一种青岛百合的种球繁育方法
文献发布时间:2023-06-19 18:47:50
技术领域
本发明涉及百合组培快繁领域,具体的为一种青岛百合的种球繁育方法。
背景技术
青岛百合是青岛崂山特有的一种野生花卉资源,其花朵呈橙红或黄色,花瓣修长艳丽,是国家二级濒危植物。野生居群呈群落分布,由于人为破坏,面积逐年缩小,多样性面临威胁。通过人工拯救繁殖,有利于百合野生资源的保护,还可作为园林景观花卉加以利用。
野生青岛百合主要依靠种子和鳞茎繁殖,种子实生苗需5~7年才开花,且发芽率低,难以规模化利用。而传统的鳞片扦插繁殖系数低、周期长,长期繁殖造成病毒积累,种性退化,不适宜青岛百合这类数量较少的珍稀野生种。如授权号为CN101711493B的专利直接剥取鳞片繁殖百合种球,其直接将消毒后的鳞片栽种到大田中,栽种当年不采收,让植株在大田中自然越冬和春化,直至来年11月种球成熟后进行采收。
植物组织培养则可以有效解决以上问题。目前,青岛百合组培研究多集中在实验室阶段,多采用细胞分类素类刺激增殖,畸变率高,操作要求高,费时费力不适合工厂化操作的要求。此外,百合组培苗移栽后易腐烂也是制约百合工厂化组培应用的一个难点,在反复实验对比并结合工厂化生产要求的基础上,我们构建了青岛百合的规模化组培生产体系,该体系操作简单,扩繁效率高,移栽成活率高,种球质量好,适于在百合种球生产企业推广。
发明内容
本发明的目的在于提供一种青岛百合的种球繁育方法,解决野生青岛百合种质资源保护、商品化生产和利用的问题。
为了实现上述目的,本发明涉及的一种青岛百合的种球繁育方法,包括以下步骤:
(1)外植体消毒及预处理:弃去百合鳞茎球最外层鳞片,将中层和内层鳞片清洗干净、消毒,然后晾干;
(2)小芽球的诱导:将步骤(1)处理好的中层和内层百合鳞片接种入生产培养基,培养2个月后,长出直径0.3-0.5cm的小芽球;
(3)小芽球的转接:将直径0.3-0.5cm的小芽球切下,转入生产培养基,每2个月继代1次,继代2次后,挑选直径1.0-2.0cm的百合球,剥下鳞片横切成3-4段,放入2.0mg/L的BA溶液中浸泡10-20min,取出后在无菌滤纸上稍吹干,接种入生产培养基,培养2个月后,长出直径0.3-0.5cm的小芽球;1个百合球经过步骤(3)的一次繁殖能够得到80-100个芽球。
(4)芽球增殖:重复步骤(3)即可循环生产大量百合小芽球;
(5)成品种球的获得:将(4)获得的小种球在生产培养基上每2个月继代1次,继代5次后可获得直径4-5cm的成品种球;
(6)种球的低温冷藏:将步骤(5)得到的成品种球直接移入冷库中,4℃低温冷藏60天;
(7)移栽驯化及商品种球的栽种:冷藏后取出种球洗净培养基,平铺于干热灭菌的水苔基质中,均匀喷洒1g/L的甲基硫菌灵溶液,然后覆盖1-2cm厚水苔,定期喷水,维持基质湿度40%-60%,持续炼苗1个月,使种球逐步适应外界环境。驯化完的种球,放入1g/L甲基硫菌灵溶液中浸泡30min后晾干,然后栽种于种植基质中,1年后即可收获。
上述步骤(2)-(5)中,生产培养基均为MS培养基附加0.2-0.5mg/L IBA、20-50g/L蔗糖和6.5g/L琼脂粉,并调节ph值为5.8,培养条件均为24±1℃,黑暗培养。
优选地,步骤(2)-(5)中,生产培养基均为MS培养基附加0.5mg/L IBA、50g/L蔗糖和6.5g/L琼脂粉,并调节ph值为5.8。
