木豆芪酸与多粘菌素B联合在抑制mcr-1阳性大肠杆菌生长中的应用

技术领域

本发明涉及一种木豆芪酸的新用途，特别涉及木豆芪酸与多粘菌素B联合在抑制mcr-1阳性大肠杆菌生长中的应用，本发明属于生物医药技术领域。

背景技术

抗生素一直是现代医学的基石，在治疗和预防常见细菌感染方面起到了关键作用，使许多复杂疾病的治疗成为可能，并拯救了数百万人的生命，但由于进化、自然选择以及抗生素的过度使用，导致了全球细菌耐药性的产生速度惊人，造成了临床上可用抗生素种类越来越少的尴尬局面。在过去的二十年中，“ ESKAPE”病原菌（包括铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）和肠杆菌属（Enterobacter Hormaeche and Edwards））是全球医疗感染相关的主要原因，对全球公共卫生健康构成了重大威胁，而这些细菌大多数是多重耐药性（MDR）“超级细菌”，常引起难以治愈的感染，甚至危及生命。根据各国的报道，革兰氏阴性“超级细菌”，对目前大多数可用的抗生素均产生了耐药性，致病菌耐药性的快速发展和传播速度早已超过了新型抗生素的研发速度，因此细菌耐药性已给全球的人类健康造成了巨大威胁。

大肠杆菌是一种在微生物界中具有特殊地位的细菌，它既可以引起人和动物的严重感染，同时也是耐药基因的主要储存库，目前许多的耐药基因相继在大肠杆菌分离株中被发现，这可能是人类和兽医治疗大肠杆菌感染失败的原因之一。在肠道细菌基因库中，一般认为耐药基因是通过水平转移方式获得或传递的，大肠杆菌既可以从其他细菌中获得耐药基因，也可以将耐药基因传递给其他细菌。总之，大肠杆菌的耐药性被认为是全球范围内人类和动物所面临的一项主要挑战，也是必须要高度重视的公共卫生问题。

在过去的几十年里，全球大肠杆菌临床分离株的耐药性产生显著增加，并且因国家和地区的不同而产生了耐药性的差异。2016年，在印度新德里一项关于新生儿败血症的研究表明，产超广谱β-内酰胺酶(ESBL)大肠杆菌临床分离株的患病率为47%。2007年，亚太地区监测抗生素耐药性趋势研究项目的数据显示，印度和中国ESBL大肠杆菌腹腔内感染率分别为79%和55%，而澳大利亚(8%)和菲律宾(17%)的感染率较低。从2013年到2014年，美国ESBL大肠杆菌肾盂肾炎的患病率为3%-12%不等。在大肠杆菌尿路感染中检测到氟喹诺酮耐药率也存在相当大的地区差异，由希腊的2%到印度的近70%不等。对其他抗生素，如氨苄青霉素和复方新诺明的耐药性也因地区而不同。

多粘菌素是由类芽孢杆菌属细菌使用非核糖体肽合成酶合成的、具有亲脂性脂肪酰基侧链的阳离子多肽类抗生素，对革兰氏阴性菌具有广谱的抗菌活性，于20世纪40年代开发成功。多粘菌素共有五种类型（即多粘菌素A-E），且均具有相似的十肽结构（由七肽环和三肽侧链组成，三肽侧链在氨基末端被脂肪酸酰化）。目前，在临床上仅使用多粘菌素B和多粘菌素E两种类型，多粘菌素B和E仅相差一个氨基酸即多粘菌素B的第6位为D-苯丙氨酸，而多粘菌素E的第6位则是D-亮氨酸，由于二者具有化学结构相似和相当的生物学活性，因此早期被认为是等效的。

20世纪70年代初，由于多粘菌素潜在的肾毒性、神经毒性以及新一代广谱抗生素的开发和使用，造成了多粘菌素的临床治疗未能得到广泛应用。20世纪90年代末，由于多重耐药革兰氏阴性菌引起感染的发病率增加，特别是耐碳青霉烯类的肠杆科菌，使得目前现有的许多抗生素对这些耐药菌株不再有效。此外，由于新开发的抗菌剂数量有限和耐药情况进一步恶化，因此临床上不得不重新启用多粘菌素治疗革兰氏阴性菌感染。目前，由于多粘菌素的高效率和低耐药率，被认为是治疗由革兰氏阴性菌引起严重感染的最后手段。然而，鉴于多粘菌素的广泛和持续使用，特别是在畜牧领域，国际上对多粘菌素耐药性的潜在快速传播存在担忧。

