一种氨基酸的检测方法及检测用试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种生物样本中氨基酸的检测方法，同时还涉及用于检测生物样本中氨基酸的检测用试剂盒。

背景技术

氨基酸是生命体三大营养素之一，是组成酶和蛋白质的基本单元。作为核心营养物质和生命代谢参与者，体内游离氨基酸对生理功能和临床诊断具有重要意义。生物样本中的游离氨基酸检测是蛋白质科学、生物化学、食品科学、临床医学等领域中的重要工具和工作内容。例如，血浆和干血片样本中的氨基酸定量分析对于诊断遗传性代谢缺陷是不可缺少的。因此，不断提高生物样本中氨基酸分析的准确性和工作效率、降低检测成本，对于相关应用领域、特别是临床检测行业具有重要意义。

随着质谱技术的发展，目前色谱分离与质谱联用技术已成为主流的复杂样品中氨基酸的检测方法，包括气相色谱-质谱联用和液相色谱-电喷雾质谱联用检测法。但是，色谱-质谱联用的设备往往复杂昂贵，使用维护难度高，条件优化苛刻，对操作人员的专业性也有较高要求。更重要的是，由于色谱分离流程的存在，增加了分析时间，降低了分析通量，使得氨基酸分析的成本显著提升。在临床质谱领域，基质辅助激光解吸离子化质谱(MALDIMS)是一种高通量、自动化的质谱方法，具有灵敏度高、稳定性好、实验周期短、操作简单、样品和人力消耗少的优点，对于临床指标的检测具有极高潜在价值。但MALDI MS用于复杂样本(如血液)中的氨基酸的检测存在三个重要的问题。第一，MALDI MS分析时需在检测样本中加入辅助离子化的基质分子，传统的基质分子会在低分子量区域产生一系列高灵敏度信号，从而显著压制同样处于该分子量区域的氨基酸分子信号，降低氨基酸检测的灵敏度和特异性；二，由于氨基酸作为小分子物质，结构中可供离子化的位点较少，因此相比大分子物质其离子化效率较低；三，复杂样本中在氨基酸所处分子量范围内，往往存在其他代谢小分子或盐类，由于MALDI MS一般不与色谱联用，这些干扰物的存在会抑制氨基酸的离子化和质谱信号，降低分析灵敏度。

为了解决氨基酸的MALDI MS检测中存在的上述问题，一个可行的方案是对氨基酸进行特异性的化学衍生。即通过在氨基酸上引入一个易于离子化的大分子量标签结构，以提升氨基酸的离子化效率，并将氨基酸的质谱信号从低分子量范围转换到较高分子量的信号区域，从而避免低分子量范围的基质和其他小分子对氨基酸质谱信号的干扰，提升氨基酸检测的灵敏度和特异性。但是目前能够同时满足上述要求(大分子量、易于离子化、衍生反应温和简单快速)、且适用于MALDI MS分析的化学衍生候选分子极少。

专利文献CN1463291A公开了一种检测多种生物分子相对量的方法，包括用A-R亲和标记物与样品接触，得到亲和标记产物，通过捕获试剂将亲和标记产物固定在基质上，确定标记产物的量。在该方法中A-R亲和标记产物作为捕获试剂捕获样品，还包括捕获试剂捕获亲和标记产物以及使亲和标记产物解吸并电离的步骤。该方法操作步骤多且耗时，需要特定的捕获试剂和多次洗涤步骤，在实际应用中，不适合用于分析氨基酸这样的小分子。

因此，生物样本中氨基酸的检测准确性和效率依然是一个需要解决的重要问题。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种氨基酸的检测方法，可以检测各种生物样本中的氨基酸，方法准确、操作简便，且灵敏度高。

本发明还提供了一种用于氨基酸检测的试剂盒。

为解决上述技术问题，第一方面，本发明提供了一种氨基酸的检测方法，包括步骤：

采用羧基末端长链聚合物-生物素偶联物为衍生化试剂，对生物样本中的氨基酸组分进行衍生化处理，使所述生物样本中的氨基酸组分形成氨基酸衍生物；

其中，采用的衍生化试剂羧基末端长链聚合物-生物素偶联物为式Ⅰ或式Ⅱ所示的化合物，或者为式Ⅰ或式Ⅱ所示化合物的末端羧基进一步被琥珀酰亚胺或琥珀酰亚胺类似物活化的化合物：

