鱼油在缓解副溶血弧菌感染中的应用
文献发布时间:2023-06-19 19:20:08
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及鱼油在缓解副溶血弧菌感染中的应用。
背景技术
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)是一种革兰氏阴性嗜盐短杆菌,广泛分布于海洋环境,也常见于盐渍类食品,据调查我国水产品中Vp检测率高达38.8%,远超沙门氏菌和大肠杆菌,成为威胁公共健康的首要病原菌。日常生活中,人们因误食被Vp污染的海鲜导致食物中毒,表现为腹痛、腹泻和呕吐等急性胃肠炎症状,体弱人群中还会出现脱水休克、全身感染,甚至死亡。传统观点认为,Vp的致病性与菌体和毒力代谢物有关,该菌经食物链传播进入机体,依靠菌体侵袭力和黏附作用破坏宿主肠壁屏障,其产生的耐热直接溶血素、脲酶和金属蛋白酶等毒力因子具有细胞毒性加剧肠道感染程度。
目前,针对Vp食物中毒的治疗剂主要有喹诺酮和头孢曲松,抗生素虽然能够杀灭病原菌和清除毒力因子,但频繁使用会引发耐药菌、肾功能异常和肠道菌群失衡等副作用。寻找安全无毒且具有保健调理作用的治疗剂替代品成为了亟需解决的问题。
发明内容
为克服现有技术中存在的上述问题,本发明提供鱼油在制备治疗/缓解/改善副溶血弧菌感染的功能产品中的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现:
鱼油在制备治疗/缓解副溶血弧菌感染的功能产品中的应用。
本发明通过研究发现鱼油抑制了促炎因子参与的炎症反应,提高抗氧化酶活力,下调了肠道纤维标记物的蛋白表达,维系肠屏障功能,进而缓解副溶血弧菌感染损伤。
优选的,所述副溶血弧菌感染至少具备如下一种表现:
(1)便血;
(2)结肠病理损伤;
(3)结肠纤维化程度增加;
(4)肠道过度炎症反应;
(5)氧化应激反应增加。
更优选的,所述结肠肠道病理损伤具体表现为:结肠黏膜结构缺失,黏膜细胞减少,隐窝深度变浅,伴有增生结缔组织,固有层可见大量炎性细胞浸润。
更优选的,所述结肠纤维化程度增加是指肠组织关键纤维化蛋白TICP和TIIICP表达上调。
更优选的,所述肠道过度炎症反应是指结肠组织中白介素1β、白介素6和肿瘤坏死因子α水平上调。
更优选的,所述氧化应激反应增加是指结肠组织中过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和总抗氧化酶表达下调。
优选的,上述应用中,所述鱼油的用量为2-4mg/d。
优选的,上述应用中,所述功能产品选自药品、保健品、功能食品。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明公开了鱼油在制备缓解副溶血弧菌感染的功能产品中的应用。基于副溶血弧菌感染小鼠模型研究发现,富含ω-3系多不饱和脂肪酸的膳食补充剂通过调节小鼠结肠组织基因表达谱,富集免疫功能相关的基因和信号通路,特别是PPAR家族蛋白基因介导的信号转导途径,抑制了促炎因子参与的炎症反应,提高抗氧化酶活力,下调了肠道纤维标记物的蛋白表达,维系肠屏障功能,进而干预副溶血弧菌感染损伤。该制剂有望成为预防副溶血弧菌食物中毒和减少抗生素滥用的新策略,具有较好的应用前景。
附图说明
图1为鱼油对副溶血弧菌感染小鼠粪便形态、结肠病理变化和疾病活动指数的影响;
图2为鱼油对副溶血弧菌感染小鼠结肠组织纤维化的影响;
图3为鱼油对副溶血弧菌感染小鼠结肠组织炎症和抗氧化性的影响;
图4为鱼油对副溶血弧菌感染小鼠结肠组织差异表达基因(DEGs)的影响;
图5为鱼油对副溶血弧菌感染小鼠结肠组织DEGs的GO功能富集和KEGG通路富集的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例,对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法;所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,为可从商业途径得到的试剂和材料。
1、材料
1.1、菌株:副溶血弧菌ATCC33847(tdh
1.2、动物:无特定病原菌(specific pathogen free,SPF)6周龄C57BL/6J小鼠28只,体重15±2g,购自斯贝福(北京)生物技术有限公司,合格证号SCXK(京)2019-0010,饲料源自纳瑞增(锦州)生物科技公司,动物房内温度20±2℃,相对湿度44±5%,12h明暗交替循环,适应1周期间,正常饮食和自由饮水。
