西洋参环介导等温扩增引物组及鉴定方法

技术领域

本发明涉及一种西洋参检测方法，更具体涉及西洋参环介导等温扩增的一组引物及其鉴定方法，属于中药材来源品种鉴定技术领域。

背景技术

西洋参为五加科人参属多年生草本植物，是常用的名贵中药,其根、茎、叶、花、果实等均可药用,具有较高的经济价值和药用价值。西洋参大体呈圆柱形、纺锤状，长约3～8cm，直径约0.5～2cm。西洋参表皮细洁，呈淡黄白色，伴有均匀的横向环纹，多见纵皱纹及横向皮孔。质地轻而致密，不易折断，切面光滑平整，粉质，可见放射状纹理及棕黄色的形成层，切片后迎光可见皮部和木部连接处有一似人民币防伪线的亮环。在药理作用方面西洋参具有降血压，改善心肌缺血，提高机体免疫力，治疗糖尿病和增强中枢神经系统的功能。

近年来，西洋参的市场需求量逐年增加，而西洋参的主要生产国包括美国、加拿大和中国，相比之下进口西洋参的价格高于国产西洋参，而西洋参的总体价格要高于园参。在中药市场上西洋参一般被加工成片剂、冲剂或者胶囊的形式进行销售，因此无法利用形态学对市售产品的原材料进行区分。不良厂商常以价格便宜园参冒充西洋参进行售卖，而园参和西洋参的药用价值不尽相同致使无法达到预期的治疗效果，甚至有延误治疗的风险，因此建立准确可靠的西洋参快速检测体系尤为重要。

目前主要依靠传统形态学和化学分析法对人参属植物进行鉴定，但形态学法需要长期经验的积累，受主观因素影响较大。化学分析法主要依赖于高效液相色谱仪器进行鉴别，但其耗时长，价格比较昂贵，且难以对参片及参粉等参类产品进行鉴定。近年来，DNA分子标记广泛应用于中药的鉴定，其中包括以分子杂交为核心的随机扩增多态性DNA标记(RAPD)，以PCR为核心的限制性片段长度多态性(RFLP)，扩增片段长度多态性(AFLP)和简单重复序列标记(SSR)，以直接DNA序列分析为核心的单核苷酸多态性(SNP)。其中RAPD法难以保证结果的稳定性和重复性。RFLP和AFLP标记均需酶的参与且检测周期长，需要不只一次PCR扩增。SSR标记检测依赖聚丙烯酰胺凝胶电泳且难以实现自动化。SNP标记重复性差且难以解决非特异性扩增的问题，虽然上述方法均能对西洋参进行鉴别，但其准确性，灵敏度及检测时长不适合于大批量对市售产品进行鉴定。

目前LAMP方法大多用于病毒和细菌检测，尚无应用此技术进行人参和西洋参鉴别的研究。LAMP技术仅需恒温扩增，对仪器要求低，不用PCR仪；能进行可视化检测，操作简单易行；反应速度快，敏感性高；应用多个引物进行反应，特异性好；价格便宜，适用于基层推广等优点。其检测试剂稳定性强，适于大批量样品且易于自动化检测。目前现行的形态学，化学分析和分子生物学方法检验过程相对复杂，不适于进行高通量检测。本发明涉及一种西洋参环等温扩增检测方法，其应用范围为全国各级质量监督检验部门、药品检验部门、中药的生产、销售、使用单位等，与目前广泛应用的高效液相色谱法相比，检测周期短，应用机器成本低，保证了西洋参的形态，不影响其二次销售。

发明内容

本发明旨在提供一种西洋参环介导等温扩增检测方法，首先设计扩增引物，然后再用环介导等温扩增引物进行扩增，最后通过可视化检测，琼脂糖凝胶电泳和实时荧光曲线(RT-LAMP)来实现西洋参的检测。

本发明根据NCBI中获得的西洋参特异性P450基因，通过PrimerExplorer V5(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)设计特异性引物，预计西洋参片段大小为155bp，而其近缘物种人参片段大小为520bp(图1)。环等温介导BstDNA聚合酶的性质使得其最适扩增片段为100-300bp,人参特异性片段无法有效扩增，而西洋参特异性片段155bp能较好的扩增出来。

本发明涉及一种西洋参环介导等温扩增检测方法,具体操作的步骤如下:

首先设计其扩增引物,然后配制检测体系，65℃恒温扩增60分钟后通过可视化检测，琼脂糖凝胶电泳或RT-LAMP来实现西洋参的快速检测。

1)检测体系的配制

所述扩增体系建立是采用水溶液配置,体系总体积25μL,其中包括:

