步骤(3)包括：

(3.1)向所述中间物中加入正己烷、氢氧化钾-乙醇水溶液；

(3.2)离心分层后取上层正己烷相，然后除去正己烷，即得到1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油酯组合物成品；

其中，正己烷的加入量与所述中间物之比为8-15mL:1g，氢氧化钾-乙醇水溶液的加入量为所述中间物中游离脂肪酸的1-1.5N。

实施本发明，具有如下有益效果：

本发明的1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油酯组合物的制备方法，采用油酸、三棕榈酸甘油酯、固定化脂肪酶在50-80℃下酸解反应，其中，固定化酶的固定载体选用大孔树脂和/或介孔材料，大孔树脂选用ADS-17、DA-201、D3520中的一种或多种；固定化酶的酶选用疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶和/或米赫根毛霉脂肪酶。基于这种固定脂肪酶，可有效提升组合物中OPO的含量，降低PPP的含量。同时，本发明的制备方法，反应条件温和，过程绿色。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施方式对本发明作进一步地详细描述。

本发明提供了一种1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油酯组合物的制备方法，其包括以下步骤：

(1)将油酸、三棕榈酸甘油酯(PPP)、固定化脂肪酶混合，在50-80℃反应3-15h，得到酸解反应产物；

其中，固定化脂肪酶的固定载体选用大孔树脂和/或介孔材料(孔径为6-13nm)，具体的，大孔树脂选用ADS-17、DA-201、D3520中的一种或多种，固定化酶的酶选用疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(TLL)和/或米赫根毛霉脂肪酶(RML)。基于上述固定化载体、脂肪酶所得到的固定化脂肪酶，其制备得到的产物中，1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油酯(OPO)的含量≥30wt％，残余三棕榈酸甘油酯(PPP)的含量≤12wt％。

其中，所述三棕榈酸甘油酯与所述油酸的摩尔比为1：(6-14)，示例性的为1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12或1:14，但不限于此。固定化脂肪酶的加入量为油酸、三棕榈酸甘油酯总重量的6-12％，当固定化脂肪酶的加入量＜6％时，反应效率过低；当固定化脂肪酶＞12％时，反应效率的提高程度基本无变化。示例性的，固定化脂肪酶的加入量为7％、8％、9％、10％或11％，但不限于此。

其中，酸解反应温度为50-80℃，示例性的为50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或75℃，但不限于此。酸解反应的时间为3-15h，示例性的为3.5h、5.5h、7.5h、9.5h、11.5h或13.5h，但不限于此。

其中，在本发明的一个实施例之中，固定化脂肪酶的制备方法为：

将脂肪酶、固定化载体加入pH为4-5.5的磷酸缓冲溶液中，在10-50℃下混合固定0.1-5h，固液分离，干燥即得到固定化酶。

更具体的，在本发明的一个实施例之中，当固定化载体为大孔树脂时，固定化脂肪酶的制备方法为：将脂肪酶、大孔树脂加入pH为4-5.5的磷酸缓冲溶液中，在10-50℃下水浴震荡固定0.1-5h，过滤，在20-40℃、真空度为-0.2～-0.05MPa下真空干燥1-10h，即得到固定化脂肪酶。

更具体的，在本发明的另一个实施例之中，当固定化载体为介孔材料时，固定化脂肪酶的制备方法为：将脂肪酶、介孔材料加入pH为4-5.5的磷酸缓冲溶液中，在10-50℃下水浴搅拌条件下固定0.1-5h，过滤，在20-40℃、真空度为-0.2--0.05MPa下真空干燥1-10h，即得到固定化脂肪酶。

优选的，在本发明的一个实施例之中，大孔树脂选用ADS-17或D3520，采用该固定载体固定的脂肪酶，可进一步提升成品中OPO的含量(>40wt％)，降低PPP的含量(<6wt％)。