一些肠杆菌科细菌已经显示出对多粘菌素的明显抗药性，以前普遍认为多黏菌素的耐药机制是由染色体突变介导的，不能通过基因的水平转移介导。然而，在2015年，中国工程院沈建忠院士团队和华南农业大学刘健华教授团队首次发现了由携带mcr-1基因质粒介导的对多粘菌素产生抗性的机制，并由接合实验证实该基因可通过接合性质粒在细菌间进行传播。

mcr-1是国际上首次发现的可水平转移的由质粒介导的多黏菌素耐药基因，该基因全长1626bp，GC含量49%，编码 541 个氨基酸的MCR-1 蛋白，位于细菌的独立遗传元件质粒上。自发现mcr-1基因以来的几个月内，在全球多个国家均检测到了该基因(食物，东南亚、欧洲和非洲的动物和人类，以及从东南亚、南美和非洲返回欧洲的旅行者)，这表明该抗性基因元件可高度传播，令人担忧的是，携带mcr-1基因的质粒可介导革兰氏阴性菌之间多粘菌素耐药性的跨物种转移，这对使用多粘菌素作为最后防线药物来治疗革兰氏阴性菌感染产生了巨大的挑战。在自然界中，携带mcr-1基因可被追溯到不少于5个菌种（大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、产气肠杆菌和阴沟肠杆菌），还可以通过接合实验从大肠杆菌传播到铜绿假单胞菌中。此外，可能携带mcr-1基因肠道细菌的宿主范围从家禽扩展到人类。2016年1月至4月公布的数据显示，mcr-1基因已传播到不少于18个国家，在某种程度上来说，mcr-1基因的传播可能与食物链的运输途径有关。从中国屠宰场猪只中分离的20%大肠杆菌和从零售肉类中分离的15%大肠杆菌中均检测出mcr-1基因。在中国医院住院患者培养的各种革兰氏阴性细菌的临床分离株(包括大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌)中也检测到了该基因。mcr-1是质粒介导的对多粘菌素产生耐药的，目前已在高水平抗药性革兰氏阴性菌中发现了该基因。基于氨基酸序列比对发现，MCR-1蛋白与不同种属的磷酸乙醇胺转移酶具有较高的同源性，MCR-1蛋白产物被预测为具有磷酸乙醇胺转移酶催化活性的完整膜蛋白，属于磷酸乙醇胺转移酶家族、YhjW/YjdB/yi jP超家族的成员。它通过添加磷酸乙醇胺基团（PEtN）以改变细菌LPS表面脂质A部分的1'或 4'磷酸基团的化学结构，导致LPS上带有更多的正电荷，降低了细菌表面对阳离子抗生素多粘菌素的亲和力，从而导致对多粘菌素耐药。

木豆芪酸（3-hydroxy-4-prenyl-5-methoxystilbene-2-carboxylicacid，CSA）是一种最重要的从木豆叶中分离出的活性成分，具有多种生物活性，CSA在药物应用领域发挥的作用越来越广泛。本发明针对CSA抑制多粘菌素耐药关键蛋白MCR-1的作用机制展开了一系列实验，并验证CSA确实可以抑制MCR-1蛋白发挥功能，为MCR-1蛋白的小分子抑制剂，并发现木豆芪酸（CSA）与多粘菌素B联合使用时，可有效抑制mcr-1阳性大肠杆菌的生长。