式Ⅰ中，m取2～6的整数；

式Ⅱ中，n取20～30的整数。

本发明采用的衍生化试剂羧基末端长链聚合物-生物素偶联物(Biotin-Polymer-COOH，简称BPC)，分子的一端为羧基，另一端为生物素，羧基与生物素之间为聚合物间隔基。优选地，在所述BPC的羧基端预先采用琥珀酰亚胺(NHS)或NHS类似物(如“磺酸化NHS”)进行活化。

所述BPC的分子量可根据需要通过改变分子聚合物链长而变化，即通过对所述结构式中的m或n取值进行选择，以选择特定分子质量的“羧基末端长链聚合物-生物素偶联物”(BPC)为衍生化试剂，采用其对氨基酸组分进行衍生化处理。优选地，所述BPC的分子量范围为100～3000Da。

采用BPC为衍生化试剂对氨基酸组分进行衍生化处理时，BPC可以通过活化的羧基与氨基酸上的氨基反应，在氨基酸上偶联形成一个大分子量的结构标签。从而在使用MALDIMS进行检测时，可以将氨基酸的质谱信号从低分子量范围(m/z 50-250)提升到所需要的分子量范围。其中，所需要的分子量范围可根据检测时所用基质或样本类型、存在的干扰物等因素进行确定。同时，由于生物素结构和聚合物链结构中均存在大量易于离子化的结构位点，因此衍生化处理后的氨基酸非常容易在质谱中形成[M+H]

作为本发明一种优选的实施方案，本发明主要用于检测生物样本中的游离氨基酸组分，通过对游离氨基酸的衍生化处理，使所述生物样本中的游离氨基酸组分形成氨基酸衍生物，之后对其进行检测。

作为本发明一种优选的实施方案，所述羧基末端长链聚合物-生物素偶联物为式Ⅲ或式Ⅳ所示的化合物：

式Ⅲ中，m取2～6的整数；

式Ⅳ中，n取20～30的整数。

作为本发明一种优选的实施方案，所述羧基末端长链聚合物-生物素偶联物的分子量范围为100～3000Da。

作为本发明一种优选的实施方案，所述式III所示化合物选自N-[6-(生物素氨基)己酰基]-6-氨基己酸N-琥珀酰亚胺酯(Biotin-2AH-NHS，简称B2AN)。

其中，N-[6-(生物素氨基)己酰基]-6-氨基己酸N-琥珀酰亚胺酯(B2AN)的结构式为：

采用N-[6-(生物素氨基)己酰基]-6-氨基己酸N-琥珀酰亚胺酯为衍生化试剂，氨基酸通过与该分子衍生，能够将分子量提升约452，这样氨基酸的质谱信号主要出现在m/z500-700区间，不会受到MALDI基质分子信号的干扰(小分子基质的信号干扰主要出现在m/z100-400范围)。同时，由于B2AN结构中具有大量极性基团和易于离子化的位点，相比未衍生的氨基酸分子，衍生后的分子结构更易于离子化，提升了离子化效率和质谱检测灵敏度。因此，也使得复杂样本中的氨基酸能够在不做预先纯化分离的条件下直接被检测到。

作为本发明一种优选的实施方案，所述式Ⅳ所示化合物选自NHS活化的羧基聚24乙二醇-生物素偶联物(Biotin-PEG24-NHS，简称BP24N)。

其中，NHS活化的羧基聚24乙二醇-生物素偶联物(BP24N)的结构式为：

采用NHS活化的羧基聚24乙二醇-生物素偶联物为衍生化试剂，氨基酸通过与该分子衍生，能够将分子量提升约1375，这样氨基酸的质谱信号主要出现在m/z 1400-1700区间，不仅不会受到MALDI基质分子信号的干扰(小分子基质的信号干扰主要出现在m/z 100-400范围)，也不易受到样本基质中其他常见的高丰度小分子物质(如磷脂)的干扰，检测准确性显著提高。同样，由于BP24N结构中具有大量极性基团和易于离子化的位点，相比未衍生的氨基酸分子，衍生后的分子结构更易于离子化，提升了离子化效率和质谱检测灵敏度。

作为本发明一种优选的实施方案，衍生化处理时，先将衍生化试剂配制出溶液形式进行使用，配制溶液中所述衍生化试剂的浓度为0.1mM～100mM。

优选地，衍生化处理时反应温度为20℃～40℃。反应时间优选为5min～120min。

作为本发明一种优选的实施方案，所述检测方法还包括步骤：使用MALDI MS对所述氨基酸衍生物进行检测。

进一步地，本发明所述的检测方法还包括步骤：在衍生化处理前，对生物样本进行纯化处理，优选为去除大分子蛋白质的纯化处理。经纯化处理可以减少干扰物质，进一步提高检测的准确性。当然，生物样本也可以直接进行衍生化处理，而不用经过去除大分子蛋白质的纯化处理。

