草药组合物、其制备方法及将其施用以用于预防或治疗病毒感染的方法

技术领域

本揭露是关于一种草药组合物，特别是关于一种用于预防或治疗病毒感染的草药组合物。

背景技术

病毒感染已经确定且仍然是一种严重的动物及人类困扰。冠状病毒(CoV)是病毒的一大家族，所述病毒可引起范围遍及普通感冒至更严重疾病的病症。例如，感染人类冠状病毒株、CoV-229E、CoV-OC43、CoV-NL63及CoV-HKU1，经常导致轻度的自限性上呼吸道感染，例如普通感冒，如流鼻水、喷嚏、头痛、咳嗽、喉咙痛及发烧。其他感染可能导致更严重的疾病，例如严重急性呼吸综合征(SARS)、中东呼吸综合征(MERS)及严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)，其导致严重急性呼吸综合征、肾衰及死亡，并引发国际公共卫生事件(global public health emergency)。特别是，由SARS-CoV-2引起的新冠病毒肺炎(coronavirus disease 2019(COVID-19))已在全球感染超过1.94亿人，并造成超过4,160,000人死亡。

迄今为止，挽救生命的最快方法是重新利用FDA批准的现有药物，这些药物原本针对COVID-19的其他疾病。然而，大多数抗病毒药物引起恶心、腹泻、头晕及发烧等严重的副作用，并且仍然没有可用的或被证明对治疗或预防受试者的冠状病毒感染有效的具体抗病毒治疗方法。

因此，存在未满足需求以提供有效且安全的疗法来预防或治疗冠状病毒感染。

发明内容

有鉴于此，本揭露提供一种草药组合物，所述草药组合物能够干扰冠状病毒突起(S)蛋白与宿主细胞表面的ACE2之间的交互作用，并压制冠状病毒在宿主中进入和复制所必需的蛋白质的表现，从而保护受试者免受病毒感染。

在本揭露的至少一实施方案中，所述草药组合物包含源自草药原料的提取物和药学上可接受的载体，其中，所述草药原料包含茉草(Ohwia caudata)和鱼针草(Anisomelesindica(L.)O.Ktze.)中的至少一者。在一些实施方案中，所述茉草是茉草根、茉草叶或其组合。

在本揭露的至少一实施方案中，所述草药组合物包含源自草药原料的提取物，所述草药原料包含茉草和鱼针草中的至少一者，以及艾草(Artemisia argyi)、麦冬(Ophiopogon japonicus)、鱼腥草(Houttuynia cordata)、桔梗(Platycodongrandiflorus)、甘草(Glycyrrhiza uralensis)、紫苏(Perilla frutescens)和菊花(chrysanthemum)中的至少一者。在一些实施方案中，所述草药组合物包含源自草药原料的提取物，所述草药原料包含茉草和鱼针草中的至少一者，以及艾草、麦冬、鱼腥草、桔梗、甘草、紫苏和菊花。在一些实施方案中，源自所述草药原料的所述提取物是水提取物或酒精提取物。

在本揭露的至少一实施方案中，所述草药组合物包含源自草药原料的提取物，所述草药原料，基于其总重量，包含以重量计18％至25％的茉草和鱼针草中的至少一者，以及以重量计18％至25％的艾草、以重量计10％至17％的麦冬、以重量计10％至17％的鱼腥草、以重量计10％至17％的桔梗、以重量计4％至11％的甘草、以重量计4％至11％的紫苏和以重量计0.4％至11％的菊花中的至少一者。

在本揭露的至少一实施方案中，所述草药组合物是藉由一种方法所制备，所述方法包含：提供如上所述的所述草药原料；利用提取液提取所述草药原料以获得粗提取物，其中，所述提取液包含水、酒精或其组合；以及从所述粗提取物除去固体以获得液体部分。

在本揭露的至少一实施方案中，用于制备所述草药组合物的所述方法进一步包含将所述草药原料磨碎成粉末或碎片。

在本揭露的至少一实施方案中，提取所述草药原料包含将所述草药原料在所述提取液中煮沸至少5分钟，例如5分钟至2小时，和/或包含将所述草药原料浸入所述提取液中至少10分钟，例如10分钟至1小时，所述提取液的温度低于其沸点。在一些实施方案中，所述草药原料与所述提取液的重量比是2：1至30：1，例如2：1、3：1、5：1、8：1、10：1、15：1、20：1、25：1和30：1。

在本揭露的至少一实施方案中，用于制备所述草药组合物的所述方法进一步包含将所述液体部分浓缩以获得浓缩提取物。

在本揭露的至少一实施方案中，提供一种用于在有需要的受试者预防或治疗病毒感染的方法。所述方法包含向所述受试者施用有效量的上述草药组合物中的至少一者。

在本揭露的至少一实施方案中，所述病毒感染是由冠状病毒引起。在一些实施方案中，所述冠状病毒是严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)、严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)、小鼠肝炎病毒(MHV)或猪流行性腹泻病毒(PEDV)。在一些实施方案中，所述冠状病毒是SARS-CoV-2的变体，例如D614G突变株、B.1.1.7(α)突变株、B.1.351(β)突变株和P1突变株。