上述步骤(7)中,种植基质为:按重量比,松树锯末70-80份,干鸡粪5-10份,干羊粪5-10份,腐殖酸5-10份,海藻粉1-5份。混合均匀后粉碎成1-2mm的颗粒,然后加水50%充分腐熟发酵,至基质变黑色疏松柔软后,加入2%的石灰氮并混合均均,夏季高温闷晒1周后,打开晾晒5-7天即可使用。
具体地,步骤(1)外植体消毒及预处理,具体步骤为:先将百合种球弃去最外层鳞片,将中层和内层鳞片用洗洁精清洗干净,流水冲洗半小时;将完整鳞片在超净台内75%的酒精消毒1min,无菌水冲洗3次;然后用有效氯2%的次氯酸钠溶液消毒10-15min,每100ml滴加1滴吐温,反复摇晃消毒后用无菌水冲洗7次,彻底清洗掉次氯酸钠溶液残留。将消毒后的鳞片用解剖刀切去鳞片基部接触消毒液的部分1-3mm,再放置于无菌滤纸上在超净台内吹干30min。
优选地,步骤(2)小芽球的诱导:将步骤(1)处理好的中层和内层百合鳞片放入冰箱冷冻24h,然后接种入生产培养基,培养2个月后,长出直径0.3-0.5cm的小芽球。
本发明百合种球繁育过程中,按步骤(3)一个小芽球,经过4个月培养后直径达到1.0-2.0cm,含7-9个鳞片,然后切割并处理,再培养2个月后,可扩繁得到80-100个小芽球,周期一共6个月。一年扩繁倍数可达6400-10000倍。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:(1)利用本发明所述的方法,可以有效的进行青岛百合的工厂化生产,只用一种生产培养基和简单的浸泡处理,即可生产青岛百合商品种球,繁殖速度快,系数高,种球畸变率低,且操作简单成本低廉;(2)由于水苔非常柔软,保水透气性非常好,利用水苔炼苗不易划伤鳞片,更利于其鳞片的蜡质化,从而提高移栽的成活率;(3)种植基质,腐熟后颗粒小,非常松散柔软透气,无需额外施肥,栽种百合种球的效果非常好;(4)与采用生产培养基直接培养相比,通过BA溶液浸泡后单个鳞片长出的小芽球从2个左右增大到4个左右,提高了1倍,大大加快了繁育速率。
附图说明
图1鳞片诱导2个月的芽球照片;
图2新接种芽球(A)和培养4个月后的芽球(B)照片;
图3移栽驯化的成品种球(C)和(D)照片;
图4基质栽种后收获得商品种球(E)照片。
具体实施例
下面结合具体实施例和附图对本发明加以说明。
以扦插的青岛百合种球为材料,去除种球最外层鳞片,取完整中层和内层鳞片,加少许洗洁精浸泡鳞片并流水冲洗30min,用吸水纸吸干水分。以75%酒精消毒1min后无菌水冲洗3次,以有效氯2%的次氯酸钠溶液做梯度消毒1-20min,无菌水冲洗8次,彻底洗净次氯酸钠残留,切成1×1cm小块进行接种。从表1可以看出,百合种球由于接触土壤,含菌较多,较难消毒,且随着次氯酸钠消毒时间的延长,对鳞片的伤害增加,褐化率上升,所以选择10-15分钟可以初步达到消毒要求。
表1次氯酸钠消毒时间对青岛百合消毒效果的影响
