黑茶多糖在制备抗压产品中的应用

技术领域

本发明涉及植物提取技术领域，更具体地说，涉及黑茶多糖在制备抗压产品中的应用。

背景技术

黑茶是一种独特的后发酵茶，产于中国的许多地区。黑茶制茶工艺一般包括杀青、揉捻、渥堆和干燥四道工序，其中渥堆是黑茶加工中的特有工序，也是形成黑茶品质的关键性工序。经过渥堆工序，使叶内的活性物质发生一系列复杂的化学变化，以形成黑茶特有的色、香、味。根据地域分布，黑茶主要分类为湖南黑茶、湖北青砖茶、四川藏茶、云南黑茶、广西六堡茶等等。

黑茶中富含多种活性物质，包括茶多糖、茶多酚、茶氨酸以及一些矿质元素。茶多糖(Tea Polysaccharides，TPS)是茶叶中一类与蛋白质结合在一起的酸性多糖或一种酸性糖蛋白。黑茶在发酵加工和储藏的过程中，黑茶中的微生物能分泌大量纤维素酶，分解黑茶中的纤维素产生水溶性多糖，故黑茶中水溶性多糖含量要高于其他茶类，比如绿茶和红茶。同时由于微生物分泌多种酶的联合作用，使黑茶多糖水解成易吸收、药理活性强和分子链长度较短的肽链和糖链。也正是因为黑茶独特的多糖特性，根据最新的研究报道，黑茶多糖具有一定的减脂、抗氧化、抗肿瘤等药理功效。

压力，任何环境或物理作用力、引发机体的反应。皮肤也有类似“下丘脑-垂体-肾上腺轴”的生理路径：作为神经元，皮肤细胞在生理条件(情感压力)或物理压力(UV等)会生成CRH、POMC、ACTH、β-内啡肽和皮质醇。其中，皮质醇会抑制角质形成细胞和成纤维细胞的增殖，从而阻止皮肤角质层更新。皮质醇还会通过下调炎症因子含量减轻了皮肤的屏障作用，在老化的皮肤中具有更高的表达量。β-内啡肽则与皮质醇介导了角质形成细胞的迁移和分化，促进伤口的愈合以及抑制炎症因子分泌的作用。因此，可以通过检测活性物对皮肤细胞皮质醇的抑制以及内啡肽的释放，来判断该活性物对皮肤压力的缓解是否具有效果。

然而，目前还没有关于黑茶多糖与压力的相关研究报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供黑茶多糖在制备抗压产品中的应用，本发明提供的黑茶多糖，能够有效缓解环境或物理产生的压力。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

黑茶多糖在制备抗压产品中的应用。

在本发明中，所述黑茶多糖的分子量＞30kD，更优选＞100kD。

本发明的黑茶多糖的糖苷键连接方式为α型和β型，分子量＜10kD和30～100kD的黑茶多糖具有三螺旋结构

在本发明中，所述抗压产品优选为化妆品；

化妆品优选为化妆水、乳液、肌底液、精华、面膜、防晒霜、面霜、眼霜、手霜或身体乳霜；面膜优选为贴片式面膜或涂抹式面膜；精华优选为精华水、精华油。

经过本发明实验例证实，相较于黑茶提取物和白茶提取物，分子量＞30kD的黑茶多糖同时具有抑制皮肤细胞中皮质醇的合成又具有促进β-内啡肽的释放的作用，因此，黑茶多糖可作为皮肤压力舒缓的化妆品原料进行应用。