优选地，去除或降低样本中高丰度蛋白质、盐类等干扰MALDI MS检测的物质的方法，包括有机溶剂沉淀法、强酸或超速过滤离心法等。

其中，有机溶剂沉淀法可以采用甲醇或乙腈等有机溶剂去除血浆样品中的蛋白质。

在一个具体实施方案中，去除大分子蛋白质采用的方法为甲醇沉淀蛋白法。

一种具体的操作步骤包括：取生物样品，加入甲醇充分涡旋震荡沉淀蛋白质，之后离心分离，取上清。

在一个具体实施方案中，去除大分子蛋白质采用的方法为超速过滤离心法。

一种具体的操作步骤包括：取生物样品，加入MES缓冲溶液混合均匀，将混合液加入超滤离心管中进行离心过滤处理(10000g/20min)，除去样本中的高分子量蛋白质，将超滤管下层中的血浆超滤液收集。

进一步地，本发明所述的检测方法还包括步骤：在衍生化处理后，对生物样本进行纯化或除盐处理。当然，衍生化处理后的样本也可以不做任何处理直接使用MALDI MS进行检测。

作为本发明一种优选的实施方案，所述检测采用内标法进行定量检测，采用的内标物为同位素标记的氨基酸。

在一些实施方式中，采用的内标物为同位素标记的氨基酸。内标物的标记同位素可以选自诸如

通常，同位素标记的氨基酸中包含的重同位素含有一个以上重同位素。可以优选掺入更高数目的重同位素，因为它提供更大的质量迁移。该重同位素标记的化合物为本领域公知，且可从多个厂家获得。

检测过程中，检测流程按照内标法流程进行。

在一些实施方式中，同位素标记的氨基酸即内标物在衍生反应之前加入生物样本或标准品溶液中。所述内标物一方面有助于定量分析样品中的氨基酸，另一方面可以校准或纠正由于实验过程中目标物的损失或干扰物的基质效应导致的结果不准确。

在一些实施方式中，根据氨基酸标准品和内标的MS信噪比比值和所添加氨基酸的浓度，绘制得到标准曲线，计算出所述生物样本中所述氨基酸的浓度。

在一些实施方式中，检测时通过MALDI-MS对氨基酸衍生物进行分析，例如可以使用SHIMADZU AXIMA RESONANCE MALDI-IT-TOF质谱仪，在反射模式下进行鉴定。MALDI质谱是在激光强度为100～120的阳离子模式下累积并平均化400次射击(shots)得到。使用Shimadzu Biotech Launchpad软件(2.9版本)进行谱图采集和处理，也可使用其它市售的MALDI-MS质谱仪，本公开对此不作限制。

第二方面，本发明还提供了一种用于所述检测方法的氨基酸检测用试剂盒，包括所述的羧基末端长链聚合物-生物素偶联物衍生化试剂。

作为本发明一种优选的实施方案，所述试剂盒还包括i)～iii)组分中的至少一种：

i)从生物样本中进行氨基酸提取和/或纯化所需试剂及耗材；

ii)质谱检测所用的试剂及耗材；

iii)同位素标记的所述氨基酸以及用于定量检测的氨基酸标准品。

第三方面，本发明还提供了所述的检测方法以及所述的试剂盒在检测含氨基酸的生物样本中氨基酸组分含量中的应用，特别是检测生物样本中游离氨基酸组分含量中的应用。

作为本发明一种优选的实施方案，所述含氨基酸的生物样本为氨基酸溶液、干血片、血液、血清、血浆、尿液、唾液、组织液中的任一种。优选所述生物样本为血液类样本。所述血液类样本包括干血片、血液、血清或血浆。

在一些实施方式中，所述生物样本为干血片样本。干血片为包括血细胞在内的全血类型样本。

本发明可以检测的氨基酸为任一种氨基酸，例如可以是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸(蛋氨酸)、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、硒半胱氨酸和吡咯赖氨酸。

本发明提供的氨基酸的检测方法，具有以下有益效果：

1)可彻底解决采用MALDI MS进行氨基酸检测中存在的主要问题。已有的氨基酸衍生方法多为针对色谱、光谱或GC-MS、LC-MS等技术开发，不能针对性地解决氨基酸MALDI MS检测中的问题。本发明提供的氨基酸衍生方法可针对性的解决MALDI MS检测中存在的基质和背景干扰、氨基酸离子化效率低等问题，只需采用最经典的MALDI MS流程和通用的MALDI基质就可实现复杂样本中的氨基酸直接检测，无需对基质进行额外修饰，也无需采用捕获试剂捕获所述衍生化试剂和/或样品，反应时间短，操作步骤少，避免了多次洗涤造成的样本损失或稀释，具有极高的实用潜力。

