一种利用海藻酸钠加速中性粒细胞胞外诱捕网降解的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及利用海藻酸钠诱导中性粒细胞胞外诱捕网发生固-液相变，从而加速其降解/溶解的方法。

背景技术

当中性粒细胞经病原体、化学诱导剂、等离子辐照等刺激激活后，自身核膜会发生裂解，并释放富含DNA的网状物质—中性粒细胞胞外诱捕网(Neutrophil ExtracellularTraps,NETs)。NETs是细胞染色质释放到胞外后的特殊形态，它主要由DNA纤维、组蛋白以及其他多种抗菌蛋白酶构成。在生物体内，NETs的一般生理功能是参与宿主的非特异性免疫防御机制，捕获多种病原体并抑制其增殖、体内传播。但对于某些免疫缺陷病人而言，NETs在体内过量释放或者代谢速度过慢时，都可能导致免疫失调疾病，包括上皮/内皮组织损伤、深静脉炎、银屑病、败血症、凝血异常、脓毒血症、类风湿关节炎等，可减缓糖尿病人伤口愈合，加剧慢性阻塞肺病人、系统性红斑狼疮病人症状，甚至加速癌细胞激活和转移。

为治疗NETs过量引起的免疫失调，目前临床上主要通过两种方式控制体内NETs的水平。一是使用激素类药物抑制NETs释放，但药物本身也会影响机体正常的免疫功能；二是通过使用核酶来降解胞外DNA，从而达到加速NETs溶解的效果。常用的核酶包括I型DNA酶、rhDNA酶等，但这些核酶在体内的降解周期短，易失活，并且核酶降解NETs后会释放大量游离抗菌蛋白，可能对机体正常的细胞和组织造成损伤。此外，核酶对于系统性红斑狼疮病人的NETs清除效果有限，这是由于自主性抗体与DNA结合后干扰核酶发挥作用。因此，需要设法找到降解NETs的新方法，从而缓解或消除由NETs过量造成的免疫失调疾病。

组蛋白不仅是NETs中的主要蛋白，也参与构成NETs的染色质骨架。研究表明，当生理环境发生某些特殊变化时，染色质可通过液-液相分离机制转化为液滴状形态。根据上述现象及机制，通过调控NETs所处的生理环境可诱导其发生固-液转化，从而加速NETs的溶解。

诱导NETs发生固-液转化的主要因素包括：溶液环境中的配体、无机盐离子种类及浓度等。因此，寻找组蛋白合适的配体使其发生凝聚化相转变，并通过优化相变发生的溶液环境可达到加速NETs溶解的目标。

发明内容

本发明针对现有技术中的不足，目的是提供一种利用海藻酸钠加速降解/消融过量NETs的方法。

为达到上述目的，本发明的解决方案是：

一种海藻酸钠降解NETs的调控方法，包括如下步骤：

(1)将一定浓度中低分子量的海藻酸钠溶液与NETs按照一定比例混合后孵育，使NETs中的组蛋白与海藻酸钠形成液滴状的复合凝聚体；

(2)用无机盐溶液调控液滴状的复合凝聚体的形成，得到组蛋白/海藻酸钠复合凝聚体；

(3)将组蛋白/海藻酸钠复合凝聚体用阴离子表面活性剂洗涤，从而将NETs中的DNA释放，加速NETs的溶解。

进一步地，步骤(1)中，NETs包括但不限于佛波酯诱导中性粒细胞产生的NETs、细胞凋亡或坏死后产生的染色质、细菌感染造成的中性粒细胞凋亡释放的网状结构的DNA/组蛋白复合物、痛风病人关节腔内异常形成的NETs、以及通过生化合成手段制备的具有NETs仿生结构的DNA/组蛋白复合物。

步骤(1)中，当使用海藻酸钠作为NETs中组蛋白的配体、并在无机盐存在时，可将NETs转化为液滴状的凝聚体。由于液态凝聚体相较于NETs固体网络具有更好的流动性，因此可通过清洗、抽空液体等方式予以去除。