本发明还提供了黑茶多糖在制备抑制细胞分泌皮质醇的产品中的应用。

在本发明中，所述黑茶多糖的分子量优选＞10kD，再优选为10～100kD，更优选为10～30kD。

在本发明中，黑茶多糖的糖苷键连接方式为α型和β型。

在本发明中，所述产品优选为化妆品；

化妆品优选为化妆水、乳液、肌底液、精华、面膜、防晒霜、面霜、眼霜、手霜或身体乳霜；面膜优选为贴片式面膜或涂抹式面膜；精华优选为精华水、精华油。

在本发明中，所述细胞优选为皮肤细胞，进一步优选为角质细胞，更优选为Hacat细胞。

经过本发明实验例证实，相较于黑茶提取物和白茶提取物，黑茶多糖能够抑制皮肤细胞中皮质醇的合成，其中，分子量为10～30kD的黑茶多糖抑制皮肤细胞中皮质醇的合成的效果最好。

在本发明中，所述黑茶多糖的制备方法包括：

(1)将黑茶与提取溶剂混合，得到黑茶提取液；

(2)对黑茶提取液依次进行醇沉、精制，得到黑茶多糖。

本发明的分子量＞30kD的黑茶多糖的制备方法包括：使用截留分子量为30kD的分离装置对所述黑茶多糖进行分离，取过滤液。

本发明的分子量10～100kD的黑茶多糖的制备方法包括：使用截留分子量为100kD的分离装置对所述黑茶多糖进行分离，取截留液，再用截留分子量为10kD的分离装置对所述截留液进行分离，取过滤液。

将黑茶与提取溶剂混合，得到黑茶提取液；优选将黑茶粉与提取溶剂混合；黑茶粉优选过60～80目筛，再优选过80目筛；所述黑茶和提取溶剂的质量比为1:(25～30)，优选为1：25；提取溶剂优选为水；所述混合的温度为80～100℃，再优选为80℃，时间为60～80min，再优选为60min。

在本发明的一个实施例中，将黑茶与提取溶剂经过混合后，固液分离，得到滤渣和第一滤液，将滤渣与提取溶剂混合，固液分离，得到第二滤液，将第一滤液和第二滤液混合，得到黑茶提取液。

黑茶与提取溶剂混合前，优选对黑茶进行干燥；干燥的温度优选为50～60℃，再优选为50℃，时间优选为15～20min，再优选为20min。

采用乙醇进行所述醇沉；所述醇沉的温度为4℃，时间为20～30h。

在所述醇沉前，优选将黑茶提取液进行浓缩，得到黑茶浓缩液；所述黑茶浓缩液和黑茶提取液的体积比为1:(5～10)，优选为1:10；浓缩的温度优选为60～65℃，再优选为65℃；黑茶浓缩液和乙醇的体积比为1:(3～5)，再优选为1:(3～4)，更优选为1：4。

在本发明的一个实施例中，得到黑茶提取液后，将其减压浓缩，得到黑茶浓缩液，对黑茶浓缩液进行醇沉，体系出现沉淀后离心收集，离心的转速优选为8000r/min，时间优选为6min；醇沉得到的沉淀物优选进行冷冻干燥；冷冻干燥的时间优选为72h；在冷冻干燥前，优选用乙醇清洗所述沉淀物。

所述精制包括：将醇沉后的沉淀物与有机溶剂混合，固液分离，收集精制沉淀物；所述有机溶剂优选为乙醇、丙酮，再优选为乙醇；优选地，对所述精制沉淀物进行冷冻干燥；在冷冻干燥前，优选用有机溶剂清洗所述精制沉淀物。优选地，所述精制的次数≥2。精制2次以上可除去一些醇沉后变性的茶蛋白和一些不溶性的色素和杂质等。