在本揭露的至少一实施方案中，源自所述草药组合物中所述草药原料的所述提取物是以约25毫克/公斤/天至约2,500毫克/公斤/天的有效量施用于所述受试者，例如约30毫克/公斤/天至约1,000毫克/公斤/天和约50毫克/公斤/天至约500毫克/公斤/天。

在本揭露中，于本揭露中所提供的草药组合物作为抗病毒剂，可抑制病毒复制并减少宿主细胞中的病毒数量。此外，于本揭露中所提供的草药组合物是安全且可解决先前技术中的副作用问题。因此，本揭露提供一种有效的对抗病毒感染的策略，其可用于控制冠状病毒的爆发。

附图说明

藉由阅读以下实施方案的描述并参考所附附图，可以更全面地理解本揭露。

图1A至图1G示出经本揭露的草药组合物抑制的病毒突起蛋白与ACE2受体的结合活性的长条图。Ctrl.：无治疗组；Ctrl.1：20毫克/毫升的阿比朵尔(Arbidol)；Ctrl.2：复方；Ctrl.3：莲花清瘟胶囊(Lianhua Qingwen capsule)；Ctrl.4：橄榄(Olive)叶提取物；Ctrl.5：接骨木(Elderberry)提取物；Ctrl.6：源自花莲慈济医院(Hualien Tzu ChiHospital)的中药配方；Exp.1至Exp.6：本揭露的草药组合物。

图2A至图2C分别示出经本揭露的草药组合物治疗的CTX、H9c2和HFL-1的细胞生存力的长条图。Ctrl.：无治疗组。*：p值<0.05，**：p值<0.01。

图3A至图3D示出经本揭露的草药组合物治疗的小鼠的血液参数的长条图。图3A示出血液中肌酸磷酸激酶(CPK)、乳酸脱氢酶(LDH)、天冬氨酸转氨酶(GOT)和丙氨酸转氨酶(GPT)的量级。图3B至图3D分别示出血液中的肌酸酐(CRE)、总胆红素(T-Bil)和葡萄糖(Glu)的量级。Ctrl.：无治疗组；Exp.1：本揭露的草药组合物。

图4A和图4B示出藉由蛋白质印迹法(western blotting)分析的跨膜丝氨酸蛋白酶2(TRPMSS2)的表现。Ctrl.：无治疗组；Ctrl.1：20毫克/毫升的阿比朵尔；Ctrl.2：复方；Ctrl.3：莲花清瘟胶囊；Exp.1：本揭露的草药组合物；L：低剂量，50微克/毫升；H：高剂量，150微克/毫升。

图5A和图5B示出藉由蛋白质印迹法分析的FK506结合蛋白51(FKBP51)的表现。Ctrl.：无治疗组；Ctrl.2：复方；Ctrl.3：莲花清瘟胶囊；Exp.1：本揭露的草药组合物；L：低剂量，50微克/毫升；H：高剂量，150微克/毫升。

图6和图7分别示出本揭露的草药组合物(Exp.1)抑制的3CL蛋白酶和依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)的活性的长条图。*：p值<0.05，**：p值<0.01，**：p值<0.001。

图8A和图8B分别示出本揭露的草药组合物对Caco-2细胞和Calu-3细胞中SARS-CoV-2的野生型、D614G突变体、B.1.1.7突变体和B.1.13513突变体感染的抑制功效。Ctrl：无治疗组；Exp.7至Exp.9：本揭露的草药组合物。

图9A至图9D示出本揭露的草药组合物对小鼠中SARS-CoV-2的野生型(图9A)、D614G突变体(图9B)、B.1.1.7突变体(图9C)和B.1.1351突变体(图9D)的感染的抑制功效。Ctrl.：无治疗组；Ctrl.7：仅病毒治疗；Exp.1-L：本揭露的草药组合物的低剂量；Exp.1-H：本揭露的草药组合物的高剂量。

图10A示出根据本揭露的不同实施方案的草药组合物对Caco-2细胞中SARS-CoV-2的B.1.1.7突变体感染的抑制功效。Ctrl.：无治疗组；Exp.1、Exp.10和Exp.11：本揭露的草药组合物。

图10B示出根据本揭露的不同实施方案的草药组合物对小鼠中SARS-CoV的P1突变体感染的抑制功效。Ctrl：无治疗组；Ctrl.7：仅病毒治疗；Exp.1和Exp.10：本揭露的草药组合物。

