单一聚合度壳寡糖在睡眠剥夺引起的认知障碍中的应用

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，尤其涉及一种单一聚合度壳寡糖在睡眠剥夺引起的认知障碍中的应用。

背景技术

在现代的24小时制社会中，睡眠不足是一个普遍而突出的问题，相关流行病学调查显示，我国睡眠障碍疾病发生率很高，有各类睡眠障碍者约占总人口的38％。睡眠剥夺是指让个体缺乏正常节律的睡眠，以往研究显示，睡眠剥夺会对人类健康造成负面影响，长期慢性睡眠剥夺一直被认为与各种疾病——如高血压、糖尿病、肥胖症和抑郁症的患病风险上升有关。在严重的情况下，睡眠剥夺还可能引起认知退步和行为障碍，但对于其是如何影响人脑内的神经活动尚不明确，正因机制的不明确，目前尚未有睡眠剥夺导致认知下降的有效药物出现。

目前有关于睡眠剥夺导致的认知损害治疗方法的报道，如激活海马liver Xreceptors(LXRs，肝脏X受体)可以通过HMGB1/TLR4/NF-κB p65信号通路抑制神经炎症而缓解睡眠剥夺(SD)所致认知功能损害；通过AMPA受体去磷酸化而减弱其功能，Homer 1a作为睡眠-觉醒调控重要因子，致睡眠期间兴奋性突触功能递减，以利于突触重塑及记忆固化；比格列酮可通过激活PPARγ(过氧化物酶体增殖体激活受体γ)继而促进神经元前体细胞增殖、分化而减缓因睡眠剥夺所致认知障碍。但以上方法由于各种原因均未进入临床阶段，因此仍需寻找一种新的针对睡眠剥夺引起的认知损伤的治疗方法。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种辅助预防睡眠剥夺诱导记忆认知下降的功能性食品或药物，为单一聚合度壳寡糖的应用进行了进一步拓展。

本发明的第一个目的是提供单一聚合度壳寡糖在制备预防或治疗睡眠剥夺引起的认知障碍的药物或功能性食品中的应用，所述单一聚合度壳寡糖的聚合度为3或5，脱乙酰度为90-100％。

进一步地，所述单一聚合度壳寡糖的用量为0.06-0.07g/kg。

进一步地，给药方式为口服或注射。

进一步地，所述药物或功能性食品为减少小胶质细胞和星形胶质细胞激活的药物或功能性食品。

进一步地，所述药物或功能性食品为调控AMPK/p-AMPK信号通路的药物或功能性食品。

进一步地，所述药物或功能性食品为调节神经生长相关蛋白43的药物或功能性食品。

进一步地，所述药物或功能性食品为改善脑组织病理学的药物或功能性食品。

本发明的第二个目的是提供一种预防或治疗睡眠剥夺引起的认知障碍的药物，所述药物包括聚合度为3或5，且脱乙酰度为90-100％的单一聚合度壳寡糖。

本发明的第三个目的是提供一种缓解睡眠剥夺引起的认知障碍的功能性食品，所述功能性食品包括聚合度为3或5，且脱乙酰度为90-100％的单一聚合度壳寡糖。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明采用的壳寡糖分子量明确，聚合度单一，利用聚合度为3和聚合度为5的壳寡糖单体，可以预防睡眠剥夺诱导的记忆认知下降。单一聚合度壳寡糖可以通过改善脑组织病理学、减少小胶质细胞和星形胶质细胞的激活，调控AMPK/p-AMPK信号通路，改善机体氧化应激损伤及炎症反应，进而对睡眠剥夺小鼠的认知能力与学习记忆能力进行修复与改善，可开发成辅助改善记忆认知下降的功能食品，同时也为壳寡糖在辅助改善记忆认知功能方面的应用提供有力的研究基础。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明做进一步详细的说明。