在本发明的一个实施例中，采用超滤离心管进行所述分离；离心的转速优选为3800r/min，时间优选为30min。

在本发明的一个实施例中，将所述精制沉淀物与溶剂混合，配置成黑茶多糖溶液，将所述黑茶多糖溶液进行所述分离；黑茶多糖溶液的质量浓度优选为2％；溶剂优选为水。

本发明还提供了黑茶多糖在制备促进细胞分泌内啡肽的产品中的应用。

在本发明中，所述黑茶多糖的分子量＞30kD。

在本发明的一个实施例中，所述黑茶多糖的分子量为30～100kD。分子量为30-100kD的黑茶多糖具有三螺旋结构。

在本发明的一个实施例中，所述黑茶多糖的分子量＞100kD。

在本发明中，黑茶多糖的糖苷键连接方式为α型和β型。

在本发明中，所述产品优选为化妆品；

化妆品优选为化妆水、乳液、肌底液、精华、面膜、防晒霜、面霜、眼霜、手霜或身体乳霜；面膜优选为贴片式面膜或涂抹式面膜；精华优选为精华水、精华油。

在本发明中，所述细胞优选为皮肤细胞，进一步优选为角质细胞，更优选为Hacat细胞。

经过本发明实验例证实，相较于黑茶提取物和白茶提取物，分子量＞30kD的黑茶多糖能够促进β-内啡肽的释放的作用，其中，分子量＞100kD的黑茶多糖促进β-内啡肽释放的效果最好。

在本发明中，所述黑茶多糖的制备方法包括：

(1)将黑茶与提取溶剂混合，得到黑茶提取液；

(2)对黑茶提取液依次进行醇沉、精制，得到黑茶多糖。

本发明的分子量＞30kD的黑茶多糖的制备方法包括：使用截留分子量为30kD的分离装置对所述黑茶多糖进行分离，取过滤液。

将黑茶与提取溶剂混合，得到黑茶提取液；优选将黑茶粉与提取溶剂混合；黑茶粉优选过60～80目筛，再优选过80目筛；所述黑茶和提取溶剂的质量比为1:(25～30)；提取溶剂优选为水；所述混合的温度为80～100℃，再优选为80℃，时间为60～80min，再优选为60min。

在本发明的一个实施例中，将黑茶与提取溶剂经过混合后，固液分离，得到滤渣和第一滤液，将滤渣与提取溶剂混合，固液分离，得到第二滤液，将第一滤液和第二滤液混合，得到黑茶提取液。

黑茶与提取溶剂混合前，优选对黑茶进行干燥；干燥的温度优选为50～60℃，再优选为60℃，时间优选为15～20min，再优选为15min。

采用乙醇进行所述醇沉；所述醇沉的温度为4℃，时间为20～30h。

在所述醇沉前，优选将黑茶提取液进行浓缩，得到黑茶浓缩液；所述黑茶浓缩液和黑茶提取液的体积比为1:(5～10)，优选为1:10；浓缩的温度优选为60～65℃，再优选为65℃；黑茶浓缩液和乙醇的体积比为1:(3～5)，再优选为1:(3～4)。

在本发明的一个实施例中，得到黑茶提取液后，将其减压浓缩，得到黑茶浓缩液，对黑茶浓缩液进行醇沉，体系出现沉淀后离心收集，离心的转速优选为8000r/min，时间优选为6min；醇沉得到的沉淀物优选进行冷冻干燥；冷冻干燥的时间优选为72h；在冷冻干燥前，优选用乙醇清洗所述沉淀物。

所述精制包括：将醇沉后的沉淀物与有机溶剂混合，固液分离，收集精制沉淀物；所述有机溶剂优选为乙醇、丙酮，再优选为乙醇；优选地，对所述精制沉淀物进行冷冻干燥；在冷冻干燥前，优选用有机溶剂清洗所述精制沉淀物。优选地，所述精制的次数≥2。精制2次以上可除去一些醇沉后变性的茶蛋白和一些不溶性的色素和杂质等。

在本发明的一个实施例中，采用超滤离心管进行所述分离；离心的转速优选为3800r/min，时间优选为30min。

在本发明的一个实施例中，将所述精制沉淀物与溶剂混合，配置成黑茶多糖溶液，将所述黑茶多糖溶液进行所述分离；黑茶多糖溶液的质量浓度优选为2％；溶剂优选为水。

本发明提供的黑茶多糖可作为抗压活性成分广泛应用于各类抗压产品中，特别是作为皮肤压力舒缓的化妆品原料进行应用，可缓解由工作压力、熬夜、电脑辐射以及负面情绪等引起的压力肌问题，由内而外的改善肤质，让肌肤重新饱满透亮。经过本发明实验例证实，相较于黑茶提取物和白茶提取物，分子量＞30kD的黑茶多糖同时具有抑制皮肤细胞中皮质醇的合成和促进释放β-内啡肽的作用。