具体实施方式

以下将对本揭露实施例中所阐述的技术方案进行更清楚、完整的描述，明显地，所描述的实施例仅是本揭露实施例的一部分且并非旨在限制。本揭露亦可如不同实施例中所描述的那样实施或应用。本领域技术人员在无创作所获得的其他实施例皆在本揭露的范畴。

进一步注意，如在本揭露中所用，单数形式「一(a)」、「一(an)」和「所述(the)」包含复数指称对象，除非明确且毫无歧义地限于一个指称对象。除非上下文另有明确指示，否则术语「或」与术语「和/或」可互换使用。

如本文所用，术语「包含(comprising)」或「包含(comprises)」用于指包括含在本揭露中的组合物、方法及其各自的组分，但对含括未指定的元件或步骤开放，无论是否必要。

本揭露内容是关于草药组合物、制备所述草药组合物的方法以及藉由使用所述草药组合物在有需要的受试者中用于预防或治疗病毒感染的方法。

在至少一实施方案中，藉由本揭露的方法治疗的病毒感染可为由冠状病毒(CoV)所引起。

CoV的结构蛋白包括核壳(N)、小包膜(E)、基质(M)和三聚体突起(S)醣蛋白，它们对病毒体组装和在感染期间完成病毒生命周期的功能至关重要。在一些实施方案中，本揭露的用于预防或治疗病毒感染的方法包含向有需要的受试者施用草药组合物，所述草药组合物可阻断冠状病毒S蛋白和血管紧张素转换酶2(ACE2)受体的相互作用，以及压制冠状病毒在宿主中进入和/或复制所必需的蛋白质的表现，从而影响感染病毒或加重疾病进展的风险。因此，本揭露的草药组合物可具有抗病毒能力并可用于有效预防或治疗病毒感染。

如本文所用，术语「预防(preventing)」或「预防(prevention)」是指对疾病或疾病的症状或病症的预防或避免措施，其包括但不限于向受试者施用(applying)或施用(administering)一种或多种活性剂，所述受试者为尚未被诊断为患有所述疾病或所述疾病的症状或病症但可能易感或易患所述疾病的患者。提供本揭露的预防措施以避免、预防或推迟疾病或疾病的症状或病症的发生。

如本文所用，术语「治疗(treating)」或「治疗(treatment)」是指获得期望的药理学和/或生理学效果，例如，抑制病毒进入和/或在宿主中复制。所述效果在完全或部分预防疾病或其症状或病症方面可为预防性的，或者在完全或部分治愈、缓解、弛缓、补救或改善疾病或归因于所述疾病或其症状或状况的不利影响方面可为治疗性的。

如本文所用，术语「患者」及「受试者」可互换使用。术语「受试者」是指人或动物。受试者的实施例包括但不限于人、猴、小鼠、大鼠、土拨鼠、雪貂、兔、仓鼠、牛、马、猪、鹿、狗、猫、狐狸、狼、鸡、鸸鹋(emu)、鸵鸟、和鱼。在本揭露的一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如，灵长类诸如人。

如本文所用，片语「有效量」是指对有需要的受试者赋予期望的预防或治疗效果(例如，减少宿主中的病毒量)所需的活性剂的量。如本领域技术人员所公认，有效剂量可以变化，这取决于施用途径、赋形剂的使用、与其他治疗性治疗联用的可能性以及待治疗的病症。

如本文所用，术语「施用(administering)」或「施用(administration)」是指藉由方法或途径将活性剂置于受试者，而导致活性剂至少部分定位在期望的位点以产生期望的效果。本文所述的活性剂可藉由本领域已知的任何适当途径施用。例如，本揭露的草药组合物藉由口服施用给受试者。

在至少一实施方案中，本揭露的草药组合物包含源自草药原料的提取物及其药学上可接受的载体，其中，所述草药原料包含茉草和鱼针草中的至少一者。在一些实施方案中，所述草药原料进一步包含艾草、麦冬、鱼腥草、桔梗、甘草、紫苏、菊花及其任意组合。

在至少一实施方案中，所述草药原料包含，基于所述草药原料的总重量，以重量计18％至25％(例如，18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％和25％)的茉草和鱼针草中的至少一者，以重量计18％至25％(例如，18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％和25％)的艾草，以重量计10％至17％(例如，10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％和17％)的麦冬，以重量计10％至17％(例如，10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％和17％)的鱼腥草，以重量计10％至17％的桔梗，4％至11％(例如，4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％和11％)的甘草，以重量计4％至11％(例如，4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％和11％)的紫苏和以重量计0.4％至11％(例如，0.4％、0.6％、0.8％、1％、3％、5％、7％、8％、9％、10％和11％)的菊花。

在至少一实施方案中，草药原料于约20克至约80克范围包含5克至7克的茉草和鱼针草中的至少一者、5克至7克的艾草、3克至5克的麦冬、3克至5克的鱼腥草、3克至5克的桔梗、1克至3克的甘草、1克至3克的紫苏和0.1克至3克菊花。在一些实施方案中，草药原料可为范围约20克至约70克、约20克至约60克、约20克至约50克或约20克至约40克。