木豆芪酸的结构

发明内容

本发明的目的之一在于提供木豆芪酸与多粘菌素B联合在抑制mcr-1阳性大肠杆菌生长中的应用。

本发明的目的之二在于提供一种由木豆芪酸与多粘菌素B组成的药物组合物及其应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明为了阐明木豆芪酸与多粘菌素B两者联合使用时的确切效果及作用机制，首先采用了棋盘稀释法，对mcr-1阳性大肠杆菌进行CSA与多粘菌素的联合药敏实验研究。结果表明，当CSA与多粘菌素联合使用时，多粘菌素的MIC值由8μg/mL降至1μg/mL，FIC指数小于0.5，属于协同作用。在此基础上，应用平板计数和透射电镜观察的方法评估CSA（终浓度为32μg/mL）与多粘菌素（终浓度为10μg/mL）的联合抑菌效果，结果显示当CSA与多粘菌素联合使用时，大肠杆菌在1h-4h内全部死亡，菌体破损最严重；而不管单独使用32μg/mL的CSA还是10μg/mL的多粘菌素时，大肠杆菌均不能被彻底杀灭。使用80mg/kg 的CSA和5mg/kg多粘菌素联合治疗大肠杆菌感染小鼠的实验结果表明，与阳性对照组相比，小鼠死亡率降低，肝脏的荷细数降低了约55倍、脾脏的荷菌数降低了约1056倍，且联合治疗组小鼠肝脏和脾脏的病理组织变化明显减轻，表明CSA与多粘菌素联合使用对mcr-1阳性大肠杆菌有着明显的治疗效果。在mcr-1基因分子克隆、诱导表达及纯化MCR-1蛋白基础上，利用Biacore大分子作用仪验证CSA与MCR-1蛋白的相互作用关系，结果表明CSA与MCR-1蛋白之间的亲和力为1.47μmol/L，小于1mmol/L属于直接结合，因此，CSA为MCR-1蛋白的小分子抑制剂。

在上述研究的基础上，本发明提出了木豆芪酸（3-hydroxy-4-prenyl-5-methoxystilbene-2-carboxylicacid，CSA）与多粘菌素B联合在制备抑制mcr-1阳性大肠杆菌生长药物中的应用。

其中，优选的，木豆芪酸与多粘菌素B的质量比为3-20:1。

进一步的，本发明还提出了一种用于抑制mcr-1阳性大肠杆菌生长的药物组合物，其所述的药物组合物由木豆芪酸与多粘菌素B组成。

其中，优选的，木豆芪酸与多粘菌素B的质量比为3-20:1。

更进一步的，本发明还提出了所述的药物组合物在制备抑制mcr-1阳性大肠杆菌生长药物中的应用。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

抗生素的过度使用造成了典型“超级细菌”的传播和流行，导致几乎所有的抗生素都对其无效，因此细菌耐药性已经成为人类公共卫生安全的重要问题之一。从目前mcr-1基因的流行现状来看，mcr-1阳性菌株经常携带β-内酰胺酶、氟苯尼考、磷霉素和喹诺酮等其他耐药基因，在各种药物的选择性压力下，这些耐药菌株被筛选和存活下来，随着mcr-1基因的变异和传播，将会引起多重耐药细菌的爆发和流行，多粘菌素耐药问题也变得不容乐观。因此，迫切需要新型抗菌剂来克服日益严重的耐药性问题。天然产物是新型药物的重要来源，从天然产物及其衍生物中筛选新型抗菌剂，是克服耐药性细菌的重要途径。

本发明从天然产物中筛选并鉴定出多粘菌素耐药关键蛋白MCR-1的小分子抑制剂木豆芪酸，研究发现，CSA与多粘菌素B联合治疗mcr-1阳性大肠杆菌产生了显著的协同效果，CSA可能降低了mcr-1阳性菌对多粘菌素B的耐药性，进而增强了多粘菌素B的抗菌活性。本发明的提出为深入研究和开发更高活性的MCR-1抑制剂提供了思路，为与大肠杆菌感染导致的相关疾病的治疗提供了一种新的技术手段。