1.3、溶菌营养肉汤(lysogeny broth,LB),北京路桥生物技术有限公司;鱼油(EPA:DHA=1:1);磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution,PBS,PH7.2)、氯化钠(NaCl)、4%多聚甲醛溶液,上海索莱宝科技有限公司;苏木素伊红染色试剂盒、天狼星红染色液试剂盒、抗氧化酶试剂盒、免疫荧光试剂盒、免疫组化试剂盒、细胞因子酶联免疫试剂盒,南京建成科技有限公司;Trizol提取剂、cDNA逆转录试剂盒、预混型qPCR试剂盒,艾科瑞生物工程有限公司。
2、副溶血弧菌菌悬液制备
从-80℃冰箱中取出副溶血弧菌ATCC33847冻干粉,在LB琼脂培养基上连续划线后,放入37℃恒温培养箱中活化18h;挑取单菌落接种到LB液体培养基中,37℃,150r/min摇床孵育12h;将复苏的菌液以1:100比例转接至新鲜的3%NaCl-LB液体培养基中扩大培养,待生长至对数期(OD
3、小鼠试验设计
暂养结束后,将28只C57BL/6J小鼠随机分为4组(n=7只/组):对照组、模型组、鱼油低剂量干预组和鱼油高剂量干预组。干预组小鼠每日分别灌胃0.1mL含有2.0mg和4.0mg鱼油的油水混合乳化液,连续补充14d,期间对照组和模型组小鼠正常饲喂;实验第15d,模型组和2个鱼油干预组小鼠均灌胃0.1mL含副溶血弧菌ATCC33847菌悬液(步骤2保存),对照组灌胃等体积生理盐水。暴露感染7d后结束实验,采用二氧化碳麻醉小鼠后颈椎脱臼法迅速处理小鼠,解剖收集明显病变的结肠组织,一部分使用RNase-free水快速清洗肠腔后置于液氮进行转录组测序,另一部分置于4%多聚甲醛中固定用于病理学研究,剩余部分冻存在-80℃冰箱用于抗氧化酶、细胞因子和基因表达分析。
4、小鼠疾病活动指数评价
感染期间,观察并记录各组小鼠的活动行为、饮食摄水、精神状况、粪便性状和体质量变化等指标。根据疾病活动指数评价标准,结合体质量下降比例、血便程度和脏器病变等指标进行评分。
5、结肠病理学分析
对固定的结肠样品进行酒精梯度脱水、透明、浸蜡、包埋、切片(厚度5μm)、展片、贴片、烤片、常规脱蜡复水、苏木素-伊红(htoxylin eosin,HE)染色和天狼猩红(sirius red,SR)染色、梯度脱水、中性树胶封片,使用普通光学显微镜或偏振光显微镜(400×)全盲阅片,观察结肠上皮结构完整性,分析结肠隐窝深度、水肿和固有层炎性细胞浸润,按照评分标准进行组织病理学评分。
6、结肠屏障功能检测
结肠屏障功能与组织纤维化程度密切相关,利用脏器纤维化标记物Ⅰ型胶原蛋白(type I collagen protein,TICP)和Ⅲ型胶原蛋白(type III collagen protein,TIIICP)表达量作为评价结肠屏障功能的指标。采用免疫荧光法检测结肠组织纤维化标记物TICP和TIIICP蛋白表达量,具体操作如下:取步骤5的方法制备的结肠石蜡切片,根据免疫荧光试剂盒说明书,将结肠石蜡切片脱蜡,热原修复,画圈5%胎牛血清封闭,滴加TICP和TIIICP一抗4℃孵育过夜,PBS洗涤3次后加入超敏兔鼠通用二抗避光室温孵育50min,随后,使用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(diaminy phenylindoles,DAPI)复染细胞核,猝灭结肠样本自发荧光;荧光显微镜(400×)观察并采集图像。TICP蛋白阳性表达为红色荧光,TIIICP蛋白阳性表达为绿色荧光,细胞核阳性表达为蓝色荧光。
7、结肠细胞因子含量和抗氧化酶活力检测
使用白介素1β、白介素6、肿瘤坏死因子α试剂盒检测结肠组织中细胞因子含量,过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和总抗氧化酶试剂盒检测结肠组织抗氧化活力,试样的制备和具体操作按照说明书开展,利用多功能酶标仪读取吸光度,测定结肠组织中6个指标,单位为pg/g或U/mg。
8、结肠组织转录组测序(RNA-seq)
从对照组、模型组和干预组(鱼油高剂量组)每组随机挑选3只小鼠结肠样品提取总RNA;利用Nanodrop 2000紫外分光光度法测定RNA纯度,1%琼脂糖凝胶电泳测定RNA完整性;Oligo(dT)磁珠富集分离真核生物mRNA;Fragmentation缓冲液将mRNA随机打断,用六碱基随机引物逆转录酶反转合成cDNA;纯化的双链cDNA经末端修复、加A尾并连接测序接头,于Illumina平台测序(百迈客生物科技有限公司,北京)。测序获得的原始读段(raw reads)经过滤后得到洁净读段(clean reads),将其比对到小鼠参考基因组mm10(Mus_musculus_GRCm39),使用RSEM计算9个试样的基因表达水平,并用DEseq2方法进行差异基因筛选,阈值为|log2 FC|≥1,P<0.01。根据差异基因检测结果,对候选基因进行GO功能富集和KEGG通路富集分析。
