用于检测EGFR基因的引物探针组合及试剂盒和方法
文献发布时间:2023-06-19 18:58:26
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别是涉及用于检测EGFR基因的引物探针组合及试剂盒和方法。
背景技术
表皮生长因子受体(EGFR)基因突变是东亚人群中非小细胞肺癌(NSCLC)最常见的驱动基因突变,突变率为30%~40%。既以往多项研究支持EGFR-酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗是EGFR基因突变局部晚期或转移NSCLC患者的标准治疗方案,但几乎所有服用EGFR-TKI的患者最终都会出现耐药,其中EGFR基因第20号外显子发生错义突变,20号外显子第790号位置上的甲硫氢酸(M)替代苏氨酸(T)(T790M突变)是耐药突变中最主要的类型。目前已报道的EGFR-TKI耐药后组织样本的T790M突变阳性率基本在60%左右,血浆样本T790M突变阳性率基于不同方法差别较大,在23%~63%。目前,美国国立综合癌症网络(NCCN)、欧洲临床肿瘤协会(ESMO)指南、中国临床肿瘤学会(CSCO)原发性肺癌诊疗指南均推荐奥希替尼为局部晚期或转移NSCLC EGFR-TKI耐药后T790M突变阳性患者的标准治疗。EGFR基因T790M突变检测对EGFR-TKI耐药的晚期NSCLC患者后续治疗具有重要的临床指导意义。
目前基因突变常用的检测方法包括:sanger测序法、荧光PCR法、高分辨溶解曲线法、高通量测序法等。sanger测序法过程操作繁琐、耗时长,且对取材和技术要求比较高,并且由于自身的限制导致其灵敏度不高,仅可检测丰度超过20%的突变,假阴性较多。高通量测序法价格昂贵,读长大约30-250bp,比Sanger测序短,对序列拼接造成了负担,检测结果仍需要Sanger测序验证,并且对于检测外显子与内含子交界区的小片段缺失的准确性不够。高通量测序法操作繁琐,限制了测序速度。传统荧光PCR法操作简单,能极大的避免扩增产物的污染。但该方法不能实现精准定量,尤其是低丰度突变。
数字PCR(digital PCR,dPCR)技术,即通过将一个样本分成大量等份,然后分配到不同的独立反应,每个独立反应单元至少包含一个拷贝的目标分子(核酸模板),在每个独立反应的中分别对目的模板分子进行PCR扩增,然后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析,就可以推算出原始溶液的核酸浓度。目前数字PCR主要在癌症标志物、稀有突变检测、致病微生物检测、基因表达分析以及拷贝数变异分析等科研领域有较广泛的应用,同时也可以与高通量测序无缝对接,验证测序结果。
市面已有试剂盒的问题(图1):1)FAM通道存在非特异性扩增;2)阴阳性区分不明显;3)标准品中阳性与非特异性荧光值条带合并,突变比例错误。
为了解决现有技术中存在的问题,因此急需要一种特异性检测EGFR基因的引物探针组合、试剂盒,防止PCR产物造成的假阳性,并提高检出的特异性和准确性。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供检测EGFR基因的引物探针组合及试剂盒和方法,以期解决现有技术中Taqman探针在特异性结合目的序列时无法达到100%的特异性结合,导致无法精准判断是否存在基因突变,以及cfDNA成分复杂、目的核酸含量低等特点,导致靶基因浓度低于检测限时能造成假阴性结果的问题。
为实现上述目的,本发明具体采用如下技术方案。
本发明的第一方面保护检测EGFR基因的引物探针组合,包括用于检测T790M的突变型引物和突变型探针,以及野生型探针;
所述突变型引物的序列包括如SEQ ID NO.1所示序列和SEQ ID NO.2所示序列;
所述突变型探针的序列包括如SEQ ID NO.3所示序列;
所述野生型探针的序列包括如SEQ ID NO4所示序列。
