帕拉米韦注射液杂质C检测方法

技术领域

本发明涉及帕拉米韦注射液杂质检测领域，特别涉及帕拉米韦注射液杂质C检测方法。

背景技术

帕拉米韦(Peramivir)，是一种新型的抗流感病毒药物，现有临床试验数据证明其对甲型和乙型流感有效。

帕拉米韦原料药合成路线：

具体合成方法是，起始原料在还原剂硼氢化钠作用下发生开环和还原反应生成中间体Ⅰ；中间体Ⅰ和乙酸酐发生酯化反应生成中间体Ⅱ；中间体Ⅱ在氢氧化钠作用下发生水解反应生成中间体Ⅲ；中间体Ⅲ在盐酸作用下脱保护基生成中间体Ⅳ，不分离的中间体Ⅳ直接和起始原料Ⅱ作用生成帕拉米韦粗品，最终经转晶生成帕拉米韦。其重要剂型为静脉注射液。帕拉米韦注射液杂质C主要来源于原料工艺杂质。各国药典均未收载帕拉米韦注射液质量标准，更无帕拉米韦注射液杂质C检测方法；帕拉米韦原料供应商质量标准中的杂质C检测方法采用正相色谱系统，本品为注射液，在正相色谱系统中溶解性差。而仅有国家食品药品监督管理总局收载帕拉米韦氯化钠注射液(100ml：帕拉米韦C

杂质C(对应异构体)的化学名称为(1R,2R,3S,4S)-3-[(1R)-1-(乙酰氨基)-2-乙基丁基]-4-胍-2-羟基环戊烷羧酸三水合物，分子式为C

发明内容

鉴于此，本发明提出帕拉米韦注射液杂质C检测方法，解决上述技术问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

帕拉米韦注射液杂质C检测方法，包括以下步骤：采用高效液相色谱法进行检测，测定条件包括：色谱柱：

进一步，磷酸盐缓冲液，每1L磷酸盐缓冲液中含4.75～5.25mmol/L磷酸氢二铵和4.75～5.25mmol/L磷酸二氢铵。

进一步，溶液配制包括：

杂质C定位溶液：取杂质C，精密称定，加溶剂使溶解并稀释至每1ml中含0.015～0.025mg的溶液；

供试品溶液：精密量取帕拉米韦注射液，用溶剂稀释至每1ml中含帕拉米韦0.4～0.6mg的溶液，混匀；

对照溶液：精密量供试品溶液，用溶剂稀释至每1ml中含帕拉米韦0.8～1.2μg的溶液，混匀。

进一步，所述溶剂为水。

进一步，测定法：精密量取供试品溶液、对照溶液及空白溶剂，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。

进一步，所述进样体积为：3～5μl。

进一步流动相：5mmol/L磷酸氢二铵和5mmol/L磷酸二氢铵缓冲液。

进一步，所述色谱柱的规格为150mm×4.0mm，5μm。

进一步，检测波长：205nm，柱温：20℃，流速：0.3ml/min，进样体积：4μl。

进一步，杂质C定位溶液：取杂质C，精密称定，加溶剂使溶解并稀释至每1ml中含0.02mg的溶液；

供试品溶液：精密量取帕拉米韦注射液，用溶剂稀释至每1ml中含帕拉米韦0.5mg的溶液，混匀；

对照溶液：精密量供试品溶液，用溶剂稀释至每1ml中含帕拉米韦1μg的溶液，混匀。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明采用反相手性色谱系统，建立帕拉米韦注射液杂质C的检测方法，并对该方法进行了系统的方法学验证，通过了专属性、线性及范围、准确度试验、重复性试验、中间精密度试验、溶液稳定性试验及耐用性试验等考察，能够较好适用于帕拉米韦注射液杂质C检测，有助于提高帕拉米韦注射液质量控制水平。