进一步地，步骤(1)中，海藻酸钠的分子量范围为0.5-50万，其1％的水溶液粘度为2-100mPa·S。

进一步地，步骤(1)中，海藻酸钠与NETs中组蛋白的质量比为1:5-5:1，通过无机盐使得混合物的悬浊液呈表面电中性，表面电势在(-15)-15mV之间。

进一步地，步骤(2)中，无机盐溶液选自1-200mM的可溶性硫酸镁、氯化镁、硫酸钠、氯化钠或氯化钙中的一种或几种混合物。

进一步地，步骤(3)中，阴离子表面活性剂选自十二烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠、聚丙烯酰胺、α-磺基酸脂肪酸甲酯，浓度范围为0.001-1％。

本发明的关键点；

1.提出利用海藻酸钠作为配体与NETs中的组蛋白结合，通过形成液态凝聚层来加速NETs降解或溶解。

2.通过使用硫酸镁等无机盐溶液来调配海藻酸钠/组蛋白形成凝聚层，使用阴离子表面活性剂清除海藻酸钠/组蛋白凝聚层，这为NETs的溶解提供了有利的溶液环境及药物配方。

由于采用上述方案，本发明的有益效果是：

本发明揭示海藻酸钠可作为组蛋白的配体来诱导NETs发生固-液型转变，从而易于通过进一步洗涤、液体抽干等方式将过量NETs彻底清除，从而缓解或治疗NETs介导的多种炎症反应。该方法操作简单、生物副作用小，并可与传统方法配合使用，达到加速清除NETs的效果。

附图说明

图1为本发明的海藻酸盐诱导DNA/组蛋白复合物发生液-液相分离图(a)明场下的附着态DNA/组蛋白复合物，b)荧光信号下的附着态DNA/组蛋白复合物，c)明场下的海藻酸钠处理后的DNA/组蛋白复合物，d)荧光信号下的海藻酸钠处理后的DNA/组蛋白复合物，e)为d)的共聚焦电子显微镜图像)。

具体实施方式

1.中性粒细胞胞外诱捕网(简称NETs)的提取

取外周血5mL，缓慢加入到5mL Polymorphprep

2.DNA/组蛋白复合物的制备

96孔板的每孔中心滴加0.2-0.6mg/mL的DNA溶液，在干燥器中真空干燥24h后加入0.2-2mg/mL的组蛋白溶液使DNA薄膜水化，孵育2-4h后，形成较厚的纤维状附着态DNA/组蛋白复合物。

3.DNA/组蛋白复合物液-液相分离的表征

在96孔板中制备DNA/组蛋白复合物，用绿色荧光标记的组蛋白进行水化，经洗涤后在含有DNA/组蛋白复合物的孔中加入不同浓度的海藻酸盐溶液，分别在在荧光电子显微镜和共聚焦电子显微镜下观察DNA/组蛋白复合物的形貌变化及液-液相分离的形成，如图1所示。

4.海藻酸钠诱导DNA/组蛋白复合物液-液相分离的条件探究

探索组蛋白、海藻酸钠和盐离子的浓度对液滴形成的影响，并绘制相图。由于盐离子的加入会影响DNA/组蛋白复合物的Zeta电位值，使用Zeta电位分析仪测量液滴混合液或其单独成分的Zeta电位。

5.海藻酸钠降解DNA/组蛋白复合物动力学表征

在96孔板中制备DNA/组蛋白复合物，加入一定量的海藻酸钠及盐离子使其形成液滴，用不同的阴离子表面活性剂进行洗涤，测量游离DNA含量。

6.利用NETs的液-液相分离规律对NETs进行消融

将NETs溶液滴加在96孔板中央通过干燥制成附着态NETs，用一定量的海藻酸钠及无机盐溶液水化观察NETs的形态变化。

实施例1：

配制0.2mg/mL的DNA溶液，在96孔板(组织培养处理，BWTC)的每孔中心点取10μL的DNA溶液，在真空干燥箱中干燥24h，随后加入1mg/mL异硫氰酸荧光素标记的组蛋白溶液，37℃孵育2h后形成附着态DNA/组蛋白复合物。用去离子水洗去未反应的组蛋白后加入1mg/mL分子量为2-5万的海藻酸钠溶液(其1％水溶液黏度为3-5mPa·S)及100mM的MgCl

实施例2：

取外周血5mL，缓慢加入到5mL Polymorphprep

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。