荆防制剂HPLC指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱

技术领域

本发明属于中药制剂分析领域，涉及一种荆防制剂HPLC指纹图谱的建立方法及其指纹图谱。

背景技术

荆防颗粒和荆防合剂由荆芥、防风、羌活、独活、柴胡、前胡、川芎、枳壳、茯苓、桔梗、甘草11味中药制成，组方源于《太平惠民和剂局方》中的人参败毒散，是古代抗疫第一方。荆防制剂具有发汗解表，散风祛湿的功效；用于风寒感冒，头痛身痛，恶寒无汗，鼻塞清涕，咳嗽白痰。方中君药荆芥、防风辛、温，药对功能发汗、解表散风；臣药羌活、独活苦甘、平、微温，药对功能通治一身寒湿疼痛；佐药柴胡、前胡、川芎、枳壳、茯苓、桔梗能行气、宣肺、祛痰；甘草甘平，缓和药性，调和诸药；诸药配合，共奏发汗、解表、散风、祛湿之功，临床常用于普通感冒风寒证的治疗。据古文记载，荆防对乳蛾、牙痈、乳痈、皮肤荨麻疹等病症也有奇效。

荆防颗粒和荆防合剂现执行标准为“国家药品监督管理局标准”(简称“局颁标准”)，局颁标准仅有性状、密度检查项，现有的分析方法难以有效反映药品质量，可能导致不法厂商在生产药品时不严格按照处方的剂量配料，导致药品的疗效明显下降，影响产品的安全性和有效性，严重损害患者的利益，因此急需开发一种能较为全面地反映荆防合剂质量的方法，进而对药品质量进行全面准确的评价。

中药指纹图谱作为一项质量控制与评价技术，具有系统性、整体性和稳定性特点，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，能够较为全面的控制药品的质量，因此建立中药制剂指纹图谱对于提高中药质量，促进中药现代化具有重要意义。目前尚未见以指纹图谱控制荆防颗粒或荆防合剂质量的方法，因此，亟需提供一种荆防制剂的指纹图谱的建立方法，以保证产品质量，为荆防制剂的真伪鉴别和内在质量控制提供可靠依据，为保证产品质量的稳定性及临床用药的安全性与有效性提供了一个可靠的分析方法和技术手段。

发明内容

本发明的目的是针对现有荆防合剂的质量控制方法不足，提供了一种荆防制剂HPLC指纹图谱的建立方法，该方法将荆防合剂制备成供试品溶液，经过HPLC分离检测，从而获得荆防制剂HPLC标准指纹图谱，实现全方位、多方面检测，完善其质量控制体系，进而为荆防制剂的真伪鉴别和内在质量提供可靠依据。

本发明一种荆防制剂HPLC指纹图谱的建立方法，具体技术方案如下：

Ⅰ.对照品和供试品溶液的制备：

称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、升麻素苷、阿魏酸、紫花前胡苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、羌活苷、蛇床子素对照品适量，用甲醇溶解，作为对照品溶液；

精密量取供试品适量，加入20％-50％的甲醇，超声处理，放冷，离心，滤过，取续滤液，得供试品溶液；

Ⅱ.HPLC色谱条件的确定：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相：甲醇-乙腈为流动相A，0.05％-0.2％三氟乙酸或者冰醋酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱；检测波长：280-320nm；流速：0.6-1.0mL/min；柱温：30℃；进样体积5μL；

Ⅲ.指纹图谱的制作：按步骤Ⅱ色谱条件对荆防制剂对照品和供试品溶液进行分析比较，得到由样品共有特征峰构成的荆防制剂标准指纹图谱。

优选地，所述的荆防制剂为荆防合剂或荆防颗粒。

优选地，步骤Ⅰ所述供试品溶液，按如下步骤制备：精密量取荆防合剂2mL或荆防颗粒2mg，加入50％甲醇，超声处理10-40min，放冷，离心滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

优选地，步骤Ⅱ所述流动相A中甲醇-乙腈的体积比为2∶1。

优选地，步骤Ⅱ所述梯度洗脱条件为：

优选地，步骤Ⅱ所述检测波长为300nm，流速为0.8mL/min。

本发明的另一方面是提供荆防制剂的指纹图谱，对12批制备的荆防合剂供试品溶液进行分析比较，以HPLC分离检测，使用国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》软件分析，得到由样品共有特征峰构成的荆防制剂标准指纹图谱。