附图说明

图1本发明方法验证专属性试验中溶剂HPLC图谱；

图2本发明验证专属性试验中空白辅料HPLC图谱；

图3本发明验证专属性试验中杂质O定位溶液HPLC图谱；

图4本发明验证专属性试验中杂质Q定位溶液HPLC图谱；

图5本发明验证专属性试验中杂质S定位溶液HPLC图谱；

图6本发明验证专属性试验中杂质T定位溶液HPLC图谱；

图7本发明验证专属性试验中加标供试品溶液HPLC图谱；

图8本发明验证专属性试验供试品溶液HPLC图谱；

图9本发明验证专属性试验中对照溶液HPLC图谱；

图10本发明验证专属性试验中加标混合溶液HPLC图谱；

图11为本发明线性试验的帕拉米韦线性图；

图12为本发明线性试验的杂质C线性图。

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例

(一)帕拉米韦注射液杂质C检测方法

采用高效液相色谱法

色谱柱：

检测波长：205nm

柱温：20℃

流速：0.3ml/min

进样体积：4μl

流动相：5mmol/L磷酸氢二铵和5mmol/L磷酸二氢铵缓冲液

溶剂：水

溶液配制：

杂质C定位溶液：取杂质C适量，精密称定，加溶剂使溶解并稀释至每1ml中约含0.02mg的溶液。

供试品溶液：精密量取帕拉米韦注射液1ml，置20ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。

对照溶液：精密量供试品溶液1ml，置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置25ml，用溶剂稀释至刻度，摇匀。

测定法：精密量取供试品溶液、对照溶液及空白溶剂各4μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。

限度：按不加校正因子的自身对照法计算，杂质C不得过0.2％。

(二)参照中国药典2020年版四部指导原则，对分析方法进行了完整的方法学验证。方法验证内容包括：专属性、线性及范围、准确度试验、重复性试验、中间精密度试验、溶液稳定性试验及耐用性试验。验证使用样品信息见表1。

表1验证使用样品信息

1专属性试验

1.1简述

方法的专属性研究考察峰鉴别和选择性，通过对各杂质进行定位考察，确保杂质C与主峰的分离度符合标准，各杂质均可与主峰及杂质C良好分离，辅料溶液及溶剂不干扰测定。1.2操作方法：

空白辅料溶液：精密量取全辅料溶液1ml，置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。

杂质O定位溶液：取杂质O约2mg，精密称定，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质O的贮备液，精密量取1ml，置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。

杂质Q定位溶液：取杂质Q约2mg，精密称定，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质Q的贮备液，精密量取1ml，置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。

杂质S定位溶液：取杂质S约2mg，精密称定，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀作为杂质S的贮备液，精密量取1ml，置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。

杂质T定位溶液：取杂质T约2mg，精密称定，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质T的贮备液，精密量取1ml，置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。上述杂质杂质O、杂质Q、杂质S、杂质T的结构式如下表2：

表2

杂质C定位溶液：取杂质C约5mg，精密称定，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质C贮备液，精密量取5ml，置25ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。

杂质混合溶液：分别精密量取杂质O、Q、S、T贮备溶液1ml，置10ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。

供试品溶液：精密量取帕拉米韦注射液1ml，置20ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。

加标供试品溶液：精密量取帕拉米韦注射液和杂质C定位溶液各1ml，置20ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。

对照溶液：精密量取加标供试品溶液1ml，置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置25ml，用溶剂稀释至刻度，摇匀。

加标混合溶液：精密量取帕拉米韦注射液1ml、杂质混合溶液1ml及杂质C定位溶液1ml，置20ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为加标混合供试品溶液。

精密量取上述空白溶剂、空白辅料溶液、供试品溶液、加标供试品溶液、对照溶液、加标混合溶液及各杂质定位溶液各4μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表3及图1-10。

1.3试验结果

表3专属性试验结果

1.4结论

空白溶剂、空白辅料溶液不干扰测定；加标混合溶液中，杂质O、杂质Q不干扰杂质C及主成分的测定，杂质S与杂质C出峰时间重合，严格控制杂质合并计算杂质量，杂质T与杂质S/C的分离度为1.41，小于1.5，但大于1.2，可实现基线分离，该方法的专属性良好。

2线性试验

2.1简述

结合本品合成工艺杂质分析情况，对杂质C进行线性试验。线性试验中，线性相关系数r应大于0.990，Y轴截距与100％理论浓度响应值之比应小于25％。

2.2操作方法

线性贮备溶液：取帕拉米韦三水合物11.5mg，精密称定，置100ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml和专属试验项下的杂质C贮备液1ml，置50ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为线性贮备溶液。