在至少一实施方案中，草药组合物中的药学上可接受的载体可为稀释剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、助滑剂、表面活性剂或其任意组合。组合物中的载体是「可接受的」，这是因为其与组合物的活性剂相容(例如，能够稳定活性剂)并且对要施用的受试者无害。一种或多种助溶剂可用作药物赋形剂用以递送活性成分。其他载体的实施例包含胶体氧化硅、硬脂酸镁、纤维素和硫酸月桂钠。在一些实施方案中，草药组合物包含药学上可接受的载体，所述药学上可接受的载体选自水、酒精、麦芽糊精、结晶纤维素及其任意组合。

已使用许多实施例来阐明本揭露。以下实施例不应视为对本揭露范围的限制。

实施例

为了更详细地描述本揭露，将参考以下实施例详细描述本揭露提供的草药组合物、制备方法和组合物的用途。本揭露中使用但在此未注释的材料是可商购的。

制备实施例1-1

取6g的艾草、6克的茉草、4g的麦冬、4g的鱼腥草、4g的桔梗、2克的甘草、2克的紫苏和0.2g菊花并粉碎成粉末或小块。将所有的草药材料与600毫升水混合后，将混合物煮沸5至10分钟。经过滤收集550毫升滤液(定性滤纸No.1，TOYO Advantec)，并由0.22微米无菌针筒过滤器过滤，以获得草药茶。干燥后，测量所获得的草药茶中草药材料的提取物的含量为约20至40毫克/毫升。

制备实施例1-2

取6g的艾草、6克的茉草、4g的麦冬、4g的鱼腥草、4g的桔梗、2克的甘草、2克的紫苏和0.2g菊花并粉碎成粉末或小块。将所有的草药材料与600毫升水混合后，将混合物沸腾至大约60毫升。经过滤收集滤液(定性滤纸No.1，TOYO Advantec)，并由0.22微米无菌针筒过滤器过滤，以获得草药茶浓缩物。干燥后，测量所获得的草药茶浓缩物中草药材料的提取物的含量为约150至200毫克/毫升。

制备实施例2

取20重量％的艾草、20重量％的茉草、13.33重量％的麦冬、13.33重量％的鱼腥草、13.33重量％的桔梗、6.67重量％的甘草、6.67重量％的紫苏和6.67重量％的菊花，且草药材料的总重量为约14克。将这些草药材料粉碎成小块，并装入茶包中。将茶包浸入300毫升的热水(100℃左右)中15至20分钟，以获得草药茶。

制备实施例3

取20重量％的艾草、20重量％的茉草、13.33重量％的麦冬、13.33重量％的鱼腥草、13.33重量％的桔梗、6.67重量％的甘草、6.67重量％的紫苏和6.67重量％的菊花，且草药材料的总重量为约28克。将这些草药材料粉碎成小块，并装入茶包中。将茶包浸入600毫升的37％醇中30分钟，随后煮沸5至10分钟，以获得酒精提取物。

制备实施例4

取6g的艾草、6克的茉草、4g的麦冬、4g的鱼腥草、4g的桔梗、2克的甘草、2克的紫苏和0.2g菊花并粉碎成粉末或小块。将所有的草药材料与600毫升水混合后，将混合物煮沸60分钟。经过滤收集滤液(定性滤纸No.1，TOYO Advantec)，并由0.22微米无菌针筒过滤器过滤，接着煮沸用于浓缩以获得水提取物(30毫升，约5克)。

制备实施例5

取6g的艾草、6克的茉草、4g的麦冬、4g的鱼腥草、4g的桔梗、2克的甘草、2克的紫苏和0.2g菊花并粉碎成粉末或小块。将所有的草药材料与225.6毫升水(草药材料总重量的8倍)混合后，将混合物煮沸60分钟，接着经过滤以获得第一滤液。将141.0毫升的水(草药材料总重量的5倍)加入残留物后，再煮沸60分钟，接着经过滤以获得第二滤液。合并第一和第二滤液并由0.22微米无菌针筒过滤器过滤，接着煮沸用于浓缩以获得水提取物(36.66毫升，约5克)。