优选的，在本发明的一个实施例之中，固定化载体为介孔材料，基于这种材料，尤其是SBA-15，里面含有丰富的硅羟基，可以进行功能基团的修饰；此外，SBA-15的孔径通常在8nm左右，非常适于脂肪酶的负载。此外，需要说明的是，当采用介孔材料作为固定化载体后，可将反应温度降低至50-65℃(大孔树脂为55-80℃)。

更优选的，固定化载体为有机功能基团修饰的SBA-15，SBA-15具有良好的孔径、孔壁厚度和热稳定性，且具有丰富的活性硅羟基团，可作为活性点与其他功能有机分子反应，提升介孔材料的特性。具体的，有机功能基团选用正十八烷基、3-(异丁烯酰氧)丙基、苯胺甲基、苯基、正丁基、3-氨丙基、N-氨乙基-γ-氨丙基、异氰酸丙基、3-脲丙基、3-巯丙基中的一种或多种。基于上述有机功能基团改性后，提升了脂肪酶的固定化率，提升了反应效率，降低了反应温度，缩短了反应时间。同时也提升了成品中OPO的含量。此外，也提升了固定化脂肪酶的重复利用性。

进一步优选的，有机功能基团选用正十八烷基、3-(异丁烯酰氧)丙基、苯胺甲基、苯基中的一种或多种。基于上述功能基团，不仅可提升反应效率，提升反应成品中OPO的含量，降低残余PPP的含量，还可提升固定化脂肪酶在无溶剂反应体系中的稳定性。

具体的，有机功能基团修饰的SBA-15的制备方法包括：

(i)将SBA-15分散于分散剂中，加入含有有机功能基团的硅烷偶联剂，在90-100℃下冷凝回流，并在氮气或惰性气体保护下反应4-10h，得到反应产物；

其中，分散剂可选用甲苯，但不限于此。

其中，硅烷偶联剂是含有相应有机功能基团的硅烷偶联剂。如采用正十八烷基修饰SBA-15时，硅烷偶联剂可选用采用十八烷基三乙氧基硅烷；又如采用苯胺甲基修饰SBA-15时，硅烷偶联剂可选用苯胺甲基三乙氧基硅烷；又如采用3-(异丁烯酰氧)丙基修饰SBA-15时，硅烷偶联剂可选用3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷。具体的，硅烷偶联剂的摩尔量与SBA-15的重量之比为3-8mmol：1g。示例性的为4mmol：1g、5mmol：1g、6mmol：1g或7mmol：1g，但不限于此。

其中，保护气氛可为氮气、惰性气体(如氩气、氦气等)。

(ii)除去反应产物中的分散剂，采用清洗溶剂清洗，干燥，即得到有机功能基团修饰的SBA-15；

其中，在本发明的一个实施例之中，可将反应产物离心，以除去分散剂，但不限于此。

其中，清洗溶剂可选用乙醇和/或乙醚，但不限于此。优选的，在本发明的一个实施例之中，采用乙醇、乙醚各洗涤2-5次。

洗涤完成后，在60-90℃下真空干燥2-8h，即得到有机功能基团修饰的SBA-15。

(2)将酸解反应产物中的固定化脂肪酶分离；

具体的，可通过过滤、离心等方式将固定化脂肪酶分离，但不限于此。分离后的固定化脂肪酶可重复利用。

(3)将步骤(2)得到的酸解反应产物中的游离脂肪酸脱除，得到1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油酯组合物；

其中，在本发明的一个实施例之中，可通过碱炼脱除游离脂肪酸，具体的包括：

(3.1)向中间物中加入正己烷、氢氧化钾-乙醇水溶液；

其中，正己烷的加入量与所述中间物之比为8-15mL:1g，氢氧化钾-乙醇水溶液的加入量为所述中间物中游离脂肪酸的1-1.5N。

(3.2)离心分层后取上层正己烷相，除去正己烷，即得到1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油酯组合物成品；

下面以具体实施例进一步说明本发明：

实施例1