突变型引物(F):AGGAAGCCTACGTGATGGC(SEQ ID NO.1)
突变型引物(R):GAGCAGGTACTGGGAGCCAAT(SEQ ID NO.2)
突变型探针(Pm):5′荧光基团-CAGCTCATCATGCAG-3′猝灭基团(SEQ ID NO.3)
野生型探针(Pw):5′荧光基团-TGCCTCCTGGACTATGTCC-3′猝灭基团(SEQ ID NO.4)
在某些实施方式中,所述突变型探针和所述野生型探针的两端均分别标记荧光基团和淬灭基团,且所述突变型探针和所述野生型探针上标记的荧光基团不相同。
在某些具体的实施方式中,所述荧光基团选自FAM、HEX、VIC、ROX、CY5和CY5.5中的一种。
在某些更具体的实施方式中,所述突变型探针上标记的荧光基团为FAM。
在某些更具体的实施方式中,所述野生型探针上标记的荧光基团为HEX。
在某些具体的实施方式中,所述猝灭基团选自MGB、BHQ1和BHQ2中的一种。
在某些更具体的实施方式中,所述突变型探针上标记的猝灭基团为MGB。
在某些更具体的实施方式中,所述野生型探针上标记的猝灭基团为MGB。
在某些实施方式中,所述引物探针组合还包括封阻探针(Pt)。
优选地,所述封阻探针的序列包括如SEQ ID NO.5所示序列。
封阻引物(Pt):CAGCTCATCACGCAGCTCAT(SEQ ID NO.5)
本发明的第二方面保护如上文所述的引物探针组合在制备检测产品中的用途。
在某些实施方式中,所述检测产品为EGFR-酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)耐药性检测产品。所述检测产品采用数字PCR检测EGFR基因的突变率。
在某些实施方式中,所述检测产品包括试剂盒、膜条、芯片、检测试剂和检测系统。
在一实施方式中,所述检测产品为试剂盒时,所述试剂盒包括检测混合液(包含目的基因引物探针组合)、阳性质控品、阴性质控品和PCR反应预混液。
在一实施方式中,所述检测产品为芯片,所述芯片上固定有如上所述的用于检测EGFR基因的引物探针组合。
在一实施方式中,所述检测产品为检测试剂。所述检测试剂中包括如上文所述的用于检测EGFR基因的引物探针组合。
在一实施方式中,所述检测产品为检测系统。所述检测系统包括试剂盒和检测装置,例如数字PCR样本制备装置、基因扩增装置和数字PCR阅读装置,形成数字PCR系统。
本发明的第三方面保护一种检测EGFR基因的试剂盒,所述试剂盒包含如上文所述的引物探针组合。
在某些实施方式中,所述突变型引物在反应体系的浓度为200~500nM。突变型引物的浓度可以为200~310nM,也可以为300~430nM,也可以为420~500nM。在某个具体地实施方式中,为250nM。
在某些实施方式中,所述突变型探针在反应体系的浓度为200~500nM。突变型探针的浓度可以为200~350nM,也可以为320~440nM,也可以为410~500nM。在某个具体地实施方式中,为250nM。
在某些实施方式中,所述封阻探针在反应体系的浓度为200~500nM。封阻探针的浓度可以为200~310nM,也可以为300~430nM,也可以为420~500nM。在某个具体地实施方式中,为250nM。
在某些实施方式中,所述野生型探针在反应体系的浓度为200~500nM。野生型探针的浓度可以为200~310nM,也可以为300~430nM,也可以为420~500nM。在某个具体地实施方式中,为250nM。
本申请中反应体系是指检测混合液、阳性质控品、阴性质控品和PCR反应预混液形成的混合体系。
在某些实施方式中,所述试剂盒还包括:阳性质控品、阴性质控品、PCR反应预混液和表面活性剂中的一种或多种。
在某些更具体的实施方式中,所述PCR反应预混液包含PCR缓冲液、dPCR酶、dNTPs和水中的一种或多种。
优选地,所述dPCR酶包括Taq酶和UDG酶中的一种或两种。
优选地,所述阳性质控品为T790M阳性标准品(T790M阳性细胞系,T790阴性基因组DNA,核酸酶水,DNA浓度5ng/μL),突变频率50%。