制备实施例6

在本实施例中，藉由制备实施例4或5中所描述的方法制备水提取物，不同之处在于本实施例中将制备实施例4或5中使用的茉草的叶替换为茉草的根。

制备实施例7

在本实施例中，藉由制备实施例4或5中所描述的方法制备水提取物，不同之处在于将茉草替换为鱼针草。

制备实施例8

在本实施例中，藉由制备实施例4或5中所描述的方法制备艾草水提取物，不同之处在于本实施例中使用的草药材料是单独的6克艾草。

制备实施例9

在本实施例中，藉由制备实施例4或5中所描述的方法制备茉草的水提取物，不同之处在于本实施例中使用的草药材料是单独的6克茉草。

药理学实施例1：材料和方法

本揭露提供的草药组合物用于预防或治疗冠状病毒感染的治疗效果藉由以下药理学实施例2至7确定。试验样本取自制备实施例1至9，作为对照组的对照样本为如下所列：

对照组(Ctrl.)-无治疗组；

对照组1(Ctrl.1)-阿比朵尔，亦称为乌米非诺韦(Umifenovir)，是俄罗斯产的广效抗病毒药物，所述药物用于一些包膜和非包膜病毒；

对照组2(Ctrl.2)-复方，包含乳铁蛋白、胶体银、橄榄叶提取物和接骨木提取物；

对照组3(Ctrl.3)-莲花清瘟胶囊，一种用于治疗流感的传统中药剂型，且包含连翘(Forsythia suspensa)、忍冬(Lonicera japonica)、草麻黄(Ephedra sinica)、苦杏仁(bitter almond)、石膏(gypsum)、菘蓝(Isatis indigotica)根、粗茎鳞毛蕨(Dryopteriscrassirhizoma)、鱼腥草(Houttuynia cordata)、广藿香(Pogostemon cablin)、大黄(rhubarb)、红景天(Rhodiola rosea)、薄荷醇(menthol)和甘草(Glycyrrhizauralensis)；

对照组4(Ctrl.4)-橄榄叶提取物；

对照组5(Ctrl.5)-接骨木提取物；以及

对照组6(Ctrl.6)-源自花莲慈济医院(中国台湾)的中药剂型，包含麦冬、鱼腥草、桔梗、菊花、甘草、紫苏。

此外，这些实施例中所使用的实验方法为描述如下：

(1)抑制病毒突起蛋白与血管紧张素转换酶2(ACE2)受体结合的检定

根据制造厂说明书，藉由使用COVID-19突起-ACE2结合检定套组II(RayBiotech)测定试验样本用于抑制SARS-CoV-2突起蛋白与人类ACE2受体结合的效果。

简而言之，所有试剂在使用前为置于室温(约18℃至25℃)。接下来，将100微升的各试验样本加入至可拆卸的8孔板的孔中，并盖上板密封膜，在室温孵育2.5小时或在4℃温和振荡培育过夜。然后弃去孔中的溶液，并以1×清洗液将各孔清洗4次。此外，藉由使用填充有1×清洗缓冲液(300微升)的多通道移液吸管或自动清洗器来清洗各孔。最后一次清洗后，藉由吸出或倾析除去剩余的1×清洗缓冲液，将100微升的1×小鼠二级辣根过氧化酶(HRP)接合的IgG加入各孔，并在室温温和振荡培育1小时。之后，弃去各孔中的溶液，并如上所述清洗各孔。随后，将100微升的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)单步骤受质试剂(One-Step Substrate Reagent)加入各孔，并在室温避光培育30分钟并温和振荡。最后，将50微升停止液加入各孔，立即读取450奈米的光学吸光度。

(2)抑制病毒的3C-样(3CL)蛋白酶的检定

根据制造厂说明书，藉由使用SensoLyte SARS-CoV-2 3CL蛋白酶活性检定套组(萤光)测定试验样本用于抑制SARS-CoV-2的3CL蛋白酶以抵抗病毒在人体细胞中复制的效果。

简而言之，首先制备工作溶液。具体而言，藉由将10毫升的2×检定缓冲液加入10毫升的去离子水以制备1×检定缓冲液。藉由用检定缓冲液将3CL蛋白酶受质稀释100倍以制备3CL蛋白酶受质溶液。藉由用检定缓冲液将3CL蛋白酶稀释80倍以制备3CL蛋白酶稀释剂。藉由用检定缓冲液将10微米抑制剂溶液稀释100倍以制备抑制剂(GC376)稀释剂。

接下来，对于酶促反应，将试验样本和3CL蛋白酶稀释剂分别以10微升/孔和40微升/孔的量加入微板盘孔中。同时，设置以下对照组孔：阳性对照组，包含3CL蛋白酶，不含试验样本；抑制剂对照组，包含3CL蛋白酶和抑制剂GC376；媒剂对照组，包含3CL蛋白酶和用于递送试验样本的媒剂(例如，浓度不超过1％的二甲基亚砜(DMSO))；试验样本对照组，包含检定缓冲液和试验样本；以及受质对照组，包含检定缓冲液。藉由使用检定缓冲液使所有对照组的总体积达到50微升。

随后，将50微升的3CL蛋白酶受质溶液加入各孔，接着藉由动力学读数或终点读数测量萤光讯号。对于动力学读数，立即在激发/发射(Ex/Em)＝490奈米/520奈米连续测量萤光强度，并于每5分钟记录一次资料，持续30至60分钟。对于终点读数，将反应溶液在37℃孵育30至60分钟并避免直接光照，接着在Ex/Em＝490奈米/520奈米测量萤光强度。