附图说明

图1是本发明的葡萄糖的标准曲线；

图2是不同分子量的黑茶多糖的红外光谱图；

图3是不同分子量的黑茶多糖的刚果红染色实验图；

图4是不同分子量的黑茶多糖及黑茶、白茶提取物对于皮质醇的抑制作用图；

图5是不同分子量的黑茶多糖及黑茶、白茶提取物对于β-内啡肽的促进分泌作用图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了进一步说明本发明，下面通过以下实施例进行详细说明。本发明以下实施例所用的原料均为市售商品。

1.1葡萄糖标准曲线绘制

(1)葡萄糖标准溶液配制：精密称量经过干燥的无水葡萄糖10mg置于烧杯中，加入50mL超纯水使之溶解完全。冷却后移入100mL容量瓶中，继续加入超纯水定容至刻度线，得到浓度为100μg/mL的葡萄糖标准溶液。

(2)蒽酮-硫酸溶液配制：准确称量0.1g蒽酮试剂，加入事先配制好的浓度为80％的100mL浓硫酸水溶液中，待冷却完全后，置于棕色瓶中备用，整个过程中注意避光。

(3)标准曲线绘制

用移液枪分别精密吸取0.0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL的葡萄糖标准溶液，置于10mL具塞试管中，用超纯水补齐至2mL。然后再加入6mL的蒽酮-硫酸溶液，混合均匀后，迅速盖紧具塞试管盖。将具塞试管放入沸水中加热15min后，再放入冰水中冷却10min。冷却后恢复至室温，酶标仪625nm。以吸光度值为纵坐标Y，葡萄糖标准溶液浓度为横坐标X，绘制葡萄糖标准曲线。

1.2实施例黑茶多糖的提取与制备

本发明中所使用黑茶的产地来源于湖南省益阳市安化县。

(1)提取：将黑茶置于50℃烘箱干燥20min后，使用中药粉碎机粉碎并过80目筛，得到黑茶粉末。称取一定质量的黑茶粉末加入纯水作为提取溶剂，固液比为1:25；然后置于80℃的油浴锅中提取60min后，利用圆形滤纸抽滤，滤液备用；滤渣再次加入纯水，按照上述条件进行重复提取1次后，再经圆形滤纸抽滤，合并两次提取滤液备用，再经60℃减压浓缩至100mL。黑茶浓缩液加入3～4倍体积的无水乙醇进行醇沉，搅拌均匀后，放置于4℃冰箱中冷藏静置过夜。24h后，离心(8000r/min，6min)收集沉淀，使用无水乙醇反复清洗2次。离心并收集沉淀，放入冷冻干燥机中干燥72h成粉，即得黑茶多糖粉末。

(2)纯化：将步骤(1)提取制备的黑茶多糖粉末，按照1:100的质量比加入纯水，对黑茶多糖粉末进行复溶，可通过搅拌和低温超声处理加快黑茶多糖的溶解速度，确保黑茶多糖溶解完全。将该黑茶多糖溶液置于高速冷冻离心机(转速为10000r/min)中离心10min，得上清液后，加入4倍体积的无水乙醇进行醇沉，搅拌均匀后，置于4℃冰箱中冷藏静置过夜。24h后，离心(8000r/min，6min)收集沉淀，无水乙醇反复清洗2次并离心收集沉淀，冷冻干燥制得黑茶多糖粉末。按照以上操作，重复操作2次即可除去一些醇沉后变性的茶蛋白和一些不溶性的色素和杂质等。