通过对12批次荆防制剂的指纹图谱进行匹配，得到35个共有特征峰，以24号峰(柚皮苷)作为参照峰，确定了10个峰面积相对较大的共用峰作为荆防制剂的主要特征峰，其相对保留时间分别为0.16(6号峰)、0.27(7号峰)、0.29(8号峰)、0.53(13号峰)、0.62(15号峰)、0.80(20号峰)、1.00(24号峰)、1.10(26号峰)、1.15(27号峰)、1.34(32号峰)、1.68(35号峰)。

其中，6号峰为新绿原酸，7号峰为绿原酸，8号峰为隐绿原酸，13号峰为升麻素苷，15号峰为阿魏酸，20紫花前胡苷，24号峰为柚皮苷，26号峰为橙皮苷，27号峰为新橙皮苷，32号峰为羌活苷，35号峰为蛇床子素。

其中，6号峰、7号峰、8号峰主要为羌活和独活这一药对中共有的成分，13号峰为防风中的成分，15号峰为川芎中的成分，20号峰、32号峰为羌活中的成分，24号峰、26号峰、27号峰为枳壳中成分，35号峰为独活中的成分。

本发明的第三方面，提供所述指纹图谱在荆防颗粒或荆防合剂质量评价中的应用。

与现有技术相比，本发明的技术方案取得了以下有益技术效果：

1.本发明荆防制剂HPLC指纹图谱的建立方法精密度高、重现性好，且分离度良好，稳定性高，能较为全面、准确地评价荆防颗粒或荆防合剂的质量，可用于荆防制剂的真伪鉴别和质量过程控制，对荆防制剂的现代化生产具有良好的科学指导意义。

2.本发明检测方法以柚皮苷为参比峰，确定35个共有峰为构成荆防制剂标准指纹图谱的主要特征峰，指纹图谱的组成更加丰富、全面；从共有峰中鉴定出新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、升麻素苷、阿魏酸、紫花前胡苷、橙皮苷、新橙皮苷、羌活苷、蛇床子素10种化学成分，并对其进行成分归属，进一步阐明了荆防制剂的化学物质基础。

3.本发明指纹图谱在荆防颗粒或荆防合剂质量评价中的应用，通过对比所得标准指纹图谱中共有峰的有无，可对荆防颗粒或荆防合剂的质量进行较为全面的评价，更有效的保证成品的质量，可克服现有技术检测指标单一，不能反映荆防制剂内在质量不足的问题。

附图说明

图1为12批荆防合剂的HPLC指纹图谱叠加图；

图2为荆防制剂HPLC标准指纹图谱(1-35为35个共有特征峰)；

图3为对照品的HPLC指纹图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应当理解为以下实施例仅用于表述本发明的技术方案，而不用来限制本发明的保护范围。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，所做的显而易见的修饰及改进也属于本发明的保护范围。

实施例1荆防合剂HPLC标准指纹图谱的建立

1仪器与试药

1.1仪器

Waters Acquity Arc高效液相色谱仪(2998PDA检测器，美国)，四元超高压梯度泵，Empower色谱工作站。

1.2试药

荆防合剂由鲁南厚普制药有限公司提供，样品批号见表1。甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

表1荆防合剂测试样品批号

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：Agilent SB-C

按下表进行梯度洗脱：

2.2对照品和供试品溶液的制备

精密称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、升麻素苷、阿魏酸、紫花前胡苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蛇床子素对照品适量，用50％甲醇稀释溶解制成每1mL含56.623μg、89.214μg、78.578μg、59.564μg、46.902μg、85.834μg、21.479μg、64.564μg、42.902μg、39.479μg上述对照品的对照品溶液。

精密量取荆防合剂2mL，置10mL容量瓶中，加入50％的甲醇稀释定容，超声处理，放冷，离心，滤过，取续滤液，得供试品溶液。

2.3指纹图谱的建立

取12个批号荆防合剂样品，按“2.2”项下方法制备成供试品溶液，按“2.1”项下方法进行检测分析，得12批样品色谱叠加图(附图1)。将12个批号的荆防合剂HPLC指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)进行色谱峰匹配，拟合生成标准指纹图谱(附图2)。所得标准指纹图谱共有35个共有特征峰，以24号峰(柚皮苷)作为参照峰，计算确定10个峰面积较大的主要特征峰的相对保留时间和相对峰面积的比值，具体见表2和表3。

表2 12批荆防合剂主要特征峰的相对保留时间比值

表3 12批荆防合剂主要特征峰的相对峰面积(％)

2.4相似度评价

将12批荆防合剂的色谱图与标准指纹图谱进行对比，相似度计算结果依次为：0.991，0.993，0.994，0.995，0.997，0.998，0.996，0.996，0.999，0.999，0.999，0.992。相似度均在0.990以上，表明各样品批间质量稳定性和均一性良好。