2)样品制备简单明了、方法简便、仪器运行时间短且自动化程度高。已有的GC-MS和LC-MS方法需要复杂的方法建立、优化与验证过程，需要强大的色谱与质谱背景知识和专业操作人员，而许多需要测定生物样品中氨基酸的临床机构不具有这样的条件。本发明提供的方法将BPC衍生化与MALDI MS相结合，提高了电离效率，MALDI-MS检测的灵敏度得到提升。且无需任何色谱分离或富集过程，操作时间短，容易实现高通量地检测生物样品。

3)可根据需要选择合适分子量的BPC作为衍生试剂。由于不同样本中对氨基酸检测产生干扰的背景基质不同，能够通过调整BPC中聚合物间隔基的数量改变氨基酸衍生物的分子量，从而将目标信号调整到特定的背景干扰较小的分子量区域。因此这类衍生试剂由于其结构上的灵活性，可适用于不同的样本类型。

本发明基于BPC衍生化的MALDI-MS方法首次用于复杂生物样品中氨基酸的定性和定量检测，特异性高、方法准确、操作简便，且灵敏度高。经实验，结果表明，本发明方法可用于临床上测定复杂生物样品中的氨基酸。

附图说明

图1是本发明实施例2中赖氨酸标准品经过B2AN衍生后用MALDI MS检测的质谱信号谱图；

图2是本发明实施例2中精氨酸标准品经过B2AN衍生后用MALDI MS检测的质谱信号谱图；

图3是本发明实施例3中血浆样本的检测质谱图；

图4是本发明实施例4中干血片样品的检测质谱图；

图5是本发明实施例5中干血片样品的检测质谱图；

图6是本发明实施例6中不同氨基酸的定量标准曲线图；

图7是本发明实施例7中血浆样本分别用B2AN衍生与不采取衍生两种处理的检测质谱图；

图8是本发明实施例8中采用三种不同分子量的BPC分子衍生血浆样品后的检测质谱图。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。

本发明在以下实施例中，以N-[6-(生物素氨基)己酰基]-6-氨基己酸N-琥珀酰亚胺酯(B2AN)或NHS活化的羧基聚24乙二醇-生物素偶联物(BP24N)为衍生化试剂，对几种生物样本中的氨基酸组分含量进行了检测。检测方法采用内标法进行定量检测，采用的内标物为同位素标记的氨基酸。

首先对生物样本中的氨基酸进行衍生化处理，得到氨基酸衍生物；在对生物样本中的氨基酸进行衍生化处理时，采用的衍生化试剂的浓度为0.1mM～100mM；衍生化处理的反应温度为20℃～40℃；

之后使用MALDI MS对氨基酸衍生物进行检测。

优选地，在衍生化处理前，对生物样本进行纯化处理，例如纯化处理包括去除大分子蛋白质的纯化处理。

优选地，在衍生化处理后，对衍生化后的生物样本进行纯化或除盐处理。

下面通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1

本实施例提供了一种血浆样本中游离氨基酸的检测方法，具体操作步骤为：

1)取30μL血浆样品，加入200μL甲醇充分涡旋震荡沉淀蛋白质，离心吸取上清置于新的ep管中，真空抽干。加入20μL的pH 8.0的MES缓冲溶液混合均匀，得到处理好的血浆样本。

将B2AN溶于乙腈/H

2)取18μL上述处理好的血浆样本以及空白MES缓冲溶液，分别加入2μL的B2AN溶液，在室温下反应30分钟。

3)分别取步骤2)反应完毕得到的反应液5μL，之后对反应液分别进行以下处理：

用乙腈/水/三氟乙酸(1：1：0.002，v/v/v)混合溶液稀释5倍；

取1.5μL的稀释液与1.5μL的2,5-二羟基苯甲酸溶液混合，制得检测样，其中2,5-二羟基苯甲酸溶液是2,5-二羟基苯甲酸的乙腈/水/三氟乙酸(1：1：0.002，v/v/v)溶液，浓度为10mg/mL；

吸取1.5μL的检测样，将检测样溶液点样到不锈钢靶板表面。通过MALDI-MS对氨基酸衍生物进行分析，使用SHIMADZU AXIMA RESONANCE MALDI-IT-TOF质谱仪，在反射模式下进行鉴定。

