一种凝胶色谱法测定聚烯丙胺盐酸盐的分子量及分子分布的方法

技术领域

本发明涉及化学分析领域，具体涉及一种凝胶色谱测定聚烯丙胺盐酸盐的分子量及分子分布。

背景技术

聚烯丙胺盐酸盐为药物碳酸司维拉姆的重要中间体，碳酸司维拉姆是一种新颖的磷酸根结合剂，不含钙和铝是其突出的优点，并且不会被身体吸收，长期使用安全性好。适用于正在透析治疗的肾病晚期患者或高磷血症患者，降低血清磷水平而不引起高钙血症。而聚烯丙胺的聚合反应程度对后续交联反应有较大影响。

聚烯丙胺盐酸盐的合成为烯丙基盐酸盐在偶氮化合物的催化下，发生聚合反应，形成聚丙烯胺盐酸盐聚合物。反应过程如下图

由于聚合反应过程复杂，聚烯丙胺盐酸盐的聚合程度直接影响下一步交联反应的空间结构，从而影响到最终药物的药效。

聚烯丙胺盐酸盐分子量及分子分布研究较少，至今没有聚烯丙胺盐酸盐分子量及分子分布的标准物质及检测方法，也没有公开的专利，满足不了企业对大生产中中间体检测放行的要求。

发明内容

聚烯丙胺盐酸盐在聚合反应过程中，其分子量范围跨越几个数量级，凝胶色谱法是理想的分析方法之一。本发明提供了一种串联凝胶色谱法测定聚烯丙胺盐酸盐分子量及分子分布的方法，不同类型对照品的选择有效的扩大了分子量测定范围，提高了聚烯丙胺盐酸盐分子量及分子分布检测的准确度和便捷性。

为达到上述目的，本发明提供的技术方案如下：

一种凝胶色谱法测定聚烯丙胺盐酸盐分子量及分子分布的方法，包括以下步骤：

(a)标准品溶液配制：

精密称定不同分子量的标准品，置容量瓶中，加入稀释剂定容，摇匀，进液相相分析；

(b)绘制标准曲线

将不同分子量的标准品溶液进行色谱分析，记录保留时间，绘制线性曲线方程，计算r值；

(c)供试品溶液配制：

精密称取聚烯丙胺盐酸盐，置于容量瓶中，稀释剂定容稀释，摇匀，进液相相分析；

(d)样品溶液测定：

将样品溶液进行色谱分析，得到色谱图，通过标准曲线计算不同保留时间下的聚烯丙胺盐酸盐的分子量，得到聚烯丙胺盐酸盐的分子量及分子分布。

所述色谱分析条件为：

色谱柱：Shodex OHpak SB-804HQ2支串联；

检测器：示差折光检测器；

流动相：0.4～0.6mol/L氯化钠水溶液；

流速：0.6～1mL/min；

柱温：25～40℃；

检测器温度：30～45℃；

进样量：5～10μL。

所述凝胶色谱的标准曲线是采用取分子量108、590、3070、10300、21600的聚乙二醇标样33600、101200、246600的聚氧化乙烯标样，配成标准溶液；再利用标准溶液绘制标准曲线。为了保证拟合度好，可以采取更多的标准点来测试方法的边界，具体实际应用时，可以根据检测对象的分子量范围，以及成本和时间的考虑，选择其中一部分分子量分布来绘制标准曲线。

例如，本发明的两个实施例中采用取分子量590、3070、10300、21600的聚乙二醇标样、33600、10120的聚氧化乙烯标样，配成标准溶液；再利用标准溶液绘制标准曲线。

所述稀释剂为0.2～1.0mol/L氯化钠水溶液，氯化钠水溶液中含1％乙酸。优选为：0.3～0.6mol/L氯化钠水溶液(含1％乙酸)，更优选地为0.3～0.5mol/L氯化钠水溶液(含1％乙酸)；进一步优选为0.5mol/L氯化钠水溶液，含1％乙酸。