图1为单一聚合度壳寡糖对睡眠剥夺小鼠纹状体神经生长相关蛋白43(GAP43)的影响结果图；

图2为单一聚合度壳寡糖对睡眠剥夺小鼠认知与记忆能力的影响结果图；

图3为不同脱乙酰度壳三糖对睡眠剥夺小鼠神经生长相关蛋白43(GAP43)的影响结果图；

图4为不同脱乙酰度壳三糖对睡眠剥夺小鼠认知与记忆能力的影响结果图；

图5为单一聚合度壳寡糖对睡眠剥夺小鼠体重的影响结果图；

图6为单一聚合度壳寡糖对睡眠剥夺小鼠脑组织形态的影响结果图；

图7为单一聚合度壳寡糖对睡眠剥夺小鼠海马神经炎症的影响结果图；

图8为单一聚合度壳寡糖对睡眠剥夺小鼠纹状体腺苷酸活化蛋白激酶AMPK/磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶p-AMPK通路蛋白水平的影响结果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

本发明涉及的实验方法如下：

(1)选取7周龄SPF级C57BL/6J雄性小鼠60只(购自斯贝福生物技术有限公司)，预饲养7天后，根据体重随机分组：

组别1为单一聚合度的全脱乙酰化壳寡糖：壳二糖、壳三糖、壳四糖、壳五糖

组别2为不同脱乙酰度壳三糖：50％脱乙酰度壳三糖、70％脱乙酰度壳三糖、90％脱乙酰度壳三糖、全脱乙酰化壳三糖。

实验期间对小鼠进行21天的睡眠剥夺，采用MMPM睡眠剥夺法建立睡眠剥夺模型，实验箱均为40×30×20cm的透明水箱，其中模型组的箱底安置20个圆形小平台，高为5cm，直径为3cm，每个平台间隔4cm；空白组的箱底安置15个圆形大平台，高为5cm，直径为12cm。

组别1：把模型组的小鼠放到小平台上，小鼠进入睡眠后，由于肌张力降低而接触水或掉到水中，突然惊醒；把空白组的小鼠放到大平台上，小鼠可以正常睡眠。在透明水箱中装入干净的清水，使水面低于平台约1cm，箱顶盖上大小合适的鼠笼盖，放置饲料和水瓶，两组小鼠均可在平台间自由活动，随意进食饮水，整个睡眠剥夺的过程保持透明水箱中水的温度在22-24℃，每天定时更换透明水箱中的水。同时，在睡眠剥夺期间每天通过灌胃法对小鼠进行给药，给药剂量为0.065g/kg/d。用生理盐水将壳二糖～壳五糖分别配置成浓度为6.5mg/mL的溶液，给药体积为0.1mL/10g，在每天13：00对壳二糖组～壳五糖组进行灌胃，空白组和模型组给予同体积溶剂。

组别2：筛选出组别1中最优聚合度的壳寡糖，在睡眠剥夺期间每天通过灌胃法对小鼠进行给药，给药剂量为0.065g/kg/d。用生理盐水将脱乙酰度分别为50％、70％、90％和100％的最优聚合度的壳寡糖分别配置成浓度为6.5mg/mL的溶液，给药体积为0.1mL/10g，在每天13：00进行灌胃。

对不同组别进行新物体识别实验，行为学实验结束后，对小鼠全脑进行取材，在4％多聚甲醛溶液中，室温固定，用于HE染色实验测定；对小鼠海马和纹状体进行取材，-80℃深冻冰箱保存，用于蛋白质免疫印迹实验测定。