优选地,所述阴性质控品为T790M阴性标准品(T790阴性基因组DNA、核酸酶水、DNA浓度5ng/μL)。
优选地,所述PCR缓冲液包括:500mM Tris-HCl、100mM KCl、50mM(NH
在某些的实施方式中,所述试剂盒还包括表面活性剂。
在某些具体的实施方式中,所述表面活性剂选自吐温-20。
在反应体系中加入终浓度不低于0.01wt%的吐温-20。优选地,终浓度为0.01wt%。本申请中加入表面活性剂(吐温-20)帮助微滴入孔形成独立反应单元,有利于后续校正以及QC检测。
本发明的第五方面保护一种检测EGFR基因突变的方法,包括如下步骤:
1)提供基因组DNA;
2)采用如上文所述的引物探针组合对所述基因组DNA进行PCR扩增,得到PCR产物;
3)对所述PCR产物进行分析,通过荧光信号位置和强度检测T790M突变型和野生型,并对其进行定量。
T790M突变率的计算公式为:
在某些的实施方式中,所述PCR扩增的程序为:PCR扩增反应的条件为:95℃预变性5分钟,1个循环;95℃变性30秒、56℃退火45秒,45个循环。
在某些的实施方式中,所述基因组DNA来源于待测样本。所述待测样本来自人血液或组织切片中的一种或两种。
本发明的第五方面保护如上文所述的引物探针组合或如上文所述的试剂盒或如上文所述的方法在制备检测EGFR基因突变或耐药性的产品或筛选肿瘤药物中的用途。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
1)本申请通过筛选特异性强的引物、探针,结合封阻探针,获得了引物探针组合和试剂盒,其能高特异性、高灵敏度、高准确性地检测到EGFR基因中T790M突变,且能实现T790M位点的单独分型,实现T790M的精准检出。
2)本申请的引物探针组合、试剂盒和检测方法,批间精密度实验显示,FAM阳性拷贝数/HEX阳性拷贝数的比值(突变率)的变异系数(CV值)≤10%;检测限低于0.05copies/μL也可以精准检出。
3)本申请的检测方法操作步骤少,周期短,成本低。
4)本申请的引物探针组合、试剂盒和检测方法提供了一种肿瘤的分子学诊断方法或肿瘤药物的筛选方法,也为肿瘤早期诊断或肿瘤药物筛选提供了新的希望,特别是为肺癌新药Tagrisso对T790M突变患者治疗的用药指导。
附图说明
图1显示为现有技术中检测EGFR基因T790M突变型的试剂盒的检测结果。1)FAM通道存在非特异性扩增;2)阴阳性区分不明显;3)标准品中阳性与非特异性荧光值条带合并,突变比例错误。
图2显示为本发明的实施例1中10组引物探针组合的数字PCR荧光检测结果图。
图3显示为本发明的实施例2中采用不同荧光基团和淬灭基团标记T790M突变型的探针(Pm)的数字PCR荧光检测结果图。
图4显示为本发明的实施例2中采用不同荧光基团和淬灭基团标记T790M突变型的探针(P
图5显示为本发明的实施例2中不加封阻引物(P
图6显示为本发明的实施例2中引物和突变探针浓度进行数字PCR荧光检测的检测结果图。
图7显示为本发明的实施例2中PCR体系中不添加UDG和添加UDG进行数字PCR荧光检测的检测结果图。
图8显示为本发明的实施例3中弱阳性参考品(突变频率5%)、中阳性参考品(突变频率25%)和强阳性参考品(突变频率50%)参考品进行数字PCR荧光检测的检测结果图。
图9显示为本发明的实施例3中低浓度阴性参考品(1ng/μL)和高浓度阴性参考品(10ng/μL)进行数字PCR荧光检测的检测结果图。
图10显示为本发明的实施例3中针对弱阳性参考品(突变频率5%)采用2个批次的试剂盒分别进行10次重复检测进行数字PCR荧光检测的检测结果图。
图11显示为本发明的实施例3中检测限参考品进行数字PCR荧光检测的检测结果图。
图12显示为本发明的实施例2中反应体系中添加不同浓度的吐温-20进行数字PCR荧光检测的检测结果图。
具体实施方式