将鳞片消毒后,先切除鳞片与消毒液接触的基部部分,然后按以下4种预处理方式,1)切小块1.0×1.0cm后直接接种;2)切小块1.0×1.0cm并置于冰箱24h冷藏后接种;3)消毒后整片直接接种;4)整片以无菌水冲洗并置于冰箱24h冷藏后接种。如表2所示,切小块更容易导致外植体褐化,整块接种的方式褐化率最低。4种处理方式,各接种30个鳞片,共重复3次,对褐化数进行方差分析表明,处理1、2和处理3、4之间差异显著,而处理1和2间,处理3和4间差异不显著,即百合鳞片整块接种能显著降低褐化率,但冷藏处理24h对降低褐化的作用并不显著。切小块可能由于消毒液与鳞片的接触面更多,伤害也更强,导致褐化率升高,而保持整块接种可以有效的降低褐化比率。
表2不同预处理方式对百合鳞片褐化率的影响
注:字母a,b表示显著性差异水平小于0.05;相同字母表示差异不显著,不同字母表示差异显著。
将百合鳞片整块接种入6种诱导培养基,每个配方接种5瓶,每瓶接种6个鳞片。如表3所示,6种培养基均添加蔗糖50g/L,琼脂粉6.5g/L,统计45天后的每瓶出芽数。表明,1/2MS和MS上的鳞片出芽少且瘦小;添加细胞分裂素BA或KT有助于芽的诱导,但长出的芽为细的叶片状丛生芽,需要分割并更换培养基才能发育成小鳞茎球,费时费力;在只添加生长素(NAA和IBA)的5和6号培养基,均可以直接长出小鳞茎状的芽,但NAA更容易使芽发生愈伤化,导致畸变。
进一步,利用培养基3和5,各接种120个鳞片(表4)。约45天后,将诱导的芽从鳞片上切下,统一转接入培养基5,在第45天统计鳞茎球的变异情况,结果如表4所示,来自培养基3的芽经过二次培养后才能形成鳞茎球状的芽,且大小与培养基5直接诱导出的芽相似,即通过培养基3来诱导芽会至少晚1.5个月成球。而且,其形态畸变率8.3%大于培养基5来源的小鳞茎球3.3%,且第3次转接后,依然保持较高的变异率。所以,采用培养基5直接诱导成芽更适合规模化生产的要求。
表3不同培养基配方对青岛百合种球增殖的影响
注:本表为每瓶接种6块鳞片,诱导45d后的每瓶平均出芽数。
表4两种培养方式小鳞茎球形态畸变的比较
以培养基5为基础,配制IBA浓度为0.2、0.5、0.7和1.0mg/L的梯度培养基(表5)。选取直径约1.5cm的百合种球,切除所有的根,然后接种入IBA梯度培养基,每个梯度接种10瓶,每瓶接种9个种球。1.5个月后,统计每瓶的百合种球根长,得到每瓶均值,然后记录每个处理梯度下各10瓶的均值。
利用SPSS 17.0对根长均值进行了单因素方差分析,比较了不同IBA浓度对百合球生根长度的影响,显示IBA浓度>0.5mg/L后,对根的诱导促进作用并无显著增强,本着节约药品的原则,采用IBA浓度为0.5mg/L为较好的选择。
表5不同IBA浓度对百合种球生根的影响
注:相同字母表示组间差异不显著(P>0.05),不同字母表示组间差异显著(P<0.05)
以培养基5为基础,配制蔗糖浓度为20、30、40、50、60、70和90g/L的梯度培养基(表6),共配制7个梯度,每个梯度接种6瓶,每瓶接种9个种球。选择直径1.0cm大小的种球,接种前先称取培养瓶的重量,接种后再称取培养瓶的重量,二者差值即为接种种球的初始重量;培养2个月后,先带瓶称取重量,然后移出百合球,再称取空培养瓶的重量,二者差值即为接种种球的最后重量;用最后重量减去初始重量即为百合种球的生长增加重量。
利用SPSS 17.0单因素方差分析比较了不同蔗糖浓度对百合球增重的影响,显示蔗糖浓度>50g/L后,对百合球重量的促进作用并无显著增强,高浓度蔗糖对百合种球的生长反而不利,本着节约药品的原则,采用蔗糖浓度为50g/L为较好的选择。