MALDI质谱是在激光强度为100-120的阳离子模式下累积并平均化400次shots得到。使用Shimadzu Biotech Launchpad软件(2.9版本)进行谱图采集和处理。

实施例2

本实施例考察了N-[6-(生物素氨基)己酰基]-6-氨基己酸N-琥珀酰亚胺酯(简称B2AN)衍生氨基酸标准品的可行性。分别以精氨酸(arginine)和赖氨酸(lysine)为例，步骤如下：

1)将精氨酸和赖氨酸标准品分别用pH 8.0的MES缓冲溶液配制成100μM的溶液。将B2AN溶于乙腈/H

2)分别取18μL的精氨酸和赖氨酸标准品溶液和空白MES缓冲溶液，分别加入2μL的B2AN溶液。之后在室温下反应30分钟。赖氨酸、精氨酸分别与B2AN的衍生化反应方程式如下：

赖氨酸和精氨酸的分子量分别为146.11和174.11，经过B2AN衍生后，被检测分子的分子量分别为598.35和626.36。因此，两种分子的质谱信号将出现在m/z 500以上的范围，在该范围内，被检测分子的信号将不会受到MALDI基质的背景信号的干扰(常用的MALDI基质如二羟基苯甲酸的背景信号干扰通常出现在m/z 100-400的范围内)。

3)分别取步骤2)反应所得的反应液5μL，用乙腈/水/三氟乙酸(1：1：0.002，v/v/v)混合溶液稀释5倍；

取1.5μL的稀释液与1.5μL的2,5-二羟基苯甲酸溶液混合，制得检测样，其中2,5-二羟基苯甲酸溶液是2,5-二羟基苯甲酸的乙腈/水/三氟乙酸(1：1：0.002，v/v/v)溶液，浓度为10mg/mL；

吸取1.5μL的检测样溶液点样到不锈钢靶板表面，通过MALDI-MS对氨基酸衍生物进行分析，使用SHIMADZU AXIMA RESONANCE MALDI-IT-TOF质谱仪，在反射模式下进行鉴定。MALDI质谱是在激光强度为100-120的阳离子模式下累积并平均化400次shots得到的。使用Shimadzu Biotech Launchpad软件(2.9版本)进行谱图采集和处理，分析结果如图1和图2所示。其中，图1为赖氨酸标准品经过B2AN衍生后用MALDI MS检测的质谱信号以及与空白样品的对照谱图，图2为精氨酸标准品经过B2AN衍生后用MALDI MS检测的质谱信号以及与空白样品的对照谱图。

图1和图2表明：MALDI MS能够高灵敏的检测到精氨酸和赖氨酸的B2AN衍生物信号，相反，空白样本在该信号区域并无明显干扰峰。这一结果说明，用B2AN衍生化处理氨基酸，并利用B2AN衍生物的信号来检测和定量氨基酸是可行的；通过B2AN衍生，能够将氨基酸的分子量提升到m/z 500以上的范围，该范围内基本没有基质信号的干扰，能够大大改善氨基酸检测的灵敏度和离子化效率，实现MALDI MS的高灵敏检测，在被检测区域内无基质背景信号的干扰，且检测过程无需进行复杂的色谱分离和纯化。

实施例3

本实施例提供了一种血浆样本中游离氨基酸的检测方法，采用B2AN进行衍生处理结合MALDI MS进行检测，具体操作步骤为：

1)取60μL血浆样品，加入等体积的pH 8.0的MES缓冲溶液混合均匀。将混合液加入3kd超滤离心管中进行离心过滤处理(10000g/20min)，以除去样本中的高分子量蛋白质。将超滤管下层中的血浆超滤液收集到新的EP管中。

将B2AN溶于乙腈/H

2)取18μL上述血浆超滤液和空白MES缓冲溶液，分别加2μL的B2AN溶液，室温下反应30分钟。

3)分别取步骤2)得到的反应液5μL，用乙腈/水/三氟乙酸(1：1：0.002，v/v/v)混合溶液稀释5倍；

取1.5μL的稀释液与1.5μL的2,5-二羟基苯甲酸溶液混合，制得检测样，其中2,5-二羟基苯甲酸溶液是2,5-二羟基苯甲酸的乙腈/水/三氟乙酸(1：1：0.002，v/v/v)溶液，浓度为10mg/mL；