(2)在21天的睡眠剥夺实验结束后进行新物体识别实验：

新物体识别实验是在完全自由的状态下对实验动物进行学习记忆能力测试的行为学实验方法，以实验动物在对新物体和旧物体的嗅探次数和探索时间等作为评判指标，考察小鼠的记忆和认知能力。新物体识别实验分为适应阶段、熟悉阶段和测试阶段，每个阶段间隔24h。(1)适应阶段：将小鼠放入方盒内自由探索10min后，放回笼盒；(2)熟悉阶段：将两个完全相同的积木放在箱体一侧壁的左右两端，积木摆放的位置距两边的墙角分别为5cm。小鼠在放入箱内时背对着积木，从积木对面墙面的中心点放下，让小鼠在方盒内自由探索10min，记录熟悉阶段小鼠探索两个完全相同物体的时间，包括鼻子或嘴巴触及物体和距物体2cm范围内探究物体的时间(前爪搭载物体上、鼻子嗅物体、舔物体等均属于探究物体)；(3)测试阶段：间隔24h后，将其中的一个物体换成新积木，让小鼠在方盒内自由探索10min，记录测试阶段小鼠探索新物体和旧物体的时间、辨别指数。辨别指数＝(新物体探索时间-旧物体探索时间)/(新物体探索时间+旧物体探索时间)

(3)病理检测：

对小鼠脑组织切片进行HE染色并观察情况：

小鼠脑组织在4％多聚甲醛溶液中固定24小时后，将组织块移至包埋盒中脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、烤片，HE染色后，于光学显微镜下观察。

(4)蛋白质免疫印迹实验：

向每个脑组织样本中加入200μL的RIPA裂解液(预先加入2μL的PMSF)，使用高通量组织研磨器60Hz运行90s将组织匀浆，在冰上裂解30min，之后用高速离心机4℃，13000g离心5min，使用BCA试剂盒测定总蛋白含量，将提取的蛋白样本按照比例加入上样缓冲液，沸水浴10min，使蛋白变性。采用10％分离胶和5％浓缩胶配置SDS-PAGE凝胶，每孔上样20μg～40μg。设置电压80V，开始电泳，待浓缩胶跑完，将电压升高到120V，待溴酚蓝跑到底，停止电泳。从电泳胶上将目标条带切下，按照滤纸/电泳胶/PVDF膜/滤纸制作三明治模型，在250mA恒定电流作用下，转膜。按照分子量不同，选择不同转膜时间。转膜结束后，用TBST洗涤PVDF膜3次，每次5min。然后将膜用5％脱脂乳封闭2h，用TBST洗涤PVDF膜3次，每次5min。采用一抗稀释液稀释一抗：GAP43(1:2000)、GFAP(1:2000)、Ibal-1(1:1000)、AMPK(1:1000)、p-AMPK(1:1000)，将PVDF膜在4℃下与一抗孵育过夜。回收一抗后，用TBST洗涤PVDF膜5次，每次5min。然后与相应的二抗(1:2000)常温孵育2h，用TBST洗涤PVDF膜5次，每次5min。采用特超敏ECL化学发光试剂盒进行显影，在Chemi Doc XRS+成像系统(Bio-Rad，Hercules CA，USA)拍照，并用ImageJ进行光密度分析计算，进行显著性分析。

(4)统计学方法：

采用SPSS19.0统计软件中的one-way ANOVA方法对实验数据进行多重比较、差异显著性检验分析。

实施例1单一聚合度壳寡糖对睡眠剥夺小鼠纹状体神经生长相关蛋白43(GAP43)的影响

GAP43参与调节突触前神经元的生长、神经传递、神经细胞生成，在学习和记忆中起着重要作用。参考图1可知，与空白组相比，模型组小鼠的GAP43蛋白表达量显著降低(P＜0.01)。与模型组相比，壳三糖和壳五糖组小鼠GAP43蛋白表达量显著增加(P＜0.01)，在所有单一聚合度壳寡糖干预组中，壳三糖组GAP43蛋白表达量最高。

实施例2单一聚合度壳寡糖对睡眠剥夺小鼠认知与记忆能力的影响

参考图2可知，与空白组相比，模型组的辨别指数为负(P＜0.01)，说明模型组小鼠并未对旧物体形成深刻记忆，对新物体的偏好降低。与模型组相比，单一聚合度壳寡糖组小鼠的辨别指数显著大于模型组(P＜0.01)，其中，壳三糖组小鼠辨别指数最高，说明壳三糖对提高睡眠剥夺小鼠的记忆和认知能力有更好的作用。

