一种提取小鼠主动脉成纤维细胞的方法

技术领域：

本发明属于细胞定量分析技术领域，具体涉及一种提小鼠主动脉成纤维细胞的方法。

背景技术：

流式细胞术是以单个细胞为基础的一项技术，广泛应用于基础研究和临床实践各个方面，如可以进行小鼠血管细胞膜免疫表型分析，而制备小鼠血管组织单细胞悬液是流式细胞分析的前提。现有的血管组织单细胞悬液的制备较为困难，很难获得产率高、活性高及功能强的单细胞，阻碍了进一步的实验研究，并且细胞数量不足、细胞碎片过多、细胞黏连成团等均可导致实验的失败。因此如何制得质量更好的单细胞悬浮液是目前需要解决的问题。专利申请号为CN201910618214.8的专利公开了一种小鼠主动脉细胞单细胞悬液制备的方法，包括以下步骤：首先，准备好1ml的酶混合液、存活的健康野生小鼠、整个桌面为平整冰面的操作台及若干仪器；然后，用200～500ul的水合氯醛将准备好的所述野生小鼠腹腔注射麻醉致死，并立即用20ml的磷酸缓冲盐溶液对所述野生小鼠的血管进行灌注冲洗，再用体积分数为75％的酒精对死亡的所述野生小鼠进行整体消毒，完成消毒后进行开胸腹手术，并暴露心脏和主动脉，然后应用剪碎和混合酶联合消化法制备小鼠血管组织单细胞悬液。但是这种细胞提取方法操作步骤繁琐、耗费时间长、所需小鼠的数量多、胰蛋白酶消耗量大、成本较高，容易造成细胞消化不彻底或者细胞消化过度，提取的成纤维细胞数量少，单细胞纯度低，影响单细胞测序和流式检测实验的可行性与精确性。

发明内容：

(一)解决的技术问题

针对上述背景，本发明提出了一种提取小鼠主动脉成纤维细胞的方法，解决现有技术提取小鼠主动脉成纤维细胞操作步骤繁琐、耗费时间长、所需小鼠的数量多、胰蛋白酶消耗量大，容易造成细胞消化不彻底或者细胞消化过度，提取的成纤维细胞数量少，纯度低，影响单细胞测序和流式检测实验的可行性与精确性的问题。

(二)技术方案

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种提取小鼠主动脉成纤维细胞的方法，包括以下步骤：

S1、麻醉小鼠后剪开小鼠腹部皮肤和皮下肌肉组织，用显微镊钝性分离腹主动脉及静脉表面脂肪及包膜组织，打开动静脉鞘，游离腹主动脉前面及侧面，将浸润有猪胰蛋白酶的化妆棉覆盖在腹主动脉表面，将周围包膜及脂肪组织复原，计时40分钟，40分钟后取出化妆棉，用生理盐水冲洗腹腔2次，缝合腹部；

S2、术后第14天，麻醉处死小鼠，剪开皮肤及胸骨，分离除心血管系统和肾脏之外的所有胸腹腔器官，在显微镜下分离小鼠整根主动脉血管，放入装有预冷PBS的培养皿中，用显微镊挤出血管中残留的血液，并依次在另两个装有清洁PBS的培养皿中清洗；

S3、将清洗后的主动脉血管置于EP管管壁上，使用显微剪将主动脉血管组织剪碎，向剪碎后的组织块中加入消化液，37℃水浴锅200rpm震荡20分钟；取出EP管，静置2min后，用移液枪将上清吸出并收集到装有终止液的EP管中，收集EP管置于冰上；

S4，在剩余组织-消化液混合物中再加入所述消化液，37℃水浴锅200rpm震荡20分钟，重复吸取并收集上清的步骤；

S5，最后一次消化后，将包括所述收集EP管内的所有含细胞的液体经70μm滤网过滤到一个新的EP管中，4℃离心机，1600rpm离心5min，弃上清；

S6，将步骤5获得的细胞沉淀用含15％血清的DMEM培养基重悬，种在12孔板中，放于CO2培养箱中静置2小时，弃去培养上清，PBS轻柔洗2-3次后加入完全培养基并置于培养箱继续培养，所得细胞即为成纤维细胞。