表6不同蔗糖浓度对百合种球增重的影响
注:相同字母表示组间差异不显著(P>0.05),不同字母表示组间差异显著(P<0.05)
以实施例3培养基5组培的青岛百合种球(直径约1.5cm)为材料,依据鳞片的大小切成3-4小块,在浓度2mg/L BA溶液中浸泡不同时间,然后接种入种球生产培养基,每个处理梯度各接种6瓶,共60块鳞片,共用掉17个百合种球,即每个梯度约2.43个种球。培养2个月后,统计每个梯度的出芽总数量。结果如表7所示,随着浸泡时间的增长,芽的增值系数呈上升趋势,对各梯度下出小球数量的显著性分析表明,超过10min后,浸泡时间对鳞片的增殖促进作用不在显著增强,第5、6和7处理组间差异不显著,所以,浸泡时间为10-20min即可。以平均1个种球计算,10-30分钟处理,其增殖倍数为88-101倍。
表7不同BA浸泡时间对百合鳞片增殖的影响
鳞片诱导2个月后,选择直径0.3-0.5cm的小芽球切下,转接至生产培养基上继代培养2次,共培养4个月,使小芽球慢慢长大,然后选择直径1.0-2.0cm的百合球,剥下鳞片横切成3-4段,在灭菌的2.0mg/L BA溶液中浸泡10-20min,用滤网过滤出鳞片小块,置无菌滤纸上稍晾干,然后接种入生产培养基,培养2个月后诱导出芽球。重复进行以上操作,即为百合种球的循环生产。在外植体消毒步骤中,为降低褐化率,采用整块接种的方式,而循环生产时,可以将百合鳞片切成小块,是因为没有次氯酸钠的伤害,小鳞片块的褐化率会变得很低。
进一步,循环生产获得的小芽球,待种球积累至一定量后,直接在生产培养基连续继代5次即可获得直径约4-5cm的商品种球。在青岛百合种球的整个生产过程中,均保持黑暗环境,温度维持在24±1℃。
待组培百合种球直径达4-5cm时,即可随瓶移入冷库冷藏60天,冷藏后取出种球洗净培养基,均匀摆放于水苔基质中并覆盖1-2cm厚水苔,定期喷水,维持基质湿度40%-60%,持续炼苗1个月,使种球在基质内逐步适应外界环境。
驯化完的种球,放入1g/L甲基硫菌灵溶液中浸泡30min后晾干,然后栽种于种植基质中。水苔炼苗可以提供一定的酸性环境,降低种球霉变几率,而且水苔质地疏松柔软,透气保湿性好,不会像土壤颗粒或锯末会划伤幼嫩的组培球,从而可以降低染菌率,提高百合种球的成活率。
选择园土、常用育苗基质(草炭:珍珠岩:蛭石=5:3:1)、步骤(7)中的种植基质土,选用55cm×25cm的种植盆,选取大小相对一致的种球,每盆栽种种球(3×9)27个,每种基质栽种5盆。于当年3月初栽种,当年11月末收获,整个生长期不施加肥料,只浇水。统计成活种球个数和每盆种球重量均值。结果如表8所示,步骤(7)的基质明显优于其它两种基质,非常适合青岛百合种球的种植。
表8不同栽培基质对百合种球成活率和种球大小的影响
通过以上实施例表明,本发明所述的方法系统的解决了青岛百合工厂化生产的问题,方法简单易操作,繁殖系数高。利用水苔驯化炼苗和专用基质种植栽培,对种球伤害小,成活率高,生产的商品种球质量非常好。
- 一种用于百合种球消毒的制剂及其制备方法和使用方法
- 一种百合种球的处理方法
- 一种用于消毒百合种球包埋基质的杀菌剂及其使用方法
- 利用龙牙百合鳞片繁育龙牙百合种球的方法
- 利用龙牙百合鳞片繁育龙牙百合种球的方法