(3)分离：将步骤(2)制备的黑茶多糖粉末溶于纯水中，配制质量浓度为2％的多糖溶液。使用截留分子量100KD规格的超滤离心管对黑茶多糖溶液进行离心(3800r/min，30min)，收集分子量大于100KD的多糖截留液。收集透过液再过截留分子量30KD的超滤离心管，收集分子量在30～100KD的多糖。再将透过液过截留分子量10KD的超滤离心管，即可得分子量小于10KD以及10～30KD的黑茶多糖。将利用以上操作获得的不同分子量的黑茶多糖进行冻干处理得到粉末，密封保存冷藏备用。

对比例

黑茶和白茶提取物的制备方法：(参考实施例中黑茶多糖的提取步骤的方法)将黑茶粉末、白茶粉末置于50℃烘箱干燥20min后，使用中药粉碎机粉碎并过80目筛，得到黑茶、白茶粉末。分别称取一定质量的黑茶、白茶粉末加入纯水作为提取溶剂，固液比为1:25；然后置于80℃的油浴锅中提取60min后，利用圆形滤纸抽滤，滤液备用；滤渣再次加入纯水，按照上述条件进行重复提取1次后，再经圆形滤纸抽滤，合并两次提取滤液，再经60℃减压浓缩至干；最后置于冻干机中，冻干处理得到黑茶、白茶提取物粉末。

1.3不同分子量黑茶多糖的结构分析

1.3.1不同分子量黑茶多糖红外光谱分析分析

(1)实验过程：采用固体红外测试方法即KBr压片法，将1.2中制备的不同分子量的黑茶多糖在傅里叶红外扫描仪中测定，FT-IR数据范围为500cm

1.3.2刚果红实验

(1)实验过程：

①刚果红工作液的配置：

取适量刚果红加水溶解，配置成浓度为200μM刚果红工作液。放置4℃冰箱备用。

②NaOH母液的配置：

称取适量NaOH于试管中，加水溶解，配置成浓度为10M的NaOH母液。放置4℃冰箱备用。

③样品溶液的配制：

分别称取适量的不同分子量的黑茶多糖(1.2制得)于不同试管中，加水溶解，使终浓度为1mg/mL。放置4℃冰箱备用。

④样品检测：

分别取1mL的不同分子量的黑茶多糖溶液于不同试管中，再加入1mL的刚果红工作溶液与其混合，混合均匀后添加适量的NaOH母液，使其在溶液中最终的浓度梯度为：0M、0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M。最后使用紫外分光光度计检测其在300-600nm的紫外吸收峰值。

1.4解压模型测试，筛选出功效最佳分子量黑茶多糖

1.4.1不同分子量的黑茶多糖对Hacat细胞(人永生化角质形成细胞)中皮质醇的抑制作用效果

1、培养基及溶液配制

(1)DMEM完全培养基：向DMEM培养基中加入FBS10％/双抗1％

(2)LPS：以1×PBS缓冲液为稀释液，配制1mg/ml的LPS溶液

2、供试样品对HaCat细胞分泌Cortisol(皮质醇)的影响

(1)细胞接种：将HaCat细胞按10000个/孔接种于96孔板，置于37℃，5％CO

(2)实验分组：设置阴性对照组(NC)、激动剂阳性对照组、抑制剂阳性对照组(PC)和样品组(黑茶多糖、黑茶提取物、白茶提取物由1.2中的方法制得)。

(3)皮质醇转化反应：将50mM的Cortisone溶液稀释至100μM，按50μl/孔加至孔板中，待测样品稀释与加样：以完全培养基为稀释液，按照样品试验浓度表配制不同浓度的样品工作液，加50μl/孔，共100μl/孔反应体系。阴性对照组加等量完全培养基，激动剂阳性对照组加100μM的Cortisone 100μl/孔，抑制剂阳性对照组加200μM的Metyrapone，置于37℃，5％ CO