吸取1.5μL的检测样溶液点样到不锈钢靶板表面，通过MALDI-MS对氨基酸衍生物进行分析，使用SHIMADZU AXIMA RESONANCE MALDI-IT-TOF质谱仪，在反射模式下进行鉴定。MALDI质谱是在激光强度为100-120的阳离子模式下累积并平均化400次shots得到的。使用Shimadzu Biotech Launchpad软件(2.9版本)进行谱图采集和处理，结果如图3所示。图3中(a)显示了经过超滤离心去除了高丰度蛋白质的血浆样本，经过B2AN衍生后、利用MALDI MS检测其中游离氨基酸的质谱图，图3中(b)为空白对照样本的质谱图。

由图3可知，血浆中不同种类的氨基酸分子多数以[M+H]

通过B2AN衍生化处理氨基酸，MALDI MS能够直接检测到血浆样本中不同种类的氨基酸信号，无需任何色谱分离或纯化过程，整个流程简单、快速。这一结果说明，用B2AN衍生化氨基酸，并利用B2AN衍生物的信号来检测复杂样本基质中的氨基酸成分是可行的。通过B2AN衍生，能够将氨基酸的分子量提升到m/z 500以上的范围，该范围内基本没有基质信号的干扰，能够大大改善氨基酸检测的灵敏度和离子化效率。

实施例4

本实施例提供了一种干血片样本中氨基酸的检测方法，具体操作步骤为：

1)通过打孔法将直径5mm的血片样本从干血片上分离下来，置于EP管中。向管中加入100μL甲醇，涡旋震荡10分钟，将甲醇清液取出置于一新的EP管中，真空抽干溶剂。同时制备相应的空白纸片样本。

B2AN溶于乙腈/H

2)向上述干血片提取物样品管中加入18μL pH为8.0的MES缓冲溶液，充分涡旋震荡后，加入2μL的B2AN溶液，混合均匀。室温下反应30分钟。

3)取步骤2)得到的反应混合液5μL，用乙腈/水/三氟乙酸(1：1：0.002，v/v/v)混合溶液稀释5倍；

取1.5μL的稀释液与1.5μL的2,5-二羟基苯甲酸溶液混合，制得检测样，其中2,5-二羟基苯甲酸溶液是2,5-二羟基苯甲酸的乙腈/水/三氟乙酸(1：1：0.002，v/v/v)溶液，浓度为10mg/mL；

吸取1.5μL检测样溶液点样到不锈钢靶板表面。通过MALDI-MS对氨基酸衍生物进行分析，使用SHIMADZU AXIMA RESONANCE MALDI-IT-TOF质谱仪，在反射模式下进行鉴定。MALDI质谱是在激光强度为100-120的阳离子模式下累积并平均化400次shots得到的。使用Shimadzu Biotech Launchpad软件(2.9版本)进行谱图采集和处理。结果如图4所示。图4中(a)显示了干血片样品经过甲醇提取后，用B2AN衍生、并通过MALDI MS检测其中游离氨基酸的质谱图，图4中(b)为空白对照样本的质谱图。

由图4可知，干血片不同种类的氨基酸分子多数以[M+H]

通过B2AN衍生化处理氨基酸，MALDI MS能够直接检测到干血片样本中不同种类的氨基酸信号，无需任何色谱分离或纯化过程，整个流程简单、快速。这一结果说明，用B2AN衍生氨基酸，并利用B2AN衍生物的信号来检测不同类型的复杂样本基质中的氨基酸成分是可行的，且信号的信噪比高，检测灵敏度好。

实施例5

为了考察不同分子量的羧基聚乙二醇-生物素偶联物(BPC)对氨基酸的衍生和检测效果，本实施例具体测试了NHS活化的羧基聚24乙二醇-生物素偶联物(BP24N)衍生和检测干血片样本中氨基酸的可行性，具体操作步骤为：

1)通过打孔法将直径5mm的血片样本从干血片上分离下来，置于EP管中，向管中加入100μL甲醇，涡旋震荡10分钟，将甲醇清液取出置于一新的EP管中，真空抽干溶剂。同时制备相应的空白纸片样本。

将BP24N溶于纯水中，BP24N的配制浓度为20mM。

2)向上述干血片提取物样品管中加入18μL的pH为8.0的MES缓冲溶液，充分涡旋震荡后，加入2μL BP24N溶液，混合均匀。室温下反应30分钟。

3)取步骤2)得到的反应液5μL，用乙腈/水/三氟乙酸(1：1：0.002，v/v/v)混合溶液稀释5倍；

取1.5μL的稀释液与1.5μL的2,5-二羟基苯甲酸溶液混合，制得检测样，其中2,5-二羟基苯甲酸溶液是2,5-二羟基苯甲酸的乙腈/水/三氟乙酸(1：1：0.002，v/v/v)溶液，浓度为10mg/mL；

