一种裂叶紫雨桦的创制方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种裂叶紫雨桦的创制方法。

背景技术

裂叶桦(Betulapendula‘Dalecarlica’)是欧洲白桦(Betulapendula)的一个品种，其树干洁白，枝条下垂，尤其叶片边缘具明显深分裂，似茶条槭叶片(Acer ginnalaMaxim)，作为观叶林木备受人们喜爱。紫雨桦(Betulapendula'Purple Rain')又称紫叶桦，也是来自欧洲白桦的一个品种，该品种除了树干洁白的优点之外，其叶片呈现紫色，观赏价值较高。上述2个白桦品种已广泛应用于庭院装饰和城市绿化。

裂叶紫雨桦在国内外尚未见报道，鉴于此，本发明旨在提供一种裂叶紫雨桦的创制方法，该桦树品种突出特点是兼具了叶型美、叶色美两个优点，在园林绿化中即可用作行道树，也可作庭荫树，具有很高的观赏和景观利用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种裂叶紫雨桦的创制方法，以解决上述现有技术存在的问题，本发明采用杂交育种技术手段，聚合了控制叶色及叶型的基因，获得了裂叶紫雨桦，该品种兼具叶型美和叶色美两个优点，在园林绿化中即可用作行道树，也可作庭荫树，具有很高的观赏和景观利用价值。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种裂叶紫雨桦的创制方法，包括以下步骤：

(1)收集得到紫雨桦花粉；

(2)将所述紫雨桦花粉与裂叶桦通过人工授粉杂交，得到紫雨桦育种群体；

(3)所述紫雨桦育种群体自交后，筛选得到裂叶和紫叶性状组合的个体，即为所述裂叶紫雨桦。

进一步地，在步骤(1)中，所述紫雨桦花粉通过切枝水培的方法收集。

进一步地，所述切枝水培的培养温度为28±2℃，光照条件为光照16h/黑暗8h，光照强度为8000-9000lx。

进一步地，在步骤(3)中，所述筛选前还包括对自交得到的种子进行消毒和催芽处理的步骤。

进一步地，所述消毒具体为将所述种子用0.4wt％的高锰酸钾浸泡30min。

进一步地，所述催芽处理的温度为25±2℃，光照条件为光照16h/黑暗8h，光照强度为6000-7000lx。

本发明还提供一种提高紫雨桦叶色明亮度的方法，包括以下步骤：

(1)收集得到紫雨桦花粉；

(2)将所述紫雨桦花粉与裂叶桦通过人工授粉杂交，得到紫雨桦育种群体；

(3)所述紫雨桦育种群体自交后，筛选得到裂叶和紫叶性状组合的个体，即为叶色明亮度高的紫雨桦。

本发明还提供一种降低紫雨桦株高的方法，包括以下步骤：

(1)收集得到紫雨桦花粉；

(2)将所述紫雨桦花粉与裂叶桦通过人工授粉杂交，得到紫雨桦育种群体；

(3)所述紫雨桦育种群体自交后，筛选得到裂叶和紫叶性状组合的个体，即为株高低的紫雨桦。

本发明公开了以下技术效果：

裂叶桦的花期较紫雨桦的花期提早10-15天左右，上述两种桦树的花期不遇，在裂叶桦处于最佳授粉时期，此时紫雨桦花粉尚未成熟，待紫雨桦花粉成熟散粉时，裂叶桦的雌蕊已丧失授粉能力，因此，自然条件下很难获得裂叶桦与紫雨桦的杂交种。本发明通过切枝水培收集紫雨桦花粉，在与定植于棚式种子园中裂叶桦母树杂交授粉，构建得到了育种群体，进而，通过群体中各株系间的自由授粉，筛选获得裂叶紫雨桦。

本发明采用杂交育种技术手段，聚合了控制叶色及叶型的基因，获得了裂叶紫雨桦，该品种兼具叶型美和叶色美两个优点，在园林绿化中即可用作行道树，也可作庭荫树，具有很高的观赏和景观利用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1创制的裂叶紫雨桦；