(4)取孔板中的上清，通过ELISA法检测cortisol含量，操作步骤如下：

A预先计算好所需的酶标条，实验前30min拿出试剂盒，恢复至室温B标准品梯度稀释：用标准品&样品稀释液将标准品倍比稀释为200，100，50，12.5，0ng/mL

C收集细胞培养上清液到无菌离心管中，离心(4℃，1000×g，20min)，取上清后，不需要检测样本

D各反应孔中加入50μl标准品工作液及检测样本，各组均设2个复孔，后向各反应孔中加入50μl生物素标记cortisol抗体工作液至反应孔，共100μl反应体系，于37℃孵箱孵育45min

F弃去液体，甩干，各反应孔中加入300μl洗涤液，浸泡1-2min后甩干。重复4次

G各反应孔中加入100μlHRP标记链霉亲和素工作液至反应孔中，于37℃孵箱孵育30min

H各反应孔中加入300μL洗涤液，间隔30s，甩干洗涤液。重复4次

I各反应孔中加入90μL显色剂至反应孔中，于37℃避光显色15min左右

J各反应孔中加入50μL终止液，即刻用酶标仪450nm波长下测量OD值，OD值与Cortisol含量成反比

K根据标准品的已知浓度和所测OD值通过ELISA Calc软件回归拟合曲线(R

1.4.2不同分子量的黑茶多糖对Hacat细胞(人永生化角质形成细胞)中β-内啡肽的作用效果

1、培养基及溶液配制

(1)DMEM完全培养基：向DMEM培养基中加入FBS10％/双抗1％

(2)LPS：以1×PBS缓冲液为稀释液，配制1mg/ml的LPS溶液

2、供试样品对HaCat细胞分泌β-内啡肽(β-EP)的影响

(1)细胞接种：将HaCat细胞按10000个/孔接种于96孔板，置于37℃，5％CO

(2)实验分组：设置阴性对照组(NC)、激动剂阳性对照组、样品组(黑茶多糖、黑茶提取物、白茶提取物由1.2中的方法制得)。

(3)β-内啡肽释放反应：将100mM的Bacladesine calcium溶液稀释至80μM，按100μl/孔加至孔板中，待测样品稀释与加样：以完全培养基为稀释液，按照样品试验浓度表配制不同浓度的样品工作液，加100μl/孔，共100μl/孔反应体系。阴性对照组加等量完全培养基，激动剂阳性对照组加80μM的Bacladesine calcium100μl/孔，置于37℃，5％ CO

(4)取孔板中的上清，通过ELISA法检测β-内啡肽含量，操作步骤如下：

A预先计算好所需的酶标条，实验前30min拿出试剂盒，恢复至室温

B标准品梯度稀释：用标准品&样品稀释液将标准品倍比稀释为200，100，50，12.5，0ng/mL

C收集细胞培养上清液到无菌离心管中，离心(4℃，1000×g，20min)，取上清后，

D各反应孔中加入50μl标准品工作液及检测样本，各组均设2个复孔，后向各反应孔中加入50μl生物素标记β-内啡肽抗体工作液至反应孔，共100μl反应体系，于37℃孵箱孵育45min

F弃去液体，甩干，各反应孔中加入300μl洗涤液，浸泡1-2min后甩干。重复4次

G各反应孔中加入100μlHRP标记链霉亲和素工作液至反应孔中，于37℃孵箱孵育30min

H各反应孔中加入300μL洗涤液，间隔30s，甩干洗涤液。重复4次

I各反应孔中加入90μL显色剂至反应孔中，于37℃避光显色15min左右

J各反应孔中加入50μL终止液，即刻用酶标仪450nm波长下测量OD值，OD值与β-内啡肽含量成反比

K根据标准品的已知浓度和所测OD值通过ELISA Calc软件回归拟合曲线(R

1.4.3统计分析

采用GraphPad Prism8.0软件进行数据统计分析并绘制图表，计量资料以x±s表示，组间差异采用one-way ANOVA分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义