吸取1.5μL的检测样溶液点样到不锈钢靶板表面。通过MALDI-MS对氨基酸衍生物进行分析，使用SHIMADZU AXIMA RESONANCE MALDI-IT-TOF质谱仪，在反射模式下进行鉴定。MALDI质谱是在激光强度为100-120的阳离子模式下累积并平均化400次shots得到的。使用Shimadzu Biotech Launchpad软件(2.9版本)进行谱图采集和处理，结果如图5所示。图5中(a)显示了干血片样品经过甲醇提取后，用NHS活化的羧基聚24乙二醇-生物素偶联物(BP24N)衍生、并通过MALDI MS检测其中游离氨基酸的质谱图，图5中(b)为空白对照样本的结果。

干血片不同种类的氨基酸分子多数以[M+K]

通过BP24N衍生化，MALDI MS能够直接检测到干血片样本中不同种类的氨基酸信号，无需任何色谱分离或纯化过程，整个流程简单、快速。这一结果也说明，不同分子量的羧基聚乙二醇-生物素偶联物(BPC)来衍生和检测复杂样本基质中的氨基酸成分是可行的。可以根据样本基质的类型、干扰物的分子量等因素，选择合适分子量的BPC来衍生氨基酸，使氨基酸的信号转换到一个干扰较少的分子量区间，以获得最好的检测灵敏度和特异性。

实施例6

本实施例考察了B2AN衍生结合MALDI MS检测用于定量分析样本中游离氨基酸的可行性及其标准曲线的测定，步骤如下：

1)用pH 8.0的MES缓冲溶液配制25μM的赖氨酸同位素内标溶液，该赖氨酸同位素内标含有六个

将B2AN溶于乙腈/H

2)取18μL上述氨基酸混标溶液分别加入2μL B2AN溶液，室温下反应30分钟。

3)取反应混合液5μL，用乙腈/水/三氟乙酸(1：1：0.002，v/v/v)混合溶液稀释5倍；

取1.5μL的稀释液与1.5μL的2,5-二羟基苯甲酸溶液混合，制得检测样，其中2,5-二羟基苯甲酸溶液是2,5-二羟基苯甲酸的乙腈/水/三氟乙酸(1：1：0.002，v/v/v)溶液，浓度为10mg/mL；

吸取1.5μL检测样溶液点样到不锈钢靶板表面，通过MALDI-MS对氨基酸衍生物进行分析，使用SHIMADZU AXIMA RESONANCE MALDI-IT-TOF质谱仪，在反射模式下进行鉴定。MALDI质谱是在激光强度为100-120的阳离子模式下累积并平均化400次shots得到的。使用Shimadzu Biotech Launchpad软件(2.9版本)进行谱图采集和处理。所有谱图利用赖氨酸同位素内标进行归一化处理，以氨基酸标准品浓度为横坐标，以氨基酸衍生物信号的质谱响应值为纵坐标，绘制氨基酸的定量标准曲线，结果如图6所示。图6显示了利用本发明所述方法对氨基酸进行定量分析的标准曲线，共测试了八种氨基酸的混合标准品溶液，并以赖氨酸的同位素标准品作为内标。该溶液含有不同种类的氨基酸标准品，包括甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸、脯氨酸、赖氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、精氨酸，每种氨基酸标准品的浓度略有差别，总体浓度范围处于0.1～80μM的范围。结果显示，通过B2AN和MALDI MS检测相结合，能够获得理想的氨基酸定量标准曲线，所有氨基酸标准曲线的R

实施例7

本实施例对比了采用BPC(以B2AN为衍生化试剂)衍生和无任何衍生两种处理条件下，用MALDI MS对血浆氨基酸进行检测的效果差异，具体操作步骤为：

1)取两支血浆样本，每支30μL血浆。分别向两支样本中加入200μL甲醇，以沉淀样本中的高分子量蛋白质。将混合液震荡混合2分钟，之后在10000g离心20min，将样品管中的上清液分别转移入两支新的EP管。之后真空抽干两支管中的溶剂。

将B2AN溶于乙腈/H

2)向上述两支样品管中加入18μL pH为8.0的MES缓冲溶液，充分涡旋震荡后，其中一支样品管中加入2μL的B2AN溶液，混合均匀。室温下反应30分钟。另一支样品管中加入2μL的空白水溶液。

3)取步骤2)得到的两种反应混合液各5μL，用乙腈/水/三氟乙酸(1：1：0.002，v/v/v)混合溶液稀释5倍；

取1.5μL的稀释液与1.5μL的2,5-二羟基苯甲酸溶液混合，制得检测样，其中2,5-二羟基苯甲酸溶液是2,5-二羟基苯甲酸的乙腈/水/三氟乙酸(1：1：0.002，v/v/v)溶液，浓度为10mg/mL；