分别精密量取线性贮备溶液1ml、3ml、5ml、6ml、7.5ml置不同的10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，分别作为20％、60％、100％、120％、150％的线性溶液。

精密量取上述20％、60％、100％、120％和150％线性溶液各4μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，用最小二乘法进行线性回归，计算相关系数。结果见表4。

2.3试验结果

表4线性试验结果

2.4结论

帕拉米韦的线性相关系数r为0.99996，大于0.990，Y轴截距与100％理论浓度响应值之比为0.46％，小于25％；杂质C的线性相关系数r为0.99712，大于0.990，Y轴截距与100％理论浓度响应值之比为1.30％，小于25％，杂质C的校正因子为1.05，在0.9～1.1范围内，所以可采用不加校正因子的自身对照法测定。

3定量限及检测限试验

3.1简述

定量限溶液中各峰的信噪比应大于10，各峰保留时间RSD应小于1.0％，峰面积的RSD应小于10％，定量限限度应小于限度的50％或报告限度(取最小值)。定量限溶液中各峰的信噪比应大于3。

3.2操作方法

定量限溶液：精密量取20％线性溶液5ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。

检测限溶液：精密量取定量限溶液5ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。

精密量取定量限溶液、检测限溶液各4μl分别注入液相色谱仪中，记录色谱图。结果见表5。

3.3试验结果

表5定量限与检测限试验结果

3.4结论

杂质C的定量限溶液浓度为0.103μg/ml，限度为0.02％，小于0.05％，重复测定6次，信噪比最小为12.71，大于10；保留时间的RSD为0.11％，小于1％；峰面积的RSD为5.59％，小于10％，符合要求。帕拉米韦的定量限溶液浓度为0.115μg/ml，限度为0.02％，小于0.05％，重复测定6次，信噪比最小为13.20，大于10；保留时间的RSD为0.08％，小于1％；峰面积的RSD为4.75％，小于10％，符合要求。检测限溶液中，杂质C和帕拉米韦的信噪比分别为5.96、6.63，大于3，符合要求。

4准确度试验

4.1简述

结合本品合成工艺杂质分析，我们对杂质C进行准确度研究，采用50％、100％、150％浓度对其准确度进行考察，以确保其检测结果的准确性。

4.2操作方法

对照品溶液：精密量取专属试验项下的杂质C定位溶液1ml，置20ml量瓶中，加溶剂定量稀释至刻度，摇匀。平行配制两份。

空白供试品溶液：精密量取帕拉米韦注射液1ml，置20ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。

50％回收溶液：精密量取帕拉米韦注射液1ml，置20ml量瓶中，再精密加入专属试验项下的杂质C定位溶液0.5ml，加溶剂稀释至刻度，摇匀加溶剂稀释至刻度，摇匀。(平行配制3份)

100％回收溶液：精密量取帕拉米韦注射液1ml，置20ml量瓶中，再精密加入专属试验项下的杂质C定位溶液1ml，加溶剂稀释至刻度，摇匀加溶剂稀释至刻度，摇匀。(平行配制3份)

150％回收溶液：精密量取帕拉米韦注射液1ml，置20ml量瓶中，再精密加入专属试验项下的杂质C定位溶液1.5ml，加溶剂稀释至刻度，摇匀加溶剂稀释至刻度，摇匀。(平行配制3份)

精密量取上述溶液各4μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表6。

4.3试验结果

表6准确度试验结果

4.4结论：

50％-150％回收溶液的回收率平均值为94.0％，在80％-120％范围内，RSD为2.77％。小于10％，准确度良好。

5耐用性试验

5.1简述

考察色谱参数的微小变动及仪器色谱行为的变化对检测结果的影响。将通过流速变化±0.1ml/min、柱温变化±2℃、检测波长变化±2nm，测定结果不受影响的承受程度。

5.2操作方法

空白辅料溶液：精密量取全辅料溶液1ml，置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。

加标混合溶液：精密量取帕拉米韦注射液1ml、专属试验项下杂质混合溶液1ml及专属试验项下杂质C定位溶液1ml，置20ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为加标混合溶液。

对照溶液：精密量取加标混合溶液1ml，置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置25ml，用溶剂稀释至刻度，摇匀。