2.1葡萄糖标准曲线

根据1.1的步骤绘制葡萄糖的标准曲线，如图1所示。所测得的数据经过回归分析，以吸光度值为纵坐标(Y)，葡萄糖质量为横坐标(X)，得到回归方程为：Y＝0.0023X+0.0019，R

2.2不同分子量的黑茶多糖质量分布比

对1.2制得的不同分子量的黑茶多糖进行处理，可得到黑茶多糖质量分布如下所示：

表1.不同分子量的黑茶多糖质量分布比

由表1可知，黑茶多糖中分子量大于100kD的多糖约占50％；在分子量小于100kD的多糖中，分子量小于10kD的黑茶多糖占有较大比重，约为36％；10～100kD占比最低，共计约14％。由此可见，黑茶多糖不仅富含大分子量多糖，也富含较为丰富的小分子量多糖，这可能是由于黑茶中微生物的水解以及独特的发酵工艺，在储藏过程中促进了大分子量多糖水解成更小分子量的黑茶多糖。

2.3不同分子量的黑茶多糖结构分析

2.3.1红外光谱分析结果

实验结果如图2所示，四种分子量的黑茶多糖的特征吸收峰大致相同：3334.45cm

2.3.2刚果红实验结果

刚果红是一种常用的生物染色剂，溶于水时呈现黄红色。在水溶液或者弱碱性溶液中，可与三螺旋结构的多糖形成一种络合物，使最大吸收波长发生了红移。当溶液中的NaOH浓度大于某一数值时，三螺旋结构遭到破坏，最大吸收波长急剧下降。

实验结果如图3所示，与空白对照组相比，在浓度为0.1M的NaOH溶液中，分子量小于10KD的黑茶多糖溶液和分子量30-100KD的黑茶多糖溶液的最大吸收波长均发生红移，紫外吸收移向长波；当NaOH浓度继续增大时，最大紫外吸收波长逐渐下降，表明分子量小于10KD的黑茶多糖和分子量30-100KD的黑茶多糖与刚果红形成络合物，具有三螺旋结构。而其他分子量的黑茶多糖溶液最大吸收波长没有发生红移现象，因此不具有三螺旋结构。

2.4解压模型测试，对比黑茶多糖与其他茶提取物解压功效差异

2.4.1不同分子量的黑茶多糖及黑茶、白茶提取物对Hacat细胞(人永生化角质形成细胞)中皮质醇(Cortisol)的抑制作用效果

通过ELISA检测各组压力指标Cortisol含量，通过ELISA Calc软件回归拟合曲线根据实验结果得到标曲R

2.4.2不同分子量的黑茶多糖及黑茶、白茶提取物对Hacat细胞(人永生化角质形成细胞)中β-内啡肽的促进分泌效果

通过ELISA检测各组压力指标β-内啡肽含量，通过ELISA Calc软件回归拟合曲线根据实验结果得到标曲:R2＝0.99718，根据标曲的吸光度反推β-内啡肽含量。由图5可以看出，与阴性组对比来看，30KD以下分子量的黑茶多糖基本上没有促进β-内啡肽合成的效果，30KD以上分子量的黑茶多糖与阴性组相比具有显著促进β-内啡肽合成的效果；同时黑茶提取物和白茶提取物均不具有促进β-内啡肽合成的效果。图5中，**代表与阴性组对比，具有强显著性差异；*代表与阴性组对比，具有显著性差异；NS代表与阴性组相比，无显著性差异；试验样品浓度为500μg/mL。

2.4.3总结

综合皮质醇和β-内啡肽实验结果可以看出，当黑茶多糖分子量在大于30KD时，同时具有抑制皮肤细胞中皮质醇的合成又具有促进β-内啡肽的释放的作用，其中大于100KD的黑茶多糖的作用效果更优。同时，分子量在30-100KD的黑茶多糖具有三螺旋结构，具有更高的生物活性，因此大于30KD的黑茶多糖可作为皮肤压力舒缓的化妆品原料进行应用。

所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。