所述标准曲线是以标准品线性溶液中主峰的保留时间为横坐标，以分子量对照品的Mp值为纵坐标，进行拟合而得。

作为优选，样品进行凝胶色谱测试时，待测溶液浓度为5-10mg/mL。

作为优选，凝胶色谱条件中色谱流动相优选为0.5mol/L氯化钠水溶液(含1％乙酸)；流动相流速为1mL/min。

作为优选，凝胶色谱条件中凝胶色谱柱温为30℃；检测器温度为35℃。

作为优选，凝胶色谱条件中样品进样量为10μL。

本发明通过Shodex OHpak SB-804HQ2支串联以及流动相的选择，实现了聚烯丙胺分子量及分子量分布的测定，当采用不同pH乙酸钠水溶液作为流动相时，方法的重现性不佳，可能由于环境变化(室温等)或者流动相离子强度不足导致。而采用氯化钠水溶液(含1％乙酸)时方法重现性好。本发明可检测分子量检测范围为108～246600。

有益效果：

本发明通过Shodex OHpak SB-804HQ2支串联以及流动相的选择，实现了聚烯丙胺分子量及分子量分布的测定，在该色谱条件下能够便捷、快速的实现不同分子量的聚烯丙胺盐酸盐的分离，经实验验证，本发明方法峰形好、分子量检测范围108～246600，范围广，在600～104700分子量区间内重现性高、分离度好、准确度高。

附图说明

图1为本发明实例2中聚烯丙胺盐酸盐标准液相图谱。

图2为本发明实例中2中对照品拟合标准曲线谱图。

图3为本发明对实施例1中流动相改变pH的对比图谱。

图4为本发明对比方案1中图谱。

图5为本发明对比方案2中对照品和供试品重叠图谱。

图6为本发明对比方案3中对照品拟合标准曲线谱图。

图7为本发明对实施例1中流动相改变盐浓度的对比图谱。

具体实施方式

以下各实施例中所使用试剂均为购买，直接使用。

实施例1

考察流动相盐浓度、pH对供试品溶液中主峰峰形的影响

溶液配制

稀释剂1：0.12mol/L乙酸钠水溶液(加乙酸调pH至4.5)

取聚烯丙胺盐酸盐6.63mg，置进样小瓶，加1.5ml稀释剂1溶解，混匀，配制成终浓度为5mg/ml的供试品溶液；

稀释剂2：0.2mol/L乙酸钠水溶液(加乙酸调pH至4.5)

取聚烯丙胺盐酸盐4.58mg，置进样小瓶，加1.0ml稀释剂2溶解，混匀，配制成终浓度为5mg/ml的供试品溶液；

稀释剂3：0.3mol/L乙酸钠水溶液(加乙酸调pH至4.5)

取聚烯丙胺盐酸盐5.59mg，置进样小瓶，加1.0ml稀释剂3溶解，混匀，配制成终浓度为5mg/ml的供试品溶液；

稀释剂4：0.3mol/L乙酸钠水溶液(加乙酸调pH至4.3)

取聚烯丙胺盐酸盐6.73mg，置进样小瓶，加1.4ml稀释剂4溶解，混匀，配制成终浓度为5mg/ml的供试品溶液；

稀释剂5：0.3mol/L乙酸钠水溶液(加乙酸调pH至4.7)

取聚烯丙胺盐酸盐6.66mg，置进样小瓶，加1.4ml稀释剂5溶解，混匀，配制成终浓度为5mg/ml的供试品溶液；

色谱条件如表1所示。

表1

结果与讨论

流动相不同盐浓度考察结果表明，乙酸钠浓度为120mmol/L时，烯丙胺聚合物峰形不对称，乙酸钠浓度为200mmol/L时，烯丙胺聚合物峰形明显改善，乙酸钠浓度为300mmol/L时，烯丙胺聚合物峰形对称，因此，流动相中乙酸钠浓度确定为300mmol/L。见图7。

流动相不同pH考察结果表明，乙酸钠pH为4.3、4.5、4.7时，烯丙胺聚合物峰形对称，峰形基本一致。因此，流动相pH确定为4.5，见图3。

因此，流动相确定为0.3mol/L乙酸钠水溶液(加乙酸调pH至4.5)，对方法进行预验证。

2.对比方案1

采用实例1中确定的方法进行预验证，并对样品分子量分布进行测试。

溶液配制

流动相/稀释剂：

0.3mol/L乙酸钠水溶液(加乙酸调pH至4.5)。

供试品溶液：

取聚烯丙胺盐酸盐5.79mg，置进样小瓶，加1.0ml稀释剂溶解，混匀，配制成终浓度为5mg/ml的供试品溶液；

取聚烯丙胺盐酸盐(批号：HS20002-A-282)7.17mg，置进样小瓶，加1.0ml稀释剂溶解，混匀，配制成终浓度为5mg/ml的供试品溶液；

取聚烯丙胺盐酸盐(批号：HS20002-A-280)0.2ml置10ml量瓶，加稀释剂溶解，并稀释定容摇匀，取417μL置进样小瓶，加583μL稀释剂，配制成终浓度为5mg/ml的供试品溶液。