附图说明

图1为CSA联合多粘菌素B对

图2为透射电镜观察mcr-1阳性大肠杆菌JD08形态；

其中，A: JD08菌株; B: JD08菌株受10μg/mL 多粘菌素影响; C: JD08菌株与10μg/mL 多粘菌素和32μg/mL CSA 联合作用；

图3为质谱检测JD08菌株中类脂A的变化情况；

其中，图3A为相比于没有发生修饰的正常的类脂A大小变化情况；图3B为相比于未使用CSA处理的JD08菌株中经过修饰的类脂A的比例；

图4为小鼠的生存率（A）及肝脏（B）、脾脏（C）细菌负荷；

图5为小鼠的肝脏病理切片（X200）；

其中，图5A为空白对照组的肝脏；图5B为阳性对照组的肝脏；图5C为多粘菌素对照组的肝脏；图5D为多粘菌素及CSA联合治疗组的肝脏；

图6为小鼠的脾脏病理切片（X200）；

其中，图6A为空白对照组的脾脏；图6B为阳性对照组的脾脏；图6C为多粘菌素对照组的脾脏；图6D为多粘菌素及CSA联合治疗组的脾脏；

图7为

其中，M: DL2000 Maker; 1-4: mcr-1基因的 PCR 产物; 5: 阴性对照；

图8为重组质粒的双酶切鉴定；

其中，M:marker; 1-3:重组质粒的双酶切产物；4：阴性对照；

图9为MCR-1蛋白表达情况的SDS-PAGE检测；

其中，M：蛋白marker；1：细菌沉淀；2：细菌上清；3：pET-28a上清；4：pET-28a沉淀；

图10为不同咪唑浓度MCR-1蛋白的纯化结果；

其中，M：蛋白 Marker；1：5mM 咪唑洗脱结果；2：10mM 咪唑洗脱结果；3：20mM 咪唑洗脱结果；4：40mM 咪唑洗脱结果；5：60mM 咪唑洗脱结果；6：80mM 咪唑洗脱结果；7：100mM咪唑洗脱结果；8：250mM 咪唑洗脱结果；

图11为Biacore测定CSA与MCR-1蛋白之间相互作用力；

其中，A：1.56 μm、3.125 μm、6.25 μm、12.5 μm、25 μm、50 μm的CSA与MCR-1蛋白的结合响应曲线（从下到上曲线依次对应1.56 μm、3.125 μm、6.25 μm、12.5 μm、25 μm、50 μm）；B：CSA与MCR-1蛋白的亲和力拟合曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

实施例1 CSA与多粘菌素联合在抑制

1.1 材料

1.1.1 菌株及实验动物

1.1.2 主要试剂

表1 主要试剂

1.2 方法

1.2.1 联合药敏

实验用不同来源的24株

1.2.2 杀菌效果检测

由于JD08菌株的MIC值在24株分离株中比较有代表性，因此我们选取JD08菌株进行接下来的所有实验。在2mL的LB液体培养基中复苏JD08菌液，在温箱中37℃、220rpm培养1h，随后将JD08菌液分成三份，分别加入：（1）终浓度为10μg/mL的多黏菌素；（2）终浓度为32μg/mL的CSA；（3）终浓度为10μg/mL的多黏菌素和终浓度为32μg/mL的CSA，将三份菌液置于37℃温箱中恒温培养，分别于1h、2h、4h、6h、8h、10h和12h后从中各取100μL菌液均匀涂到到LB固体琼脂培养基上，倒置平板37℃过夜培养，次日进行细菌计数。根据活菌数绘制时间-活菌数曲线，同时以正常培养的JD08菌株为阳性对照。

1.2.3 透射电镜观察

我们通过透射电镜观察正常培养的JD08菌株、多粘菌素B作用的JD08菌株、多粘菌素B和CSA联合作用的JD08菌株的菌体形态。培养JD08菌株至OD

1.2.4 质谱检测类脂A结构

取10μLJD08菌液分别接种于10mL的LB液体培养基和含16μg/mL的CSA的LB液体培养基中，37℃、220rpm培养8h。随后提取类脂A，具体方法如下：

（1）将培养的JD08菌液以8,000rpm的转速离心20min收获菌体，并用去离子水洗涤三次。

（2）将沉淀重悬于3.8mL由氯仿/甲醇/水体积比为1：2：0.8的比例组成的混合液体中，并在室温下搅拌1h，以2,000rpm的转速离心20min收集细菌沉淀，进行细胞膜裂解。

（3）向沉淀中加入5mL由氯仿/甲醇/水（体积比为1：2：0.8的比例组成）的混合液体，洗涤沉淀，以2,000rpm的转速离心10min收集细菌沉淀，重复此步骤3次。

（4）在沉淀中加入1.35mL的NaAC（12.5mM，PH4.5），使用超声细胞破碎仪重悬沉淀，100℃加热30分钟使脂质A从LPS中释放出来，进行裂解糖链。

（5）分离脂质A：冷却至室温后，加入1.5mL的100%氯仿和1.5mL的100%甲醇，剧烈摇动混合物5-10s，以2,000rpm的转速离心10min。

（6）吸出下相并蒸发干燥，粉末储存在-20℃。

（7）使用50μL由氯仿/甲醇的体积比为4：1的混合液体溶解类脂A，采用质谱仪测定结构。

1.2.5 小鼠体内CSA与多粘菌素B联合作用效果研究

取30只6-8周龄的BAL B/C小鼠，体重约为18-20g，随机分为空白对照组、阳性对照组、溶剂对照组、多粘菌素对照组、CSA对照组、CSA及多粘菌素联合给药组共6组，每组5只小鼠，自由采食和饮水，室温饲养。除空白对照组和溶剂对照组外，其余4组小鼠每只腹腔注射0.2mL的JD08细菌（5×10