现有技术中T790M是单碱基突变,Taqman探针在特异性结合目的序列时无法达到100%的特异性结合,导致无法精准判断是否存在基因突变;此外,由于病人真实样本(cfDNA)成分复杂,目的核酸含量低等特点,过少、过度降解、突变类型不在试剂盒检测范围或者扩增反应体系中靶基因浓度低于检测限亦可造成假阴性结果,这是现阶段检测EGFR基因T790M突变的产品中普遍存在的问题。
因此,本申请通过Taqman+封阻探针联合设计,高灵敏度、高准确性地检测T790M,提供了一种无创性肿瘤诊断的新方法,也为肿瘤早期诊断提供了新的希望,为肺癌新药Tagrisso对T790M突变患者治疗的用药指导。
为了上述目的,本申请通过筛选出能特异性结合EGFR基因T790M突变的引物、突变型探针,以及针对野生基因检测的野生型探针;同时,筛选得到封阻探针,其能与非特异扩增序列结合,降低背景杂音,提高T790M突变检出的特异性和准确性;接着,优化PCR扩增体系在同一扩增体系、同一扩增程序内同时对目标靶基因和人的基因组进行扩增检测,有效对PCR过程进行监控,防止假阴性出现;进一步,通过在扩增体系中同时加入dUTP/UNG酶防污染体系,防止因PCR产物造成的假阳性等。同时结合采用数字PCR方法,能定性和定量检测EGFR基因T790M突变。
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式,熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
在进一步描述本发明具体实施方式之前,应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法,通常按照常规条件,或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时,应理解,除非本发明另有说明,每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义,本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外,根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载,还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1引物探针组合的筛选
本实施例中,进行EGFR基因的引物探针组合的筛选,包括如下:
1.1、扩增引物和探针引物的筛选
在EGFR基因第20号外显子的设计了10组用于检测T790M突变型引物、T790M突变型探针(Pm)和用于检测野生型基因的野生型探针(Pw),10组引物探针组合中均加入封阻探针(Pt),并对其进行评估筛选,10组引物探针组的序列见表1。
表1
1.2、阳性质控品和阴性质控品
阳性质控品为核酸标准品
阴性质控品为种属纯化的人Genomic DNA(购买自Promega公司,Lot#0000551471),Qubit3.0检测结果浓度为177ng/μL,突变频率为0%,将Genomic DNA稀释至5ng/μL作为阴性质控品。
将核酸标准品稀释至0.5ng/μL作为检测线参考品(突变比例50%)。
将核酸标准品稀释至10ng/μL作为强阳性参考品(突变比例50%)。
将10ng/μL强阳性参考品与10ng/μL阴性参考品1:1混合作为中阳性参考品(突变比例25%)。
将10ng/μL强阳性参考品与10ng/μL阴性参考品1:9混合作为弱阳性参考品(突变比例5%)。
1.3、PCR反应体系配制
根据下表2配制PCR反应体系(总体积20μL)。
按照以下配方制备N个反应的dPCR反应液预混液。
N=待测样本个数+阳性质控品+阴性质控品+1
表2
将上述反应液盖上管盖,瞬时离心,将反应液收集于管底,按照18μL每管分装至N-1个离心管中。
1.4、数字PCR工作流程
使用臻准生物科技(上海)有限公司生产的
1)加样:分别取核酸样本、步骤2.2的阴性质控品和阳性质控品各2μL加入到步骤1.3分装好的离心管中,体系配置完成,盖上管盖,混匀离心,进行样本制备,每个芯片上样后总体积为20μL。