精密量取上述加标混合溶液、对照溶液、空白辅料溶液及空白溶剂各4μl，于流速变化±0.1ml/min、柱温变化±2℃、检测波长变化±2nm的条件下，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表7。

5.3试验结果

表7耐用性试验加标混合溶液结果

5.4结论

耐用性试验中，在流速变化±0.1ml/min、柱温变化±2℃、检测波长变化±2nm各个条件下，加标混合溶液中，杂质C与主峰的分离度最小为1.97，大于1.5；杂质C的检出量变化率最大为14.51％，小于20％，耐用性良好。

6重复性试验

6.1简述

重复性是通过配制6份供试品溶液来验证该方法具有良好的精密度。

6.2操作方法

杂质C定位溶液配制同专属性试验。

加标供试品溶液：精密量取帕拉米韦注射液1ml，置20ml量瓶中，再精密加入杂质C定位溶液1ml，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为加标供试品溶液。平行配制6份

对照溶液：精密量取加标供试品溶液1ml，置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置25ml，用溶剂稀释至刻度，摇匀。

精密量取上述空白溶剂、加标供试品溶液及对照溶液各4μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表8。

6.3试验结果

表8重复性试验结果

6.4结论

重复性试验中，连续5针对照溶液-1的主峰峰面积RSD为1.43％，小于2.0％，6份加标供试品溶液中杂质C的检出量RSD为1.09％，小于20％，重复性良好。

7中间精密度试验

7.1简述

为考察随机变动因素对精密度的影响，另一名分析人员独立建立系统，考察测定方法的精密度。

7.2操作方法

照上述重复性试验方法于不同日期、不同仪器，由不同操作人员，对同一批样品进行含量测定，重复操作6次。

精密量取上述空白溶剂、加标供试品溶液及对照溶液各4μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表9。

7.3试验结果

表9中间精密度试验结果

7.4结论

中间精密度试验中，连续5针对照溶液-1的主峰峰面积RSD为1.65％，小于2％，6份加标供试品溶液中杂质C的检出量RSD为1.96％，小于20％，中间精密度良好。12针加标供试品溶液中杂质C检出量的RSD为4.06％，小于30％，精密度良好。

8溶液稳定性试验

8.1简述

考察在室温条件下放置，溶液随时间的变化规律，为以后检测时测试溶液放置时间的期限提供依据。

8.2操作方法

杂质C定位溶液配制同专属性试验。

加标供试品溶液：精密量取帕拉米韦注射液1ml，置20ml量瓶中，再精密加入杂质C定位溶液1ml，加溶剂稀释至刻度，摇匀。加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为加标供试品溶液。

对照溶液：精密量取加标供试品溶液1ml，置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置25ml，用溶剂稀释至刻度，摇匀。

室温条件下，精密量取上述空白溶剂、加标供试品溶液及对照溶液各4μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表10。

计算公式：

式中A

8.3试验结果

表10溶液稳定性试验结果

8.4结论

24h内，对照溶液中主峰峰面积的变化率为最大为2.49％，小于20％，可认为对照溶液在24h内稳定。24h内，加标供试品溶液中杂质C的峰面积的变化率最大为2.17％，小于20％，可认为加标供试品溶液在24h内稳定。

9耐用性

9.1试验方法

在流速变化±0.1ml/min、柱温变化±2℃、检测波长变化±2nm各个条件下，加标混合溶液中，主峰与杂质C峰之间分离度应符合要求。加标混合溶液中，杂质C检出量的变化率应小于20％。

9.2试验结果

在流速变化±0.1ml/min、柱温变化±2℃、检测波长变化±2nm各个条件下，加标混合溶液中，杂质C与主峰的分离度最小为1.97，大于1.5；杂质C的检出量变化率最大为14.51％，小于20％，耐用性良好。

(三)验证结果汇总见表11

表11验证结果汇总

综上，本发明帕拉米韦注射液杂质C检测方法，通过了专属性、线性及范围、准确度试验、重复性试验、中间精密度试验、溶液稳定性试验及耐用性试验等考察，较好适应帕拉米韦注射液杂质C检测，有助于提高帕拉米韦注射液质量控制水平。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。