1.3 结果

1.3.1 联合药敏结果

选取24株

表3不同来源的

1.3.2 杀菌效果检测

向JD08菌株中分别加入终浓度为10μg/mL的多黏菌素、终浓度为32μg/mL的CSA和终浓度为10μg/mL的多黏菌素+终浓度为32μg/mL的CSA联合作用。活菌数计数结果显示，单独使用32μg/mL的CSA对于

1.3.3 透射电镜观察

电镜观察结果显示，正常培养的JD08菌体形态较好，外膜完整，仅有轻微形变，可能是制作切片过程中的损伤所致（图2A）；10μg/mL的多粘菌素B作用的JD08菌体内容物少量流失，电子密度降低（图2B）；10μg/mL的多粘菌素B及32μg/mL的CSA共同作用的JD08菌体形变明显，内容物流失严重，多数菌体只剩外膜结构，同时观察到类蛋白物质（图2C），表明联合使用CSA和多粘菌素B对

1.2.4 质谱检测类脂A结构

采用氯仿/甲醇/水混合相萃取法提取类脂 A，在JD08菌株中分离出的类脂大小为1920.3u，相比于没有发生修饰的正常的类脂A大小（1797.1u）增加了大约123u（图3A）。在16μg/mL的CSA存在的情况下，MCR-1蛋白的作用受到抑制，发生转移的酰基键含量大大减少(图3B)，相比于未使用CSA处理的JD08菌株中经过修饰的类脂A的比例，使用CSA处理的JD08菌株中未修饰的类脂A的比例则发生了显著改变，表明CSA抑制了MCR-1蛋白发挥磷酸乙醇胺转移酶催化活性，使形成的类脂A复合物大量减少。

1.3.5 小鼠体内验证CSA与多粘菌素B联合作用效果

将感染5×10

1.4 结论

本发明通过实验验证了CSA可显著增强多粘菌素B对

实施例2 MCR-1蛋白与CSA的互作研究

2.1 材料

2.1.1 载体

pET-28a载体由本实验室保存。

2.1.2 主要试剂

2.2 方法

2.2.1 含

转接5mL的JD08菌株于LB液体培养基中，在摇床中37℃、220rpm过夜培养，次日进行质粒提取。具体方法如下：

（1）将5mL的菌液在离心机中以8,000g的转速离心2min进行菌体收集。

（2）向EP管中加入250μL Resuspension Buffer重悬菌体。

（3）向EP管中加入250μL Lysis Buffer并轻柔上下颠倒EP管4-6次。

（4）向EP管中加入350μL Neutralization Buffer，立即轻柔上下颠倒EP管4-6次。

（5）将EP管在离心机中以至少14,000g的转速离心10min。

（6）将步骤（5）中得到的上清液体转移至Spin column内，并在离心机中以6,000g的转速离心1min，弃去管中液体。

（7）向Spin column中加入500μL PD Buffer，在离心机中以至少13,000g的转速离心1min，弃去管中液体。

（8）向Spin column中加入650μL Wash Buffer，在离心机中以至少13,000g的转速离心1min，弃去管中液体。

（9）重复步骤（8）

（10）将Spin column在离心机中以至少13,000g的转速空离2min，并转移至干净的新的1.5mL EP管中，并将Spin column的盖子打开在室温中静置2min，使膜干燥，以减少Wash Buffer对回收效率的影响。

（11）向Spin column中加入30-50μL的ddH

2.2.2 引物设计

根据Genbank上已经发表的

表5

2.2.3

以JD08菌株质粒为模板，

表6 PCR 反应体系

2.2.4 pET28a-

2.2.4.1

取

（1）将100μL的PCR产物转至1.5mL EP管中，加入400μL的CP Buffer,混匀并转移至Spin column内。

（2）将Spin column在离心机中以至少13,000g的转速离心1min，弃去管中液体。

（3）向Spin column中加入700μL DNA Wash Buffer，在离心机中以至少13,000g的转速离心1min，弃去管中液体。

（4）重复步骤（3）。

（5）将Spin column在离心机中以至少13,000g的转速空离2min，并转移至干净的新的1.5mL EP管中，并将Spin column的盖子打开在室温中静置2min，使膜干燥，以减少DNAWash Buffer对回收效率的影响。