(3)抑制病毒依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)的检定

根据制造厂说明书，藉由使用SARS-CoV-2RNA聚合酶(RdRp)检定套组(ProFoldin)测定试验样本用于抑制SARS-CoV-2的RNA聚合酶以抵抗病毒在人体细胞中复制的效果。

简而言之，在96孔盘格式中进行SARS-CoV2 RdRp检定。首先，将1微升DMSO中的试验样本加入96孔检定盘的各孔中。此外，将41微升的H

(4)抑制跨膜丝氨酸蛋白酶2(TRPMSS2)和FK506结合蛋白51(FKBP51)的检定

在10公分培养皿中培养4×10

(5)SARS-CoV-2假型慢病毒检定

由台湾地区“中央研究院″RNAi核心提供SARS-CoV-2假型慢病毒，其是一种慢病毒，在所述慢病毒的基因组中具有绿色萤光蛋白基因或萤光酶基因，并在所述慢病毒的表面包膜上表现SARS-CoV-2突起蛋白。将人类肠道上皮细胞系Caco-2和人类肺细胞系Calu-3培养12小时，接着与10微克/毫升或30微克/毫升的试验样本共同培养24小时，以用于测定试验样本在体外预防SARS-CoV-2感染的效果。之后，将所培养的细胞以SARS-CoV-2假型慢病毒的野生型、D614G突变体、α突变体(B.1.1.7)或β突变体(B.1.351)感染。24小时后，用萤光显微镜观察被感染的细胞。

另一方面，藉由胃管灌食法(16.22毫克或48.66毫克/0.3毫升/小鼠/天)用试验样本对SKH2/J小鼠进行治疗连续7天，以用于体内测定。在第4天至第6天，以Aerogen Solo喷雾器(10微升的1.2×10

Aerogen Solo喷雾器的参数为如下。流速：大于0.2毫升/分钟(平均：约0.38毫升/分钟)；粒径：(1)规格范围：1微米至5微米，平均值：3.1微米，由安德森级联冲击采样器测得；(2)规格范围：1.5微米至6.2微米，平均值：3.9微米，由Marple 298级联冲击采样器测定。根据EN 13544-1标准，起始剂量为2毫升，以及气溶胶输出速度为0.30毫升/分钟。此外，所述气溶胶输出为1.02毫升/剂，以及余气量为每3毫升剂量小于0.1毫升。

(6)细胞毒性和细胞生存力检定

为了测定试验样本的体外毒性，进行MTT(溴化-3-(4,5-二甲基-噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑)检定以评估细胞活性和增生。具体而言，星形细胞CTX、心肌细胞H9c2和肺纤维芽细胞HFL-1为与试验样本以31.25微克/毫升至4,000微克/毫升的浓度共同培养24小时。之后，将MTT加入到培养物中并培育2小时。藉由将MTT晶体溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，藉由酶联免疫吸附测定(ELISA)读取器测量590奈米的吸光度。

另一方面，藉由胃管灌食法用试验样本以5,200毫克/公斤/天的剂量对C57BL/6小鼠进行治疗，以用于测定试验样本的体内毒性。24小时后，测定小鼠血液中肌酸磷酸激酶、乳酸脱氢酶、天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、肌酸酐、总胆红素和葡萄糖的量级。

药理学实施例2：抑制病毒突起蛋白与ACE2受体的结合

对由制备实施例4或5(Exp.1，6至30毫克/毫升)所制备的草药组合物用于抑制SARS-CoV-2突起蛋白与人类ACE2受体结合的效果进行测定，并与阿比朵尔(Ctrl.1，20毫克/毫升)、复方(Ctrl.2)、莲花清瘟胶囊(Ctrl.3)、橄榄叶提取物(Ctrl.4)、接骨木提取物(Ctrl.5)、源自花莲慈济医院的中药剂型(Ctrl.6)进行比较。

这些结果显示在图1A至图1F，表明与Ctrl.2至Ctrl.6相比，Exp.1对于病毒突起蛋白与ACE2受体结合展现出显著提高的阻断活性。此外，参考图1B和图1C，用6毫克/毫升和12毫克/毫升的Exp.1治疗与用24毫克/毫升和30毫克/毫升的Ctrl.3治疗的突起蛋白的结合活性相当；也就是说，在相同的施用剂量下，本申请的草药组合物的阻断活性比莲花清瘟胶囊高约2.5至4倍。另外，图1C显示18毫克/毫升的Exp.1可达到比20毫克/毫升的阿比朵尔更高的阻断效果，这意味着低剂量的本揭露的草药组合物可有效地阻断病毒突起蛋白与ACE2受体之间的相互作用，从而能够避免因使用一般抗病毒药物(例如阿比朵尔)所造成的恶心、腹泻和头晕等严重的副作用。