实施例3不同脱乙酰度壳三糖对睡眠剥夺小鼠纹状体神经生长相关蛋白43(GAP43)的影响

参考图3可知，与50％和70％脱乙酰度壳三糖组相比，全脱乙酰化壳三糖组小鼠GAP43蛋白表达量显著增加(P＜0.05)，在不同脱乙酰度壳三糖干预组中，全脱乙酰化壳三糖组GAP43蛋白表达量最高。

实施例4单一聚合度壳寡糖对睡眠剥夺小鼠认知与记忆能力的影响

参考图4可知，与50％和70％脱乙酰度壳三糖组相比，全脱乙酰化壳三糖组小鼠的辨别指数极显著增加(P＜0.01)，与90％脱乙酰度壳三糖组相比，全脱乙酰化壳三糖组小鼠的辨别指数显著增加(P＜0.05)，全脱乙酰化壳三糖组小鼠的辨别指数最高，说明全脱乙酰化壳三糖对提高睡眠剥夺小鼠的记忆和认知能力有更好的作用。

实施例5单一聚合度壳寡糖对睡眠剥夺小鼠体重和脑组织的影响

综上，全脱乙酰化壳三糖组对睡眠剥夺小鼠认知与记忆能力的改善效果最为显著。该治疗组小鼠的体重情况和脑组织形态情况见图5和图6。

从图5中可看出，单一聚合度全脱乙酰化壳三糖灌胃后在第9天开始就能够极显著改善睡眠剥夺小鼠的体重下降(P＜0.01)，且明显改善睡眠剥夺引起的小鼠精神萎靡、烦躁不安、应激反应等情况。

从图6中可看出，与空白组相比，模型组神经细胞有明显的的固缩变形，排列不规则，细胞间隔变大，部分神经细胞出现坏死变形，说明睡眠剥夺导致小鼠脑组织形态损伤明显。与模型组相比，单一聚合度全脱乙酰化壳三糖组小鼠脑组织形态明显恢复，神经细胞排列紧密，层次清除，细胞结构完整、细胞核清晰，说明本发明单一聚合度壳寡糖对改善睡眠剥夺小鼠的神经细胞损伤有一定的作用。

实施例6单一聚合度壳寡糖对睡眠剥夺小鼠海马神经炎症的影响

小胶质细胞和星形胶质细胞活化是介导中枢神经系统损伤和神经系统炎症的重要原因。Iba1蛋白是小胶质细胞激活的标志物，GFAP蛋白是星形胶质细胞激活的标志物。从图7中可知，与空白组相比，模型组小鼠的Iba1蛋白表达量显著增加(P＜0.01)。与模型组相比，单一聚合度壳寡糖组Iba1蛋白表达量显著降低(P＜0.01)，说明本发明单一聚合度壳寡糖可以有效抑制小胶质细胞的反应性增生。与空白组相比，模型组小鼠的GFAP蛋白表达量显著增加(P＜0.01)。与模型组相比，单一聚合度壳寡糖组GFAP蛋白表达量显著降低(P＜0.01)，说明本发明单一聚合度壳寡糖可以有效抑制星形胶质细胞的反应性增生。

实施例7单一聚合度壳寡糖对睡眠剥夺小鼠纹状体腺苷酸活化蛋白激酶AMPK/磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶p-AMPK通路蛋白水平的影响

AMPK/p-AMPK信号通路被证明参与机体氧化应激损伤及炎症反应。参考图8可知，各组AMPK蛋白表达水平均无明显统计学差异(P＞0.05)。与空白组相比，模型组中p-AMPK蛋白表达水平显著下降。与模型组相比，单一聚合度壳寡糖组p-AMPK蛋白的表达水平显著回升(P＜0.05)，说明本发明单一聚合度壳寡糖可能通过调控AMPK/p-AMPK信号通路，改善机体氧化应激损伤及炎症反应。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。