（6）向Spin column中加入30-50μL的ddH

2.2.4.2 PCR 产物和载体的双酶切

将纯化后得到的PCR产物与pET-28a载体分别用

表 8 PCR 产物的双酶切

37℃水浴30min。

2.2.4.3 双酶切产物的胶回收

将经过

（1）使用干净的手术刀将目的片段切下并放入2mL的干净的EP管中。

（2）按照凝胶质量毫克数：溶胶液体积微升数=1：3的比例加入溶胶液ExtractionBuffer。注意凝胶质量不能超过400mg。

（3）将EP管放入58℃水浴锅中直至凝胶融化。

（4）将EP管内所有液体全部转移至Spin column中，在离心机中以至少6,000g的转速离心1min，弃去管中液体。

（5）向Spin column中加入500μL Extraction Buffer，在离心机中以至少12,000g的转速离心1min，弃去管中液体。

（6）向Spin column中加入750μL Wash Buffer，在离心机中以至少12,000g的转速离心1min，弃去管中液体。

（7）重复步骤（6）

（8）将Spin column在离心机中以至少12,000g的转速空离2min，并转移至干净的新的1.5mL EP管中，并将Spin column的盖子打开在室温中静置2min，使膜干燥，以减少Wash Buffer对回收效率的影响。

（9）向Spin column中加入50μL的ddH

2.2.4.4 目的片段与载体的连接

将胶回收后的目的片段与载体在20μL反应体系中使用T4 DNA 连接酶进行连接，构建重组表达载体质粒 pET28a-

表 9 目的片段与载体的连接

37℃水浴30min。

2.2.4.5 重组质粒 pET28a-

将连接后的重组载体质pET28a-

（1）将大肠杆菌 DH5α感受态细胞置于冰上融化。

（2）取10μL连接产物加入100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min，使重组载体充分黏附于感受态细胞表面。

（3）将EP管置于42℃水浴锅中，热激1min，使感受态细胞膨胀，膜表面的孔洞展开，使重组载体进入感受态细胞中。然后立即取出，冰浴 2 min，使膜表面的孔洞闭合，阻止其他基因进入感受态细胞中。

（4）向EP管中加入900μL的LB液体培养基，置于37℃、180rpm震荡培养 45min。

（5）在离心机中以4,000rpm的转速离心4min,弃去上清液，加入100μL的LB液体培养基重悬菌体， 涂于含有卡那霉素（50μg/mL)的LB 固体平板上，37℃过夜培养。

2.2.4.6 重组质粒 pET28a-

挑取LB固体培养基上的单菌落于5mL的含50μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基中过夜培养，第二天使用质粒小提试剂盒提取质粒，具体方法参考2.2.1。将提取后的质粒进行PCR和限制性核酸内切酶

2.2.5 MCR-1蛋白的诱导表达

2.2.5.1 MCR-1蛋白的少量表达

将测序正确的重组载体质粒pET28a-

（1）挑取单菌落于10mL含50μg/mL的卡那霉素的LB 液体培养基中，37℃培养，使OD

（2）将诱导后的菌液4,000rpm离心10min并用700μLPBS重悬。

（3）使用细胞超声破碎仪，35-38HZ，超声3S间歇3S，2min30s。15,000rpm离心20min，将上清和沉淀加入变性剂在沸水中煮5-10min。

（4）SDS-PAGE，140V，1h10min，考马斯亮蓝染色观察目的蛋白在上清或者沉淀中表达，并确定目的蛋白的表达量等情况。

2.2.5.2 MCR-1蛋白表达条件的优化

确定MCR-1蛋白表达后，通过对表达温度（16℃，25℃，37℃）、表达时间（4h，6h，12h，20h）、IPTG浓度（0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1mM）等条件进行优化，选出最佳条件用于MCR-1蛋白的表达。通过条件优化筛选确定MCR-1蛋白属于上清表达，最佳表达条件是16℃、12h、IPTG浓度为1mM。

2.2.5.3 MCR-1蛋白的大量表达

挑取单菌落于10mL含50μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养，次日转入1 L的含50μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD

2.2.6 MCR-1蛋白的纯化

（1）将菌体沉淀按照每克菌体湿重15-20mL的Lysis Buffer（50mM NaH

（2）将超声后的液体15,000rpm离心30min,留下上清进行镍柱亲和层析。

（3）向柱子中加入1mL的镍树脂，待液体流干后用10mL的去离子水冲洗2遍，再用20mM的咪唑溶液平衡镍柱，4℃过夜或37℃、2h。

（4）纯化前使用Binding Buffer平衡3次，每次20mL。

（5）将上清加入镍柱，控制流速在1mL/min，反复过蛋白上清6-8次。或者在旋转混合仪中加入20mL蛋白上清，4℃过夜。

（6）用Binding Buffer清洗镍柱3次，每次15-25mL，轻吹镍柱混合，并收集留样。

（7）使用不同浓度的咪唑溶液（5mM 、10mM、20mM、40mM、60mM、80mM、100mM、250mM）进行蛋白洗脱，并留样。

（8）SDS-PAGE观察蛋白洗脱情况，并将含有目的蛋白最多并且最纯的咪唑洗脱液进行浓缩并用脱盐柱进行脱盐处理。

（9）进行镍柱重生：加入5mL的EDTA静置10-20min后放出；加入5min 8M的尿素静置10-20min后放出；加入20mL的无水乙醇、20mL 75%乙醇、20mL 50%乙醇、20mL 20%乙醇；加入40mL去离子水冲洗；加入2mL NaCl混匀静置10-20min，去离子水冲洗20-40mL，20%乙醇溶液中长期保存。

2.2.7 MCR-1蛋白与CSA的Biacore分子互作检测

利用 Biacore T200 系统和 CM5 芯片检测小分子与蛋白结合的动力学和亲和力。Biacore技术是1990年发展起来的一种基于表面等离子共振（SPR）物理光学现象发展起来的一种新型生物传感分析技术。Biacore技术能够检测蛋白与大分子如蛋白、蛋白与小分子如中药单体和核酸等、细胞与病毒等之间的相互作用

Biacore技术的检测原理主要是通过光的偏振来实现的。当入射光在介质表面产生全发射时，其反射光的强度在各个角度上都是相同的。在介质表面镀上一层金属薄膜，则入射光可以引起金属中自由电子的共振，将导致反射光在一定角度内减弱，其中反射光完全消失的角度被称为为共振角。共振角会随着金薄膜表面所通过液相的折射率的改变而改变，而折射率的变化又与结合在金属薄膜表面的生物分子质量成正比。将被蛋白固定在传感芯片的表面，样品从液体微流路通道流过检测芯片，待测物若能够与蛋白发生结合，芯片表面的物质量会发生变化，共振角也发生改变，同时仪器所记录的响应值（Response,Ru）也会改变。而当缓冲液流过芯片表面，若待测物与蛋白发生解离时，其对应的响应值也会有变化，将这种响应值的改变通过拟合分析就能看出生物分子间的亲和性及特异性等信息

2.2.7.1 配体预富集

（1）将CM5芯片安装在Biacore T200中，首先使用偶联缓冲液（1.05×PBS-p+）冲洗系统。

（2）使用2通道进行配体预富集实验，根据蛋白等电点选择合适PH的醋酸钠溶液，一般为PH4.0、PH4.5、PH5.0、PH5.5。

（3）使用手动模式，流速设为10μL/min，通道设为Flow path 2。

（4）准备4个1.5ml EP管，取2μl配体，加入98μl不同pH的醋酸钠缓冲液（10mM ，pH4.0、4.5、5.0、5.5）充分混匀，配体的最终浓度约为20μg/ml，另取1个1.5ml EP管，加入200ul氢氧化钠（50mM ）。

（5）将试管架安装进Biacore T200 中，记录几个EP管所处的位置，点击注射命令并在样品位置图中点击PH5.5的醋酸钠溶液所处的位置。设定进样时间为120秒。再点击再生命令并选择NaOH所处的位置，进样时间为30秒。重复此命令进样其他PH的醋酸钠溶液。

（6）根据生成的信号图判断不同PH的醋酸钠所能偶联的最高值和最低值，再根据两者的差值判断所选择的最适PH进行正式实验。

2.2.7.2 配体偶联

采用氨基偶联法将目的蛋白偶联到CM5芯片上，根据公式R

（1）采用immobilization自动法进行氨基偶联，使用2通道按照程序要求输入配体名称、偶联量/偶联时间，并将EHC、NHS和NaOH放入相应位置，开始程序。