此外，图1G显示鉴于抑制SARS-CoV-2突起蛋白与人类ACE2受体结合的效果，比较由不同提取方法制备的草药组合物，其中，将由制备实施例4或5所制备的水提取物标记为Exp.1；将由制备实施例1所制备的草药茶标标记为Exp.2；将由制备实施例2所制备的草药茶标记为Exp.3；将由制备实施例3所制备的酒精提取物标记为Exp.4；将由制备实施例8所制备的艾草提取物标记为Exp.5；以及将由制备实施例9所制备的茉草提取物标记为Exp.6。这些结果表明，藉由不同提取方法制备的本揭露的草药组合物亦可阻断病毒突起蛋白与ACE2受体之间的相互作用。

药理学实施例3：本揭露的草药组合物的安全性

藉由MTT检定和动物模型测定由制备实施例4或5(Exp.1)所制备的草药组合物的毒性。

细胞系CTX、H9c2和HFL-1的MTT试验结果分别如图2A至2C所示，这些结果示出低于1,000微克/毫升的量的本揭露的草药组合物不会对脑、心和肺的生理活性产生影响。由于本揭露的草药组合物作为制备实施例1-1所提供的可饮用草药茶，包含20至40毫克/毫升的草药原料提取物，这暗示了即使70公斤的成年人类大量饮用5.6升的草药组合物，本揭露的草药组合物也不会引起毒性。

在动物模型中，对C57BL/6小鼠以5,200毫克/公斤/小鼠/天的剂量喂食本揭露的草药组合物，这是一个人每日推荐摄入量的20倍。结果为，肌酸磷酸激酶(CPK)、乳酸脱氢酶(LDH)、天冬氨酸转氨酶(GOT)、丙氨酸转氨酶(GPT)、肌酸酐(CRE)、总胆红素(T-Bil)和葡萄糖(Glu)在小鼠血液中的量级显示于下表1以及图3A和图3B。CPK和LDH是心和脑功能的指标；GOT和GPT是肝功能指标；CRE是肾功能的指标；T-Bil包含直接胆红素和间接胆红素，其是胆功能的指标。这些结果表明，用和不用草药组合物治疗的小鼠之间的血液参数没有显著差异，这意味着本揭露的草药组合物即使在极高的剂量下也不会导致不利影响。

表1.施用本揭露的草药组合物后小鼠的血液参数

药理学实施例4：抑制TRPMSS2和FKBP51的表现量

对由制备实施例4或5(Exp.1)所制备的草药组合物用于抑制TRPMSS2和FKBP51表现的效果进行测定，并与阿比朵尔(Ctrl.1，20毫克/毫升)、复方(Ctrl.2)、莲花清瘟胶囊(Ctrl.3)进行比较。

抑制TRPMSS2表现量的结果如图4A和图4B所示，这些结果表明与Ctrl.2和Ctrl.3相比，Exp.1显著抑制了TRPMSS2的表现。此外，当Exp.1的施用剂量从50微克/毫升(低剂量，L)增加至150微克/毫升(高剂量，H)时，TRPMSS2表现降低70％，而当施用时剂量的Ctrl.3从50微克/毫升(低剂量，L)增加到150微克/毫升(高剂量，H)，TRPMSS2表现仅降低10％。也就是说，与莲花清瘟胶囊相比，本揭露的草药组合物可抑制TRPMSS2表现的功效高出7倍，这意味着本揭露的草药组合物在阻断病毒进入宿主细胞方面的有效作用。

FKBP51表现的抑制结果显示如图5A和图5B所示，当Exp.1的施用剂量从50微克/毫升(低剂量，L)增加至150微克/毫升(高剂量，H)时，FKBP51的表现降低40％。FKBP51是压力的分子链联，因此这些结果暗示本揭露的草药组合物具有对抗可能由COVID-19引起的情绪压力、焦虑和抑郁的作用。

药理学实施例5：抑制3CL蛋白酶和RdRp的活性

将由制备实施例4或5(Exp.1)所制备的草药组合物用于抑制SARS-CoV-2的3CL蛋白酶和RdRp的活性的效果进行测定。

结果分别如图6(3CL)和图7(RdRp)所示，这些结果表明本揭露的草药组合物以剂量依赖性方式将RdRp和3CL蛋白酶的活性降低35％至40％。对于SARS-CoV-2而言，3CL参与多聚蛋白(polyprotein)的裂解，产生病毒生命周期至关重要的病毒蛋白，且使用RdRp以用于病毒基因体的复制和病毒基因的转录。因此，这些结果暗示本揭露的草药组合物对COVID-19的治疗有效果。