进一步地，所述消化液的配方为：每毫升所述消化液包括胶原酶XI4-12.5U、透明质酸2-6U、脱氧核糖核酸酶2-6U、胶原酶I15-45U、PBS 1ml；所述终止液的配方为：每毫升所述终止液包括900μl DMEM培养基、100μl牛血清。

进一步地，步骤6中所述的培养的条件为：37℃培养4～48小时。

进一步地，步骤3中使用所述显微剪剪碎主动脉血管的过程控制在10分钟以内。

进一步地，步骤3中所述分离小鼠主动脉的方法为从主动脉弓至髂分叉处，取下整根小鼠主动脉。

进一步地，所述血清为牛血清。

(三)有益效果

本发明产生的有益效果是：

1.通过本发明所提供的技术方案，可以快速有效地提取小鼠主动脉成纤维细胞，提取的技术难度低，提取时无需剥离小鼠主动脉外膜；

2.应用本发明提供的技术方案提取小鼠主动脉成纤维细胞，消耗时间短，全程仅需3-4小时即可获得小鼠成纤维细胞；

3.本发明提供的技术方案采用的消化液和终止液，对血管组织消化彻底，对细胞活性影响小；

4.应用本发明提供的技术方案提取的小鼠主动脉成纤维细胞纯度高，经过对细胞免疫荧光染色鉴定，纯度可以在90％以上。

附图说明：

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为猪胰蛋白酶造模后小鼠主动脉血管图，图中可以看出小鼠主动脉血管经过猪胰蛋白酶造模后形成动脉瘤；

图2为小鼠主动脉血管消化过程图，图中显示血管逐渐消化完全；

图3为提取得到的成纤维细胞显微图；图中可以得出，将经过消化得到的所有主动脉血管细胞静置两小时并弃去上清中悬浮细胞后，24小时可见贴壁的细胞成梭形、多边形，细胞周围伸出伪足，胞体较大、胞质透明、胞核清晰，细胞生长迅速；

图4为免疫荧光鉴定图；图中显示，对P2、P3代的细胞种板、通过免疫荧光进行原代细胞的鉴定，发现提取的原代细胞中Vimentin高表达，而α-SMA低表达，符合成纤维细胞的分子生物学特征，证明提取的原代成纤维细胞纯度高。

具体实施方式：

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

一、实验材料：组织镊1把、组织剪1把、显微剪1把、显微镊2把、3cm培养皿3个、12孔培养皿3个、吸水化妆棉若干、棉签、立体手术显微镜、猪胰蛋白酶(英国sigma公司)、4-0缝合线、缝合针、移液枪、枪头、10ml离心管、水浴锅(苏州威尔实验用品有限公司)、DMEM培养基(美国Hyclone公司)、PBS(英国sigma公司)、生理盐水、戊巴比妥钠、DAPI(北京中杉金桥公司)、鼠抗vimentin一抗(美国proteintech公司)、鼠抗α-SMA一抗(美国abcam公司)、Alexa Fluor 647标记山羊抗兔IgG(H+L)(上海碧云天公司)、Alexa Fluor 488标记山羊抗鼠IgG(H+L)(上海碧云天公司)、1％Triton-X100溶液(中国深圳亮东科技有限公司)、4％多聚甲醛固定液(上海碧云天公司)、5％BSA封闭液(中国Solarbio公司)、1XPBST(中国Solarbio公司)(除动脉瘤造模及染色用试剂外其余所有实验用品均经高压灭菌处理)

二、实验方法：

步骤1，取3只8周龄的C57小鼠，用200μl 1％戊巴比妥麻醉小鼠。小鼠麻醉后，仰卧固定四肢，对腹部进行脱毛，剪开腹部皮肤和皮下肌肉组织，置入一根棉签吸收腹腔渗出液体并将腹部脏器推向一侧。用显微镊钝性分离腹主动脉及静脉表面脂肪及包膜组织，打开动静脉鞘，游离腹主动脉前面及侧面，将浸润有猪胰蛋白酶的两块1*1mm化妆棉覆盖在腹主动脉表面，将周围包膜及脂肪组织复原，计时40分钟。40分钟后取出化妆棉，用生理盐水冲洗腹腔2次，缝合腹部。