实验例1鱼油改善副溶血弧菌感染小鼠的结肠病例损伤
对照组鼠笼的垫料整洁无污、粪便呈颗粒状;模型组鼠笼的垫料黏附污渍、粪便呈带血稀状;2组鱼油干预的鼠笼垫料上黑色斑点和水样粪便出现不同程度的减少,其中高剂量干预组鼠笼垫料的整洁度与对照组相近,说明膳食补充鱼油能够显著改善副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)感染造成的小鼠腹泻和血便症状(图1A)。
普通光学显微镜下HE染色显示,对照组小鼠结肠隐窝清晰,层次分明,黏膜上皮结构完整,无炎性细胞润湿;模型组小鼠结肠黏膜结构明显缺失,黏膜细胞消减少,隐窝深度变浅,伴有增生结缔组织,固有层可见大量炎性细胞浸润;鱼油低剂量和高剂量组小鼠结肠黏膜下层的炎性细胞浸润显著减少,局灶性肠腺结构消失,Vp对结肠的侵袭显著改善(图1B)。
偏振光显微镜下SR染色显示,对照组小鼠结肠组织未见双折射光,模型组小鼠结肠组织呈现红、黄和绿色纤维相间,分别代表Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型胶原纤维,其中红色粗大纤维双折光较明显,伴有微弱的绿色和黄色细纤维折光,这与HE染色观察的结缔组织增生一致;鱼油高剂量组小鼠结肠组织中Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型胶原纤维双折光均显著降低,仅剩较弱的红色折射光;而鱼油低剂量组小鼠结肠组织胶原纤维化缓解效果不明显(图1C)。
采用疾病活动指数(disease activity index,DAI)和病理组织学评分(histopathological score,HIS),定量评估鱼油对Vp感染小鼠的保护作用,结果显示,经高剂量鱼油干预,小鼠DAI和HIS分别为3.89±0.31和4.05±0.28,显著低于模型组8.25±0.26和7.98±0.37(P<0.05),与对照组健康小鼠(0.12±0.02和1.05±0.04)相比,仍存在明显差异(P<0.05),表明高剂量鱼油缓解了Vp感染损伤(图1D-1E)。
实验例2鱼油保护副溶血弧菌感染小鼠的肠道屏障功能
肠道病理损伤诱导肠纤维化的发生,导致肠腔狭窄和梗阻,造成肠道屏障功能紊乱。为了确定鱼油对Vp感染小鼠结肠屏障功能的保护作用,对肠组织关键纤维化蛋白TICP和TIIICP进行免疫荧光分析,并对每组5张随机截取的图像进行阳性面积荧光密度定量(图2A-2C)。结果显示,在对照组结肠切片上无明显的TICP红色荧光和TIIICP绿色荧光分布;模型组结肠切片上出现了较多的TICP红色荧光和少量的TIIICP绿荧光区域,均有序的分布在细胞间质周围;鱼油干预促进了上述纤维化标记物恢复至正常水平,高剂量鱼油组TICP和TIIICP的蛋白荧光较少分布在切片周围;各组细胞核均呈现明亮的蓝色荧光。此外,与模型组相比,低和高剂量鱼油都降低了小鼠结肠组织TICP和TIIICP蛋白的阳性荧光强度,其中高剂量鱼油显著降低了2种纤维化标记蛋白的荧光强度(P<0.05),而低剂量鱼油组仅有所降低,效果不显著(P>0.05),说明膳食补充鱼油能够高度抑制Vp感染小鼠的结肠TICP和TIIICP蛋白表达,缓解结肠组织纤维化程度,提升肠道屏障功能。
实验例3鱼油抑制副溶血弧菌感染小鼠的炎症反应和氧化应激
肠道屏障功能受损,细菌与内毒素通过肠黏膜侵袭固有层,激活肠道炎症反应和氧化应激。如图3A-3C所示,与对照组相比,模型组小鼠结肠组织中白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(tumour necrosis factor,TNF-α)的含量分别升高了2.72、2.28和2.32倍,说明Vp感染使小鼠结肠产生了过度炎症反应;鱼油干预能够降低小鼠结肠3种促炎因子含量,其中高剂量抑制炎症的效果优于低剂量,IL-1β、IL-6和TNF-α水平仅为模型组的0.44、0.52和0.42倍,组间差异显著(P<0.05)。此外,如图3D-3F所示,检测各组小鼠结肠组织中过氧化氢酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)和总抗氧化酶(total antioxidant enzyme,T-AOC)活力发现,模型组结肠CAT、SOD和T-AOC水平显著低于对照组(P<0.05),说明Vp感染诱导炎症后,进一步造成肠道氧化应激损伤;鱼油干预不同程度提高了结肠3种抗氧化酶活力,特别是高剂量干预组CAT和T-AOC活性更是接近对照组水平(P>0.05)。综上说明,鱼油干预与炎症反应和氧化应激指标之间存在明显的剂量依赖关系,小鼠膳食补充高剂量鱼油能够更好的抑制Vp感染造成的过度炎症和氧化压力。因此,后续研究选择高剂量干预组深入探讨鱼油对小鼠的保护作用机理。