药理学实施例6：预防SARS-CoV-2感染

本揭露的草药组合物用于预防SARS-CoV-2感染的效果是藉由使用SARS-CoV-2假型慢病毒的野生型和变体来进行测定。

对于体外试验，待试验的草药组合物为如下：Exp.7，含有1.5克由制备例4或5所制备的水提取物和1.5克的赋形剂(麦芽糊精和结晶纤维素的混合物)(水提取物的浓度：10微克/毫升)；Exp.8，含有3克由制备例4或5所制备的水提取物和3克的赋形剂(麦芽糊精和结晶纤维素的混合物)(水提取物的浓度：30微克/毫升)；及Exp.9，含有3g制备例4或5制备的水提取物(水提取物的浓度：30微克/毫升)。将各组合物加入至Caco-2细胞或Calu-3细胞。24小时后，加入野生型假型慢病毒及其三种变体(即，D614G突变体、B.1.1.7突变体和B.1.351突变体)。

结果如图8A(Caco-2)和图8B(Calu-3)所示，这些结果表明本揭露的草药组合物对Caco-2而言可将野生型和变体的病毒感染降低51％至74％，以及对Calu-3而言可降低64％至86％。

治疗对于体内检定，连续7天藉由胃管灌食法将由制备实施例4或5所制备的草药组合物以16.22毫克/0.3毫升/小鼠/天(Exp.1-L)或48.66毫克/0.3毫升/小鼠/天(Exp.1-H)剂量对SKH2/J小鼠施用，并在第4天至第6天，藉由鼻内施用将野生型假型慢病毒及其三种变体(即，D614G突变体、B.1.1.7突变体和B.1.351突变体)对小鼠施用。

结果如图9A(野生型)、图9B(D614G突变体)、图9C(B.1.1.7突变体)和图9D(B.1.351突变体)所示，其中，Ctrl.是没有任何药物或病毒治疗的小鼠组，且Ctrl.7是仅以假型慢病毒处里的小鼠组。如图9A所示，由本揭露的草药组合物治疗的小鼠在它们的组织中表现出较低的亮度量级，这意味着本揭露的草药组合物可有效地防止野生型SARS-CoV-2的感染。

此外，如图9B所示，在Exp.1-L和Exp.1-H的小鼠中D614G突变体的感染为分别降低5倍和25倍，这意味着本揭露的草药组合物可有效地防止D614G突变体的感染。

如图9C所示，Ctrl.7的小鼠患有由B.1.1.7突变体造成的严重肺部感染(如箭头所示)，而Exp.1-L和Exp.1-H可有效地防止B.1.1.7突变体强烈感染肺部(如圆圈区域所示)。

如图9D所示，B.1.351突变体在Exp.1-L和Exp.1-H的感染减少；特别地，如圆圈区域所示，由B.1.351突变体引起的鼻和肠道感染在Exp.1-L和Exp.1-H中显著减少。

上述的这些结果表明，本揭露的草药组合物可显著预防野生型和突变体变体的病毒感染。

药理学实施例7：含有可替代成分的本揭露的草药组合物的效果

在这个实施例中，将由制备实施例4或5(即，包含茉草叶提取物的那些)所制备的草药组合物用于预防SARS冠状病毒-2感染的效果，与由制备实施例6(即，包含茉草根提取物的那些)所制备的组合物进行比较。另外，由于茉草和鱼针草通常可被标识为相同的中药材料，由制备实施例4或5所制备的草药组合物的效果，也与由制备实施例7(即，包含鱼针草提取物的那些)所制备的组合物进行比较。所述比较是藉由用于预防SARS-CoV的-2假型慢病毒感染的这些草药组合物的效果进行测定。

结果如图10A和图10B所示，其中，包含茉草叶提取物的草药组合物被标记为Exp.1；含有茉草根提取物的草药组合物被标记为Exp.10；含有鱼针草提取物的草药组合物被标注为Exp.11；以及Ctrl.7是仅用SARS-CoV-2假型慢病毒的P1突变体治疗的小鼠组。

在图10A中，使用SARS-CoV-2假型慢病毒的B.1.1.7突变体感染用30微升/毫升试验样本治疗的Caco-2细胞，结果显示，与Exp.1相同，Exp.10和Exp.11亦可分别减少约48％和约64％的病毒感染。

在图10B中，在P1突变体感染前，将试验样本以48.66毫克/0.3毫升/小鼠/天的剂量喂食SKH2/J小鼠，结果显示，在Exp.1和Exp.10中，P1突变体在小鼠中的感染减少分别减少25倍和40倍。

上述的这些结果表明，含有茉草根提取物或鱼针草提取物的草药组合物亦可显著预防SARS-CoV-2感染。

虽然上面已经详细描述本揭露的一些实施方案，但本领域技术人员可对所示出的实施方案进行各种修饰和改变，而基本上不背离本揭露的教导及优点。因此，这样的修饰和改变包含在如所附权利要求书中所阐述的本揭露的范围内。