2)PCR扩增:将芯片放到基因扩增仪INAP100B中进行扩增,进行热循环扩增反应,扩增程序设定如下表3所示。
表3
注:加好样品的PCR反应液或已经完成上样的芯片应立即上机实验;若因特殊原因不能及时上机反应,应将PCR反应液或完成进样的芯片放在4℃保存,保存时间不宜超过12h。
3)芯片阅读分析(PCR检测分区):
将扩增后的芯片放置于臻准生物INRD200A芯片阅读仪中,进行芯片阅读分析,计算T790M突变率。该芯片分析仪包含2个荧光通道(FAM/HEX)。通过芯片分析仪对每个微液滴进行FAM/HEX荧光信号检测,记录荧光信号的峰值高度,检测出相应的荧光信号。通过荧光分类阈值将微液滴内的荧光强度数字化,具有较强荧光的微液滴判读为“1”(阳性),具有较弱荧光的微液滴判读为“0”(阴性),统计“1”和“0”的个数,并通过泊松分布模型校正,可计算出投入模板中FAM和HEX标记的目标基因的总拷贝数。
T790M突变率的计算公式为:
阈值设定:阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照检测荧光信号的最高点。
质量控制:①阴性对照结果为:HEX通道有阳性点,但FAM通道没有阳性点;
②阳性对照结果为:FAM、HEX通道均有阳性点,且T790M突变率为100%。
同时满足①和②条件,方可进行结果判读,否则实验结果无效,需重新检测。
注:芯片阅读框中有油或水时,可用无尘布擦拭。
【检验结果的解释】
1)每次试验均需将试剂盒内的阴性对照、阳性对照与待检样本一同检测,检测结果应符合质量控制要求,否则本次实验结果无效。
2)如果待检样本HEX通道拷贝数大于等于10,且FAM通道阳性点数小于3;则判定该样本为EGFR基因T790M突变阴性。
3)如果待检样本HEX通道拷贝数大于等于10,且FAM通道阳性点数大于等于3;则判定该样本为EGFR基因T790M突变阳性。
4)如果HEX通道拷贝数小于10,则判定该样本采集或核酸提取失败,建议重新采样进行复测。
1.5、筛选结果
1.5.1、定量准确性和稳定性评估
本实验中每组引物探针组合中的GC含量、Tm值、错配重连度进行检测计算,结果见表4和表5。
表4
表5引物探针组内重连比对结果
表4和表5可知,第10组引物探针组的错配碱基数最少,GC含量高,Tm值接近且自由能值(kcal/mol)均在7以下,因此第十组为最佳选择。
1.5.2、荧光信号强度与聚集度评估
进一步地,采用数字PCR对10组的引物探针组合进行验证,结果见图1。
图2为10组引物探针组合的数字PCR荧光检测结果图。其中,X轴为液滴分布,Y轴为荧光信号强度。
从图2可知,第10组的阳性荧光信号强度更高,且阴阳性信号差值gap更大,即区分度更佳,另外从图中可以看出第10组聚集程度更佳。
综合以上结果,P
实施例2标记基团的筛选、及封阻引物的浓度筛选
本实施例中,进行不同荧光基团和淬灭基团标记T790M突变型的探针(Pm)、P
2.1不同荧光基团和淬灭基团标记T790M突变型探针(Pm)的筛选
分别以FAM、Cy5和CY5.5标记Pm探针的5’端,以MGB、BHQ、BHQ1和BHQ3标记Pm探针的3’端,得到4组,分别为5′FMA-Pm–3′MGB,5′FMA-Pm–3′BHQ1,5′Cy5-Pm–3′BHQ2和5′cy5.5-Pm–3′BHQ3,其中Pm代表探针的序列,具体序列为SEQ ID NO.3,采用实施例1的方法进行数字PCR荧光检测,结果见图3。
如图3所示,Pm探针标记荧光基团FAM和淬灭基团MGB效果最佳。
2.2不同荧光基团和淬灭基团标记野生型探针(P
分别以HEX、Cy5和CY5.5标记P
如图4所示,P
2.3封阻引物(P
设置3组,包括不加P
图5为不加P
从图5可知,加入特异性封阻序列,可提高检出的特异性和准确性,添加250nmol的P
2.4T790M突变型探针(P