对照品溶液：

取PEG、PEO对照品，来源批号见表2，称样量见表,3，置进样小瓶，定量加入稀释剂溶解。

表2

表3

色谱条件如表4所示。

表4

结果与讨论

线性结果如表5和表6所示。

表5

表6

供试品检测结果如表7所示。

表7

供试品溶液峰形不对称，见图4：

方法重现性不好，推测可能由于环境变化(室温等)或者流动相离子强度不足导致。下一步计划更换流动相的盐体系进行测试。

3.对比方案2

采用0.3mol/L氯化钠(1％乙酸水溶液)进行测试，并对方法进行优化，以改善供试品溶液以及分子量对照品的峰形。

溶液配制

流动相/稀释剂：

0.3mol/L氯化钠水溶液(含1％乙酸)：称取氯化钠35.6017g置2L水中，超声溶解，加入20ml冰乙酸(测得pH为2.60)，超声脱气(稀释剂1)。

0.5mol/L氯化钠水溶液(含1％乙酸)：称取氯化钠22.9563g的氯化钠，置780ml超纯水中，超声溶解，加入7.8ml冰乙酸(测得pH为2.54)，超声脱气(稀释剂2)。

供试品溶液：

取聚烯丙胺盐酸盐(批号：HS20002-A-280)5.60mg，置进样小瓶，加1.0ml稀释剂1溶解，混匀，配制成终浓度为5mg/ml的供试品溶液；

取聚烯丙胺盐酸盐(批号：HS20002-A-280)6.05mg，置进样小瓶，加1.0ml稀释剂2溶解，混匀，配制成终浓度为5mg/ml的供试品溶液；

取聚烯丙胺盐酸盐(批号：0409)5.55mg，置进样小瓶，加1.0ml稀释剂2溶解，混匀，配制成终浓度为5mg/ml的供试品溶液。

色谱条件如表8所示。

表8

结果与讨论

改用氯化钠-乙酸体系后峰形正常，考察不同浓度氯化钠对峰形的影响，0.3M与0.5M峰形一致，说明流动相盐浓度在0.3M～0.5M范围内均可以保证供试品溶液峰形对称；采用氯化钠-乙酸体系后，供试品溶液中色谱峰保留时间与使用乙酸钠体系第1次测试保留时间相近。