实验例4鱼油调控副溶血弧菌感染小鼠的肠道基因表达谱
一、识别差异表达基因
基于DESeq2方法筛选组间结肠组织中的差异表达基因(differentiallyexpressed genes,DEGs),模型组与对照组相比,筛选出169个显著变化的DEGs,86个上调,83个下调;干预组与模型组相比,筛选出显著变化的DEGs有106个,28个上调,78个下调(图4A-4C)。运用StringTie+edgeR方法,筛选对照组、模型组和干预组交集共有和特有的DEGs,3组间交集处共有12个DEGs,对照组与模型组间特有的DEGs为157个,干预组与模型组间特有的DEGs为94个(图4D)。针对3组间DEGs聚类分析,热图结果显示(图4E),与对照组相比,在干预组显著下调,而模型组中显著上调的DEGs包括:CXC趋化因子基因(Cxcl10、Cxcl2和Cxcl5)、TNF-α诱导蛋白基因(Tnfrsfl3c)、炎症因子受体基因(Nfkbil1)等;与对照组相比,在模型组显著下调,而干预组中显著上调的DEGs包括:PPAR家族蛋白基因(Pparg、Ppard、Ppara和Ppagcla)等,由此可见,膳食补充鱼油显著改变Vp诱导的结肠炎小鼠肠道组织基因表模式。
二、差异表达基因GO功能富集和KEGG途径富集分析
为了探索鱼油缓解Vp诱导肠炎性损伤的分子机制,利用Metascape软件,对DEGs进行GO和KEGG分析。结果显示,模型组与对照组的DEGs主要富集于生物学过程(Biologicalprocess)158个GO条目,包括:免疫系统过程(Immune system process)、对刺激的反应(Response to stimulus)和代谢过程(Metabolic process)等,细胞组分(Cellularcomponent)24个GO条目,包括:胞外区(Extracellular region)和分子复合物(Macromolecular complex)等,分子功能(Molecular function)16个GO条目,包括:结合作用(Bindings)和催化活性(Catalytic activity)等;干预组与模型组的DEGs富集于71个生物学过程,包括:细胞过程(Cellular process)、信号传导(Signalling)和生物调节(Biological regulation)等、19个细胞组分,包括:免疫球蛋白复合体(Immunoglobulincomplex)和质膜外侧(External side of plasma membrane)等、9个分子功能,包括:免疫球蛋白受体结(Immunoglobulin receptor binding)和抗原结合(Antigen binding)等(P<0.01,图5A-5B)。进一步了解鱼油介导的DEGs涉及的细胞信号通路,如图5C-5D所示,模型组与对照组相比,富集于10个KEGG信号通路,主要包括:细胞凋亡(Apoptosis)、弧菌感染(Vibrios infection)和核因子-κB信号通路(NF-kappa B signaling pathway)等;干预组与模型组相比,富集于23个KEGG信号通路,主要包括:PPAR信号通路(PPAR signalingpathway)、肠免疫网络IgA合成途径(Intestinal immune network for IgA production)和PI3K/AKT信号通路(PI3K/AKT signaling pathway)等。经DEGs网络互作分析(图5E-F),Cxcl10、Cxcl2、Cxcl5、Tnfrsfl3c、Nfkbil1等参与模型组富集的核因子-κB信号通路;而Pparg、Ppard、Ppara、Ppagcla等参与干预组富集的PPAR信号通路,这与图4热图分析的结果一致。上述结果表明,鱼油通过调节结肠基因表达,富集免疫相关信号通路,进而抑制炎症信号传导,缓解Vp感染诱导的结肠炎性损伤。
显然,以上所述的具体实施方案,只是对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步的详细说明,所应理解的是,以上所述仅为本发明的具体实例,并不用于限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、同等替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
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