分为3组包括:500nmol的Pm+500nmol的Pt、250nmol的Pm+500nmol的Pt和250nmol的Pm+250nmol的Pt,采用实施例1的方法进行数字PCR荧光检测。
图6为3组不同浓度的突变型探针(Pm)和封阻探针(Pt)的PCR荧光检测图。
从图6可知,突变型探针Pm及封阻探针Pt的最佳工作浓度均为250nM。
2.5UNG酶不添加和添加的筛选
在反应体系中不添加和添加UDG酶,采用实施例1的方法对实施例1中步骤1.2得到的阳性质控品(100copie/μL)进行数字PCR荧光检测。
图7为不加UDG酶和添加UDG酶进行PCR的荧光检测结果图。
从图7可知,使用UDG酶可明显增强荧光强度和降低定值偏差,定值误差是指(检测浓度-阳性质控品浓度)/阳性质控品浓度。
2.6反应体系中加入不同浓度吐温的筛选
在反应体系中添加终浓度分别为0、0.2%、0.5%和1%的吐温-20,采用实施例1的方法进行数字PCR荧光检测。每个浓度设置2个重复组。
图12为添加不同浓度的吐温-20进行PCR的荧光检测结果图。
从图12可知,在反应体系中加入终浓度为0.01wt%的吐温-20后荧光信号强和特征峰完整连续,说明加入1%的吐温-20有利于微滴入孔形成独立反应单元,有利于后续校正以及QC检测。
实施例3检测方法的方法学验证
本实施例中,从准确性、特异性、批间精密度、检测限考察本申请试剂盒。
3.1、准确性
以实施例1中步骤1.2中的1份弱阳性参考品(突变频率5%)、1份中阳性参考品(突变频率25%)和1份强阳性参考品(突变频率50%)为检测对象,进行数字PCR荧光检测,通过阳性符合率判断准确性,荧光检测结果见图8,阳性符合率结果见表6。
从图8和表6可知,弱阳性参考品3次重复检测结果表明,其FAM通道的拷贝数稳定在10.08~10.26copies/μL,HEX通道的拷贝数稳定在190.36~194.94copies/μL,进一步统计突变频率的批间平均值为5.28%,批间CV值为1.97%;中阳性参考品3次重复检测结果表明,其FAM通道的拷贝数稳定在47.36~48.81copies/μL,HEX通道的拷贝数稳定在188.2~195.67copies/μL,进一步统计突变频率的批间平均值为25.16%,批间CV值为1.11%;强阳性参考品3次重复检测结果表明,其FAM通道的拷贝数稳定在95.9~97.39copies/μL,HEX通道的拷贝数稳定在183.45~191.56copies/μL,进一步统计突变频率的批间平均值为51.83%,批间CV值为1.65%;且弱阳性参考品、中阳性参考品、强阳性参考品中T790M阳性且拷贝数也呈递增趋势;综合说明本申请的检测方法准确,阳性符合率为100%。
表6
3.2、特异性
以实施例1中步骤1.2中的Genomic DNA稀释成1份低浓度阴性参考品(1ng/μL)和1份高浓度阴性参考品(10ng/μL)并分别作为检测对象,进行数字PCR荧光检测,通过阳性符合率判断准确性,荧光检测结果见图9,阴性符合率结果见表7。
从图9和表7可知,低浓度阴性参考品和高浓度阴性参考品中FAM的拷贝数均为0,说明检测结果准确,无非特异性扩增,阴性符合率为100%。
表7
3.3批间精密度实验
取1份实施例1中步骤1.2得到的弱阳性参考品(突变频率5%)用2个批次的试剂盒分别进行10次重复检测,进行数字PCR荧光检测,通过阳性符合率判断准确性,荧光检测结果见图10,阳性符合率结果见表8。
从图10可知,一个批次的试剂盒的FAM通道的拷贝数稳定在7.79~9.05copies/μL,HEX通道的拷贝数稳定在181.9~195.16copies/μL;另外一个批次的试剂盒的FAM通道的拷贝数稳定在7.93~8.96copies/μL,HEX通道的拷贝数稳定在173.82~194.65copies/μL。
表8
从表8可知,20次检测结果均为T790M阳性,阳性符合率为100%,20次FAM阳性拷贝数/HEX阳性拷贝数的比值(突变率)的变异系数(CV值)≤10%,说明本申请的试剂盒批间精密度高。
3.4检测限