图2为移栽的紫雨桦(左)及裂叶紫雨桦(右)；

图3为紫雨桦(左)及裂叶紫雨桦(右)叶片；

图4为紫雨桦及裂叶紫雨桦花青素相对含量比较；

图5为紫雨桦及裂叶紫雨桦L*值比较；

图6为紫雨桦及裂叶紫雨桦图a*值比较；

图7为紫雨桦及裂叶紫雨桦叶绿素相对含量比较；

图8为紫雨桦及裂叶紫雨桦株高比较。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

1.裂叶桦母树的培育

裂叶桦(B.pendula'Dalecarlica')种子于2010年8月采自黑龙江省森林植物园，将种子晾干后去除果梗及果苞，立即进行种子催芽处理，3天后将催芽的种子均匀撒播于30cm×20cm左右的育苗筐中(基质按草炭土：河沙：黑土＝5：3：1的比例制备)，待芽苗出土后长出2-3片叶时，移栽到40cm×40cm的25孔育苗盘中进行培育(育苗基质按草炭土：河沙：黑土＝5：3：2的比例混合制备)。在获得的1000余株苗木中正常叶型：裂叶约为3：1的比例。

2011年5月初待越冬苗木展叶后，分别将300余株裂叶桦苗木移栽至21cm×21cm的花盆中，进行常规水肥管理，2012年，选择其中干型通直的12株裂叶桦(分别命名为：L1-L12)定植于东北林业大学白桦良种基地的棚式种子园中，园中母树行间距为4m×5m，进行常规水肥管理及病虫害防治等措施。为了使树体矮化，分别对L1-L12母树在每年的8月中旬进行去顶修枝，控制树高，便于进行杂交授粉。

2.紫雨桦母树的培育

紫雨桦(Betulapendula'Purple Rain')种子于2010年8月采自黑龙江省森林植物园，将种子晾干后去除果梗及果苞，立即进行种子催芽处理，3天后将催芽的种子均匀撒播于30cm×20cm左右的育苗筐中(基质按草炭土：河沙：黑土＝5：3：1的比例制备)，待芽苗出土后长出2-3片叶时，移栽到40cm×40cm的25孔育苗盘中进行培育(育苗基质按草炭土：河沙：黑土＝5：3：2的比例混合制备)。在获得的800余株苗木中绿色叶：紫叶约为1：1的比例。

2011年5月初待越冬苗木展叶后，分别将400余株紫雨桦苗木移栽至21cm×21cm的花盆中，进行常规水肥管理，2012年，选择其中干型通直的10株裂叶桦(分别命名为：Z1-Z10)定植于东北林业大学白桦良种基地的棚式种子园中，园中母树行间距为4m×5m，进行常规水肥管理及病虫害防治等措施。分别对定植的母树在每年8月中旬进行去顶修枝，控制树高。

3.含有控制裂叶性状DdBb隐性基因的紫雨桦育种群体的构建

(1)切枝水培收集紫雨桦花粉

2015年4月初，用枝剪剪取紫雨桦(Z1)一年生50cm长带有雄花序的花枝，放到盛有自来水的水桶中进行水培，培养温度为：28±2℃、光照16h/黑暗8h、光照强度为8000lx(最高可达9000lx)，15天左右可见枝头的雄花序陆续解旋散粉，此时，用硫酸纸收集成熟花粉后，至于阴凉处阴干24h(24-48h可达相同效果)，随后硫酸纸包好，抽真空4℃保存备用。

2015年4月中旬，待欧洲白桦(LCK)雄花序开始解旋，即将散粉时，摘取花序于硫酸纸上铺开，置于干燥处等待散粉，散粉后继续阴干24h(24-48h可达相同效果)，随后硫酸纸包好，抽真空4℃保存备用。

(2)人工授粉杂交构建紫雨桦育种群体

2015年4月下旬，裂叶桦陆续开花，以定植于东北林业大学白桦良种基地的棚式种子园中的5年生裂叶桦L2、L3、L6为母本，通过套袋控制授粉技术，与提前收集的Z1紫雨桦花粉杂交，同时设置对照组(表1)，7月下旬，待果穗发育成熟后进行采种，实验组共计获得3个全同胞家系的种子(家系分别命名为：1516、1517、1520)，对照组也获得3个全同胞家系的种子(家系分别命名为：1502、1504、1505)，2015年8月初分别将上述家系播种育苗，各家系分别获得苗木约500株-1000株，实验组的1516、1517、1520家系苗木中有紫叶及正常叶色，对照组的1502、1504、1505家系苗木中均有裂叶和正常叶型的苗木(表1)。

2016年早春，分别选取1516、1517、1520家系中生长最好的、叶色为紫色的紫叶桦，移栽至21cm×21cm的花盆中，置于棚式种子园中进行常规水肥管理。2017年早春，将这些苗木送往帽儿山实验林场按1.5米×1.5米的株行距进行定植，按每列34株定植，1516家系共计5列、1517家系共计14列、1520家系共计4列，各列随机排列，即构建获得含有控制裂叶性状DdBb隐性基因的紫雨桦育种群体。