吸取1.5μL的检测样溶液点样到不锈钢靶板表面，通过MALDI-MS对氨基酸衍生物进行分析，使用SHIMADZU AXIMA RESONANCE MALDI-IT-TOF质谱仪，在反射模式下进行鉴定。MALDI质谱是在激光强度为100-120的阳离子模式下累积并平均化400次shots得到的。使用Shimadzu Biotech Launchpad软件(2.9版本)进行谱图采集和处理，结果如图7所示。图7中(a)显示了经过B2AN衍生后、利用MALDI MS检测其中游离氨基酸的质谱图，图7中(b)为未经任何衍生，利用MALDI MS检测氨基酸对应分子量区域的质谱图(理论上未经衍生的氨基酸信号处于m/z50-300的范围)。

由图7可知，采用BPC衍生和MALDI MS检测能够稳定的获得高灵敏的血浆游离氨基酸信号；相反，在无衍生的情况下，同样的样本中无法用MALDI MS检测到任何可信的氨基酸信号，质谱中的主要信号来自基质分子(如DHB)等背景成分。

实施例8

本实施例对比了三种不同间隔基链长、具有不同分子量的BPC分子衍生血浆样品后，用MALDI MS对血浆氨基酸进行检测的效果，三种BPC分子为：N-[6-(生物素氨基)己酰基]-6-氨基己酸N-琥珀酰亚胺酯(简称B2AN，分子量567.7Da)、N-琥珀酰亚氨基6-生物素氨己酸(简称B1AN，分子量454.5Da)、和D-生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯(简称B0AN，分子量341.4Da)。具体操作步骤为：

1)取三支血浆样本，每支30μL血浆。分别向两支样本中加入200μL甲醇，以沉淀样本中的高分子量蛋白质。将混合液震荡混合2分钟，之后在10000g离心20min，将样品管中的上清液分别转移入三支新的EP管。之后真空抽干三支管中的溶剂。

将B2AN、B1AN、和B0AN分别溶于乙腈/H

2)向上述三支样品管中分别加入18μL pH为8.0的MES缓冲溶液，充分涡旋震荡后，三支样品管中分别加入2μL的B2AN、B1AN、和B0AN溶液，混合均匀。室温下反应30分钟。

3)取步骤2)得到的三种反应混合液各5μL，用乙腈/水/三氟乙酸(1：1：0.002，v/v/v)混合溶液稀释5倍；

取1.5μL的稀释液与1.5μL的2,5-二羟基苯甲酸溶液混合，制得检测样，其中2,5-二羟基苯甲酸溶液是2,5-二羟基苯甲酸的乙腈/水/三氟乙酸(1：1：0.002，v/v/v)溶液，浓度为10mg/mL；

吸取1.5μL的检测样溶液点样到不锈钢靶板表面，通过MALDI-MS对氨基酸衍生物进行分析，使用SHIMADZU AXIMA RESONANCE MALDI-IT-TOF质谱仪，在反射模式下进行鉴定。MALDI质谱是在激光强度为100-120的阳离子模式下累积并平均化400次shots得到的。使用Shimadzu Biotech Launchpad软件(2.9版本)进行谱图采集和处理，结果如图8所示。图8中(a)、(b)、和(c)分别显示了经过B2AN、B1AN和B0AN衍生后、利用MALDI MS检测其中游离氨基酸的质谱图。

由图8可知，采用不同分子量的BPC衍生均能够采集到一定的血浆游离氨基酸信号；但是，我们也发现随着BPC分子量的下降，能检测到的氨基酸信号显著减少，特别是分子量为341的B0AN，衍生后仅能检测到两三个信噪比较高的氨基酸信号。这是由于血浆样本在m/z 300-500的范围内存在较多的背景干扰信号，这些信号一方面来自血浆中存在的脂质、盐等高丰度物质，另一方面来自MALDI质谱基质的背景峰。由于B0AN衍生不能将氨基酸信号提升到更高的分子量范围，在这些强背景信号的干扰下，检测效果并不理想。这一结果说明，要获得理想的检测结果，氨基酸衍生试剂的分子量不能过小，衍生反应至少要能够将氨基酸的检测信号提升到m/z 500以上的范围(如B2AN)，才能实现较为可靠的高灵敏分析。过去已发展的各种氨基酸衍生试剂，分子量多在300Da以下，也不适用于复杂样本的MALDI MS检测。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。