测试分子量较大(Mw：103800)的烯丙胺盐酸盐标准品，峰形正常(0.5mol/L氯化钠)，见图5。

对比方案3

溶液配制

流动相/稀释剂：

0.5mol/L氯化钠水溶液(含1％乙酸)：称取氯化钠58.0879g的氯化钠，置2000ml超纯水中，超声溶解，加入20ml冰乙酸，超声脱气。

供试品溶液：

取聚烯丙胺盐酸盐(批号：0409)5.10mg，置进样小瓶，加1.0ml稀释剂溶解，混匀，配制成终浓度为5mg/ml的供试品溶液；

取聚烯丙胺盐酸盐(批号：5322)5.75mg，置进样小瓶，加1.0ml稀释剂溶解，混匀，配制成终浓度为5mg/ml的供试品溶液。

对照品溶液：

取PEG、PEO对照品，称样量见表9所示，置进样小瓶，定量加入稀释剂溶解。

表9

色谱条件如表10所示。

表10

结果与讨论

检测结果见下表11。线性曲线选择3阶方程，

Y＝-0.00148618X

表11

测试样品与COA上的检测结果重均分子量，基本一致，方法适用。隔天重现实验，供试品溶液主峰峰形以及保留时间未见明显变化，方法可以重现。

实施例2

1.仪器设备及试剂

仪器：1260Infinity II高效液相色谱仪，配示差检测器。

试剂：氯化钠，乙酸，分子量590、3070、10300、21600的聚乙二醇标样、33600、10120的聚氧化乙烯标样(样品信息见表12)，聚烯丙胺盐酸盐。

表12

色谱参数如表13所示。

表13

对照品线性溶液配制

称取聚乙二醇PEG，Mw＝590分子量对照品25.91mg，置5ml量瓶中，加稀释剂5ml溶解，混匀，作为分子量对照品线性溶液1，标记为L1；

称取聚乙二醇PEG，Mw＝3070分子量对照品4.994mg，置进样小瓶，加稀释剂1ml溶解，混匀，作为分子量对照品线性溶液2，标记为L2；

称取聚乙二醇PEG，Mw＝10300分子量对照品5.027mg，置进样小瓶，加稀释剂1ml溶解，混匀，作为分子量对照品线性溶液3，标记为L3；

称取聚乙二醇PEG，Mw＝21600分子量对照品5.016mg，置进样小瓶，加稀释剂1ml溶解，混匀，作为分子量对照品线性溶液4，标记为L4；

称取聚氧乙烯PEO，Mw＝33600分子量对照品5.005mg，置进样小瓶，加稀释剂1ml溶解，混匀，作为分子量对照品线性溶液5，标记为L5；

称取聚氧乙烯PEO，Mw＝101200分子量对照品5.040mg，置进样小瓶，加稀释剂1ml溶解，混匀，作为分子量对照品线性溶液6，标记为L6。

系统适用性

对照品线性溶液L4连进5针，计算RSD，以对照品线性溶液中主峰的保留时间为横坐标，以分子量对照品的Mp值为纵坐标，使用安捷伦工作站自带的GPC模板进行3阶方程拟合，绘制线性标准曲线。标准曲线见图2。

结果如表14和表15。

表14

对照品线性溶液4连进5针，保留时间的RSD为0.04％；

表15

以对照品线性溶液中主峰的保留时间为横坐标，以分子量对照品的Mp值为纵坐标，使用安捷伦工作站自带的GPC模板进行3阶方程拟合，绘制线性曲线，相关系数(r)的绝对值为0.999。对照品分子量跨越几个数量级，线性曲线相关系数为0.999，证明此方法测试分子量范围广，适用性好。

精密度

称取烯丙胺盐酸盐聚合物供试品约100mg，置10mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，平行配制6份，进行色谱分析，结果如表16。色谱图见图1

表16

对于聚烯丙胺盐酸盐而言，由于聚合反应程度不同，分子链长短不一，分子量大小就不同。分子量分布是用多分散系数来表示的，分子量分布窄的体系(1.01～1.1)为单分散体系，分子量分布大于1.6或偏离1越远的体系为多分散体系。计算结果显示，聚烯丙胺盐酸盐的重均分子量Mw为12377，分子量多分散系数为1.93，分布带较宽。六个样品数均分子量和重均分子量的RSD均为0.3％，说明此方法对于聚烯丙胺盐酸盐分子量及分子量分布精密度较好，准确度高。

实施例3

1.色谱条件(改变柱温)见表17

表17

对照品线性溶液

称取聚乙二醇PEG，Mw＝590分子量对照品约5mg，置进样小瓶，加稀释剂1ml溶解，混匀，作为分子量对照品线性溶液1，标记为L1；

称取聚乙二醇PEG，Mw＝3070分子量对照品约5mg，置进样小瓶，加稀释剂1ml溶解，混匀，作为分子量对照品线性溶液2，标记为L2；

称取聚乙二醇PEG，Mw＝10300分子量对照品约5mg，置进样小瓶，加稀释剂1ml溶解，混匀，作为分子量对照品线性溶液3，标记为L3；

称取聚乙二醇PEG，Mw＝21600分子量对照品约5mg，置进样小瓶，加稀释剂1ml溶解，混匀，作为分子量对照品线性溶液4，标记为L4；

称取聚氧乙烯PEO，Mw＝33600分子量对照品约5mg，置进样小瓶，加稀释剂1ml溶解，混匀，作为分子量对照品线性溶液5，标记为L5；

称取聚氧乙烯PEO，Mw＝101200分子量对照品约5mg，置进样小瓶，加稀释剂1ml溶解，混匀，作为分子量对照品线性溶液6，标记为L6。

称样量如表18所示。曲线方程见表19和表20。

表18

表19

表20

供试品溶液

称取烯丙胺盐酸盐聚合物供试品49.15mg，置5mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。

实验结果如表21所示。

表21

不同柱温相条件下的测试结果与重复性6份结果比较，共7份供试品数均分子量(Mn)RSD均小于5.0％(n＝7)，重均分子量(Mw)RSD均小于5.0％(n＝7)。改变柱温对方法的影响不大，方法的耐用性好。