表1杂交母本、父本、家系代码及子代性状

4.通过含有DdBb基因的紫雨桦群体间自由授粉筛选裂叶紫雨桦

(1)紫雨桦群体间自由授粉获得不同家系的种子

待2020年上述3个家系(1516、1517和1520)的紫雨桦进入生殖生长阶段，通过紫雨桦单株间自由授粉获得的杂交子代筛选裂叶及紫叶性状组合的个体。参试家系于2021年5月初开花散粉，到了8月初采摘1516、1517、1520三个紫雨桦家系各单株间通过自由授粉获得的种子，将种子晾干后去除果梗及果苞，分别放到塑封袋中抽真空-20℃冰箱保存备用。

(2)种子催芽处理及育苗

2022年早春4月中旬，首先测定1516、1517、1520家系的种子发芽率，结果发现，他们的发芽率较低，分别为9％、14％、7％。以往的研究还发现紫雨桦、裂叶桦的种子不仅发芽率低，播种育苗成活率也较低。

为了保证杂交获得的种子具有较高的成苗率，试验首先对种子进行了消毒和催芽：

①将各家系种子分别用0.4wt％的高锰酸钾浸泡30min，随后用清水冲洗干净；

②取直径为9cm的培养皿底部铺垫4层普通的纸巾，将种子摆放在纸上，加入自来水浸湿纸巾至种子略浮起即可，放在温度为25±2℃，光照16h/黑暗8h，光照强度6000lx(最高可达7000lx)条件下进行催芽，第3天种子即可萌发，7天即可长出2片子叶，15天后分别将幼苗播种于育苗钵中。

早期的研究发现，由于紫雨桦幼苗的花色苷含量高、叶绿素含量较低，导致其幼苗生长非常缓慢，而裂叶桦由于叶缘呈深裂，与对照(欧洲白桦)比较也是生长缓慢的弱势苗木，故此，筛选培育裂叶紫雨桦更是难上加难。

为了提高杂交种子的成苗率、避免幼苗生长缓慢导致的苗期立枯病等病害发生，试验对育苗基质进行灭菌处理：

①移栽基质的准备：按草炭土：河沙：黑土＝5：3：2的比例混均匀制备后，装入耐高温的塑料袋中(草炭土的成分：3wt％的N肥，2wt％的P

②分别将培养皿中培养的幼苗，用镊子取出播种到育苗盘中，每孔播种1株，播种后将育苗盘放到置于28±2℃的培养室中进行培养(光照16h/黑暗8h，光照强度为7000lx)，期间每隔3天喷施0.1wt％的多菌灵，30天后即可搬到塑料棚中进行常规管理。

(3)裂叶紫雨桦的创制

待苗木长出4-5叶时，根据叶色及叶型调查结果发现，1516家系的幼苗中发现了1株叶片既表现裂叶又呈现紫色的裂叶紫雨桦(图1)。

7月初，将发现的该株裂叶紫雨桦及正常叶紫雨桦(叶型如图3所示)分别移栽至直径为21cm的花盆中(图2)，于8月1日开始，9月15日结束，每15d测定1次，测定发育良好的功能叶片，避开叶脉。采用ACM–200plus花青素仪(Opti-Science,America)测量花青素相对含量，采用便携式叶绿素测定仪测定叶绿素相对含量，采用CR–400色差仪(Minolta,Japan)测定叶色参数L*值和a*值，其中，L*表示明度，+表示偏亮，-表示偏暗；a*表示红绿饱和度，+表示偏红，-表示偏绿。

花青素相对含量测定显示，在8月初至9月初的生长发育期间，裂叶紫雨桦始终低于正常叶紫雨桦，到了9月15日二者花青素相对含量相同，均值为41(图4)；叶色参数L*值测定结果显示，4个时期均是裂叶紫雨桦叶色亮度高于正常叶紫雨桦(图5)；而a*值测定显示，在8月中旬之后，裂叶紫雨桦叶色更加偏红，同时这段时间其叶绿素相对含量(SPAD值)低于正常叶紫雨桦(图6、图7)。在株高方面，裂叶紫雨桦的生长不如正常叶紫雨桦，9月中旬二者均停止生长，此时，裂叶紫雨桦株高仅为47.5cm，而正常叶紫雨桦株高均值为65.59cm(图8)。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。