（2）采用Manual Run手动法进行氨基偶联，先处理Flow Path 1通道，Flow rate：10μL/min，将EDC/NHS混合的EP管放在R1D1位置，乙醇胺放在R1D3位置。

（3）首先进行活化，点击注射命令，在样品位置图中点击R1D1位置。设定进样时间为420秒，再进行封闭，点击注射命令，在样品位置图中点击R1D1位置。设定进样时间为300秒。

（4）处理Flow Path 1通道，Flow rate：10μL/min，将EDC/NHS混合的EP管放在R1D1位置，pH为4.0的蛋白（至少稀释20倍）放在R1D2位置，乙醇胺放在R1D3位置。

（5）首先进行活化，点击注射命令，在样品位置图中点击R1D1位置。设定进样时间为420秒。

（6）再进行耦联。点击注射命令，在样品位置图中点击R1D1位置。设定进样时间为300秒。若达到目标偶联量则进行封闭，若未达到则重复此命令至达到目标偶联量为止。

（7）最后进行封闭，点击注射命令，在样品位置图中点击R1D1位置。设定进样时间为300秒。

（8）所有命令都完成后，点击结束命令，退出手动运行模式。

2.2.7.3 样品检测

（1）小分子样品的运行缓冲液选用含5%的DMSO的PBS-P+，首先准备含5%的DMSO的运行缓冲液200mL，并准备含4.5% 和 5.8% 的DMSO 的PBS-P+配置溶剂校正曲线。矫正曲线配置方法如下表10：

（2）使用含5%的DMSO的运行缓冲液将小分子抑制剂配置成不同浓度梯度的分析物，至少含有5个连续浓度和一个0浓度和重复浓度。

（3）使用Wizard→Assay→kinetics/Affinity进行样品循环检测，Flow path 通道选择：2-1，Chip type 芯片选择：CM5。取消再生命令，增加溶剂矫正命令。

（4）进样时间60s，流速30μL/min，解离时间60s。由低到高输入分析物浓度并在最高浓度后输入重复浓度。5、按照位置图在试管架中放置EP管。保存设定程序及结果，开始检测。

2.3 结果

2.3.1

以JD08菌株提取的质粒为DNA模板，设计特异性引物，经PCR 扩增

2.3.2 MCR-1蛋白的诱导表达

将pET28a-

2.3.3 MCR-1蛋白的纯化

菌液超声后经镍柱纯化，分别用5mM、10mM、20mM、40mM、60mM、80mM、100mM、250mM的咪唑溶液洗脱，SDS-PAGE显示在38ku处有目的蛋白表达，与预期一致，80mM 咪唑洗脱时可以收集大量蛋白，纯度较高无其它蛋白杂带（图10）。

2.3.4 MCR-1蛋白与CSA的Biacore分子互作检测

将MCR-1蛋白偶联的CM5芯片通过与不同浓度的CSA作用，检测MCR-1蛋白与CSA的亲和力，Biacore分析结果显示，CSA与MCR-1蛋白相互作用，其响应值（Response）随CSA浓度增高不断增强，根据拟合结果（图11）分析显示，MCR-1蛋白与其小分子抑制剂CSA的亲和力常数为13.7μmol/L，小于1mmol/L，表明两者之间存在直接结合，CSA属于MCR-1蛋白的小分子抑制剂。

2.4 结论

本发明以

MCR-1蛋白属于磷酸乙醇胺转移酶，它的底物为磷酸乙醇胺和类脂A，我们最初设计两种方法进行验证MCR-1蛋白的体外抑制效果。第一种是将不同浓度的MCR-1蛋白、不同浓度的CSA与足够量的标准品底物磷酸乙醇胺和类脂A在体外模拟菌体内环境进行反应，将反应物通过TLC薄层析和质谱进行分析。第二种是使用Biacore大分子互作仪进行验证。考虑到体外模拟反应的反应时间、温度以及样品浓度的选择复杂，以及TLC薄层析和质谱只能够反应两者是不是能够产生结合，而不知道两者具体的结合力情况，我们选择Biacore验证两者的亲和力，结果证明了CSA与MCR-1蛋白存在相互作用。