2.5共有峰的归属与指认

取对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行分析，结果如图3所示。经对照品保留时间定位及色谱峰分析，指认出6号峰为新绿原酸，7号峰为绿原酸，8号峰为隐绿原酸，13号峰为升麻素苷，15号峰为阿魏酸，20号峰为紫花前胡苷，24号峰为柚皮苷，26号峰为橙皮苷，27号峰为新橙皮苷，35号峰为蛇床子素。

其中，6号峰、7号峰、8号峰主要为羌活和独活这一药对中共有的成分；13号峰为防风中的成分；15号峰为川芎中的成分；20号峰为羌活中的成分；24号峰、26号峰、27号峰为枳壳中成分；35号峰为独活中的成分。

2.4方法学考察

2.4.1精密度试验

取样品(批号：24521012)，按照2.2项下方法制备供试品溶液，连续进样6次，以24号峰为参照峰，计算出1-35号共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3％，同时用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.99，表明仪器稳精密度良好。

2.4.2稳定性试验

取样品(批号：24521012)，按照2.2项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、24h进样，以24号峰为参照峰，计算出1-35号共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3％，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.99，表明供试品溶液在24小时内稳定性良好。

2.4.3重复性试验

取同一批号样品(批号：24521012)，分别精密量取6份，按照2.2项下方法制备供试品溶液，分别进样，以24号峰为参照峰，计算出1-35号共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3％，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.99，表明方法重复性良好。

实施例2荆防合剂HPLC标准指纹图谱的建立

1仪器与试药

1.1仪器

Waters Acquity Arc高效液相色谱仪(美国)：2998PDA检测器，四元超高压梯度泵，Empower色谱工作站。

1.2试药

荆防合剂由鲁南厚普制药有限公司提供，样品批号见表1。甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：Agilent SB-C

按下表进行梯度洗脱：

2.2对照品和供试品溶液的制备

精密称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、升麻素苷、阿魏酸、紫花前胡苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蛇床子素对照品适量，用80％甲醇溶解稀释溶解制成每1mL含56.623μg、89.214μg、78.578μg、59.564μg、46.902μg、85.834μg、21.479μg、64.564μg、42.902μg、39.479μg上述对照品的对照品溶液。

精密量取荆防合剂2mL，置10mL容量瓶中，加入浓度80％的甲醇定容，超声处理，放冷，离心，滤过，取续滤液，得供试品溶液。

2.3指纹图谱的建立

将上述对照品和供试品溶液分别注入HPLC色谱系统，测定12个批号荆防合剂HPLC指纹图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的荆防合剂HPLC标准指纹图谱。

将12个批号的荆防合剂HPLC指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》，进行色谱峰匹配，所得到的指纹图谱有35个共有峰，其中，6号峰为新绿原酸，7号峰为绿原酸，8号峰为隐绿原酸，13号峰为升麻素苷，15号峰为阿魏酸，20紫花前胡苷，24号峰为柚皮苷，26号峰为橙皮苷，27号峰为新橙皮苷，35号峰为蛇床子素。

其中，6号峰、7号峰、8号峰主要为羌活和独活这一药对中共有的成分；13号峰为防风中的成分；15号峰为川芎中的成分；20号峰为羌活中的成分；24号峰、26号峰、27号峰为枳壳中成分；35号峰为独活中的成分。

以24号峰(柚皮苷)作为参照峰，确定了10个峰面积较大的主要特征峰的相对保留时间的比值，依次为0.16(6号峰)，0.27(7号峰)，0.29(8号峰)，0.53(13号峰)，0.62(15号峰)，0.80(20号峰)，1.00(24号峰)，1.10(26号峰)，1.15(27号峰)，1.34(32号峰)，1.68(35号峰)。

12批荆防合剂与标准指纹图谱相似度计算结果依次为：0.990，0.993，0.994，0.995，0.997，0.996，0.996，0.997，0.999，0.999，0.999，0.993。

实施例3荆防颗粒HPLC标准指纹图谱的建立

1仪器与试药

1.1仪器

Waters AcquityArc高效液相色谱仪(美国)：2998PDA检测器，四元超高压梯度泵，Empower色谱工作站。

1.2试药

荆防颗粒由鲁南厚普制药有限公司提供，样品批号为0012008044，0012008047，0012008048。甲醇、乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：Agilent SB-C