以实施例1中步骤1.2得到的检测限参考品(浓度为0.5copies/uL±10%)为起始样本,重复20次检测,进行数字PCR荧光检测,通过阳性符合率判断准确性,荧光检测结果见图11,阳性符合率结果见表9。
从图11可知,对于极低浓度的样本,本试剂盒也可精准检出。
表9
从表9可知,最低检测限为0.5个拷贝,阳性结果不少于19次。
临床样本检测
本实施例中,采用本申请的引物探针组合形成的试剂盒对10例肺腺癌和10例胃癌标本(肺腺癌和胃癌标本中均含有石蜡包埋组织和外周血)标本进行检测,同时采用IHC联合FISH的方法进行双盲检测,包括如下步骤:
1、样本准备
FFPE(Formalin-fixed paraffin-embedding)组织:用于T790M基因扩增检测的肿瘤组织标本,需采用4%中性甲醛固定,严格按照《临床技术操作规范病理学分册》进行石蜡包埋。每例样本切5~10μm的切片10张,其中2张切片用于HE染色筛选,样品中应至少含有30%肿瘤组织。余下的1~8张切片用于提取样本DNA。切片及刮取肿瘤组织过程中,要注意避免不同病例组织间的交叉污染。
血浆样本:使用一次性真空静脉血样采集容器收集至少8mL的全血样本(含聚酯凝胶/K
2、样本DNA提取
(1)FFPE样本:提取的DNA建议立即进行检测,长期请于-20℃±5℃下保存,保存时间不超过6个月。DNA浓度≥1ng/μL,浓度未达到要求的样本视为不合格,需重新准备DNA样品。
(2)血浆样本:提取的DNA建议立即进行检测,长期请于-20℃下保存,保存时间不超过6个月。总量大于15ng,浓度≥1ng/μL,1.6≤A260/280≤2.1。浓度未达到要求的样本和A260/280比值超出正常范围的样本视为不合格,需重新准备DNA样品。
FFPE组织推荐使用Qiagen公司的FFPE DNA提取试剂盒(QIAamp DNA FFPE TissueKit,Cat No.56404)。
血浆样本推荐使用Qiagen公司的血浆游离DNA提取试剂盒(QIAamp CirculatingNucleic Acid Kit,Cat No.55114)。
3、检测EGFR基因突变的方法
1)试剂配制举例(试剂准备分区)
从试剂盒中取出10×数字PCR反应液、20×T790M基因扩增检测反应液,室温融化后振荡混匀,离心数秒,按照以下表10的配方制备N个反应的dPCR反应液预混液。
N=待测样本个数+阳性质控品+阴性质控品+1
表10
将上述反应液盖上管盖,瞬时离心,将反应液收集于管底,按照18μL每管分装至N-1个离心管中。
2)加样(样本处理分区)
分别取步骤1中提取的核酸样本、阴性质控品和阳性质控品各2μL加入到分装好的离心管中,体系配置完成,盖上管盖,混匀离心,进行样本制备,每个芯片上样20μL。
3)扩增(PCR检测分区)
芯片进样完成后,取出芯片;然后将芯片置于基因扩增仪中,进行热循环扩增反应。推荐的反应程序如下表11。
表11
注:加好样品的PCR反应液或已经完成上样的芯片应立即上机实验;若因特殊原因不能及时上机反应,应将PCR反应液或完成进样的芯片放在4℃保存,保存时间不宜超过12h。
检测结果见表12。
表12
从表12可知,本试剂盒和检测方法的总符合率达到95.50%以上。
cfDNA真实样本的检测结果表明,本发明可以有效准确的检出T790M突变,对于极低浓度样本(0.05copies/μL)也可精准检出,并且可以达到低丰度突变频率(1/1000)的检出。性能得到很好的提升。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效,而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因此,举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变,仍应由本发明的权利要求所涵盖。
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