步骤2，术后第14天，用200μl 1％戊巴比妥麻醉小鼠，眼球放血处死小鼠。仰卧固定小鼠，用组织剪沿中线剪开皮肤及胸骨，分离除了心血管系统和肾脏之外的所有胸腹腔器官。超净台内在显微镜下分离小鼠主动脉,从主动脉弓至髂分叉处，放入装有预冷PBS的培养皿中。用显微镊挤出血管中残留的血液，并依次在另两个装有清洁PBS的培养皿中清洗。造模后小鼠血管图片见图1。

步骤3，将血管置于10ml EP管管壁上，倾斜EP管，使用显微剪将组织剪碎，向组织块中加入消化液900μl，37℃水浴锅200rpm震荡20分钟。取出EP管，静置2min后，用移液枪将上清吸出并收集到装有3ml终止液的10ml EP管中，终止酶消化，维持细胞活性，收集EP管置于冰上。

步骤4，在剩余组织-消化液混合物中再加入800μl消化液，37℃水浴锅200rpm震荡20分钟,重复吸取并收集上清的步骤。在剩余混合物中加入最后一次800μl消化液，37℃水浴锅200rpm震荡20分钟。分步消化法，三次消化后可以将血管组织几乎消化完全，每次消化效果见图2。

步骤3中的消化液及终止液均为现配先用，平均一根血管需要消化液2.5ml，终止液3ml，配方如下：

每毫升消化液：胶原酶XI 4-12.5U、透明质酸2-6U、脱氧核糖核酸酶2-6U、胶原酶I15-45U、PBS 1ml。根据实验，足量的酶最多可以完全消化3根血管，故按配方所给剂量范围内所配制的混合酶，均可以参照步骤3中的方法用于1-3根血管的消化。

每毫升终止液：900μl DMEM培养基、100μl牛血清。

步骤5，最后一次消化后，将包括收集管内的所有含细胞的液体经70μm滤网过滤到一个新的10ml EP管中，4℃离心机，1600rpm离心5min，弃上清。

步骤6，将步骤5获得的细胞沉淀用含15％血清的DMEM培养基重悬，种在12孔板中，建议每3根血管的细胞种1个孔。放于CO2培养箱中静置2小时，弃去培养上清。PBS轻柔洗2-3次后加入完全培养基并置于培养箱继续培养，根据成纤维细胞贴壁时间，通过差速贴壁法，此时所得贴壁细胞即大部分为成纤维细胞。

当显微镜下观察到成纤维细胞存在部分融合，以0.25％胰蛋白酶消化传代(1∶2)；第1代～第3代细胞可用于实验或鉴定。

细胞鉴定：取所述生长至汇合度90％的细胞，加入0.25％胰蛋白酶，于显微镜下观察细胞，待细胞皱缩变圆，加入2ml完全培养基终止消化，获得细胞悬液，以2*105/ml接种于爬片，进行Vimentin、α-SMA免疫荧光染色鉴定，结果显示Vimentin阳性率90％，即细胞纯度达90％。

实验结果：

从图1可以看出，猪胰蛋白酶造模后小鼠血管形成动脉瘤

从图2可以看出，分步消化后血管消化逐渐完全

从图3可以看出，将得到的所有血管细胞静置两小时并弃去上清中悬浮细胞后，24小时可见贴壁的细胞成梭形、多边形，细胞周围伸出伪足，胞体较大、胞质透明、胞核清晰，细胞生长迅速

从图4可以看出，对P2、P3代的细胞种板、通过免疫荧光进行原代细胞的鉴定，发现提取的原代细胞中Vimentin高表达，而α-SMA低表达，符合成纤维细胞的分子生物学特征，证明提取的原代成纤维细胞纯度高。血管成纤维细胞纯度(％)＝Vimentin阳性染色细胞数/细胞核总数*100％。

实验结果统计如下表：

综上所述，本发明提出的一种提取小鼠主动脉成纤维细胞的方法，解决现有技术提取小鼠主动脉成纤维细胞操作步骤繁琐、耗费时间长、所需小鼠的数量多、胰蛋白酶消耗量大，容易造成细胞消化不彻底或者细胞消化过度，提取的成纤维细胞数量少，纯度低，影响单细胞测序和流式检测实验的可行性与精确性的问题。

最后需要说明的是，以上实施例仅用于说明本发明而非限制本发明的保护范围。另外，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改或变型，所有的这些等价形式同样属于本申请所要求限定的保护范围之内。