按下表进行梯度洗脱：

2.2对照品和供试品溶液的制备：

精密称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、升麻素苷、阿魏酸、紫花前胡苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蛇床子素对照品适量，用20％甲醇溶解稀释溶解制成每1mL含56.623μg、89.214μg、78.578μg、59.564μg、46.902μg、85.834μg、21.479μg、64.564μg、42.902μg、39.479μg上述对照品的对照品溶液。

精密量取荆防颗粒2mg，置10mL容量瓶中，加入浓度20％的甲醇定容，超声处理，放冷，离心，滤过，取续滤液，得供试品溶液。

2.3指纹图谱的建立

将上述对照品和供试品溶液分别注入HPLC色谱系统，测定3个批号荆防颗粒HPLC指纹图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的荆防颗粒HPLC标准指纹图谱。

将3个批号的荆防颗粒HPLC指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》，进行色谱峰匹配，所得到的指纹图谱有35个共有峰，其中，6号峰为新绿原酸，7号峰为绿原酸，8号峰为隐绿原酸，13号峰为升麻素苷15号峰为阿魏酸，20紫花前胡苷，24号峰为柚皮苷，26号峰为橙皮苷，27号峰为新橙皮苷，35号峰为蛇床子素。

其中，6号峰、7号峰、8号峰主要为羌活独活这一药对中共用的成分；13号峰为防风中的成分；15号峰为川芎中的成分；20号峰为羌活中的成分；24号峰、26号峰、27号峰为枳壳中成分；35号峰为独活中的成分。

以24号峰(柚皮苷)作为参照峰，确定了10个峰面积较大的主要特征峰的相对保留时间的比值，依次为0.16(6号峰)，0.27(7号峰)，0.29(8号峰)，0.53(13号峰)，0.62(15号峰)，0.80(20号峰)，1.00(24号峰)，1.10(26号峰)，1.15(27号峰)，1.34(32号峰)，1.68(35号峰)。

3批荆防合剂与标准指纹图谱相似度计算结果依次为：0.992，0.994，0.993。

实施例4荆防合剂HPLC标准指纹图谱的建立

1仪器与试药

1.1仪器

Waters Acquity Arc高效液相色谱仪(美国)：2998 PDA检测器，四元超高压梯度泵，Empower色谱工作站。

1.2试药

荆防合剂由鲁南厚普制药有限公司提供，样品批号见表1。甲醇、乙腈为色谱纯，水为纯化水，其余试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：Agilent SB-C

2.2对照品和供试品溶液的制备

精密称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、升麻素苷、阿魏酸、紫花前胡苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蛇床子素对照品适量，用50％甲醇溶解稀释溶解制成每1mL含56.623μg、89.214μg、78.578μg、59.564μg、46.902μg、85.834μg、21.479μg、64.564μg、42.902μg、39.479μg上述对照品的对照品溶液。

精密量取荆防合剂2mL，置10mL容量瓶中，加入浓度50％的甲醇定容，超声处理，放冷，离心，滤过，取续滤液，得供试品溶液。

2.3指纹图谱的建立

将上述对照品和供试品溶液分别注入HPLC色谱系统，测定12个批号荆防合剂HPLC指纹图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的荆防合剂HPLC标准指纹图谱。

将12个批号的荆防合剂HPLC指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》，进行色谱峰匹配，所得到的指纹图谱有35个共有峰，其中，6号峰为新绿原酸，7号峰为绿原酸，8号峰为隐绿原酸，13号峰为升麻素苷，15号峰为阿魏酸，20紫花前胡苷，24号峰为柚皮苷，26号峰为橙皮苷，27号峰为新橙皮苷，35号峰为蛇床子素。

其中，6号峰、7号峰、8号峰主要为羌活独活这一药对中共用的成分；13号峰为防风中的成分；15号峰为川芎中的成分；20号峰为羌活中的成分；24号峰、26号峰、27号峰为枳壳中成分；35号峰为独活中的成分。

以24号峰(柚皮苷)作为参照峰，确定了10个峰面积较大的主要特征峰的相对保留时间的比值，依次为0.16(6号峰)，0.27(7号峰)，0.29(8号峰)，0.53(13号峰)，0.62(15号峰)，0.80(20号峰)，1.00(24号峰)，1.10(26号峰)，1.15(27号峰)，1.34(32号峰)，1.68(35号峰)。

12批荆防合剂与标准指纹图谱相似度计算结果依次为：0.992，0.993，0.994，0.995，0.997，0.998，0.996，0.996，0.998，0.999，0.999，0.991。

以上实施例仅是本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理及构思的前提下，还可以做出若干修饰和改进，这些也应都属于本发明的保护范围。