2)环介导等温扩增的检测方法

所述环介导等温扩增采用可视化检测，琼脂糖凝胶电泳和RT-LAMP三种方法进行检测。可视化检测是65℃反应一小时后在体系中添加0.2μL 100000×GelRed染料，在312nm激发的UV凝胶成像仪中观察结果。琼脂糖凝胶电泳检测是在65℃反应一小时后用2％的凝胶进行电泳检测。RT-LAMP是在反应体系中加入1μL 20×Eva Green荧光染料，于实时荧光PCR仪器上进行反应，一共分为60个循环，每个循环一分钟，每个循环结束时收集荧光信号，若待测样品RT-LAMP扩增曲线出现典型的S型曲线，高分辨率溶解曲线平滑且解链温度为80-81℃即可判断结果。

附图说明

图1西洋参P450基因差异位点及引物设计

图2西洋参环介导等温扩增可视化检测

图3西洋参环介导等温扩增琼脂糖凝胶电泳检测(1-2：西洋参；3-4：人参；5-6：茯苓；6-8：山药；9-10：葛根)

图4西洋参环介导等温扩增RT-LAMP(A：扩增曲线；B：高分辨率溶解曲线)

图5西洋参产品环介导等温扩增检测(A：可视化检测；B：琼脂糖凝胶电泳；C：扩增曲线；D：高分辨率溶解曲线)

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，下面实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。

实施例1

1.DNA提取

收集人参、西洋参、茯苓、山药和葛根样品，分别取0.1g样品，采用改良CTAB法提取样品的基因组DNA。

表1.样品名称及产地表

2.环介导等温扩增及检测

反应体系总体积25μL：模板DNA2μL(50ng/μL)，2×LAMP Master Mix缓冲液12.5μL，内引物FIP和BIP各2μL(10μM)，外引物F3和B3各1μL(2.5μM)，BstDNA聚合酶0.5μL(8U/μL)。可视化检测在反应体系中加入100000×GelRed染料0.2μL，65℃反应1h后紫外下观察结果(图2)。琼脂糖凝胶电泳检测是在65℃反应一小时后用2％的凝胶进行电泳检测(图3)。RT-LAMP是在反应体系中加入20×Eva Green荧光染料1μL，于实时荧光PCR仪器上进行反应，一共分为60个循环，每个循环一分钟，每个循环结束时收集荧光信号，若待测样品RT-LAMP扩增曲线出现典型的S型曲线，高分辨率溶解曲线平滑且解链温度为80-81℃即可判断结果(图4)。

实施例2

将本发明的环介导等温扩增方法用于西洋参样品的鉴定。

假设现有一批西洋参样品不能确定是否是真正的西洋参，因此，按照如下方法对它进行鉴定。

首先用改良CTAB法提取样品的基因组DNA。用提取的DNA作为模板，用LAMP引物对其进行环介导等温扩增。其扩增产物可以用可视化检测，琼脂糖凝胶电泳或RT-LAMP法对其进行鉴定。

鉴定结果：若待测样品的可视化检测可见明亮橘黄的荧光，这批样品就是真正的西洋参；若待测样品的琼脂糖凝胶电泳目的条带为155bp，这批样品就是真正的西洋参；若待测样品RT-LAMP扩增曲线出现典型的S型曲线，高分辨率溶解曲线平滑且解链温度为80-81℃，这批样品就是真正的西洋参。若与上述结果相反那么这批样品就不是真正的西洋参。

实施例3

将本发明的环介导等温扩增方法用于西洋参产品的快速鉴定。

假设现有一批西洋参产品不能确定其原材料是否是西洋参，因此，按照如下方法对它进行鉴定。

首先用改良CTAB法提取样品的基因组DNA。用提取的DNA作为模板，用LAMP引物对其进行环介导等温扩增。其扩增产物可以用可视化检测，琼脂糖凝胶电泳或RT-LAMP法对其进行鉴定。

鉴定结果：若待测样品的可视化检测可见明亮橘黄的荧光，这批样品就是真正的西洋参(图5A)；若待测样品的琼脂糖凝胶电泳目的条带为155bp，这批样品就是真正的西洋参(图5B)；若待测样品RT-LAMP扩增曲线出现典型的S型曲线，高分辨率溶解曲线平滑且解链温度为80-81℃，这批样品就是真正的西洋参(图5C和D)。若与上述结果相反那么这批样品就不是真正的西洋参。