LncRNA IFA及其在猪卵巢颗粒细胞中的应用

技术领域

本发明属于细胞工程和基因工程技术领域，具体涉及lncRNA IFA及其在猪卵巢颗粒细胞中的应用。

背景技术

LncRNA通常指长度超过200个核苷酸连接的内源性细胞RNA分子，根据lncRNA的基因位点解剖学特性可将其分为正义lncRNA(Sense lncRNA)、反义LncRNA(AntisenselncRNA)、内含子lncRNA(Intronic lncRNA)、双向lncRNA(Divergent lncRNA)及基因间lncRNA(Intergenic lncRNA)五类。

根据现有研究资料，lncRNA的作用模式主要分为以下四种：

1.信号(Signal)：lncRNA具有直接调控下游基因转录的作用，可以作为信号传导分子参与特殊信号通路的传导。

2.诱饵(Decoys)：lncRNA可以作为分子阻断剂，与DNA结合蛋白结合，进而阻断该蛋白分子的作用；抑或通过ceRNA机制，充当microRNA的分子海绵，阻断microRNA对下游靶标mRNA的抑制作用。

3.支架(Scaffold)：lncRNA作为媒介，同时结合多个蛋白分子从而形成蛋白-lncRNA复合物，实现不同信号通路之间的信息整合与交流。

4.引导(Guide)：lncRNA和蛋白分子结合(例如转录因子)，并将其引导至特定的DNA序列上，促进该蛋白发挥效应。

目前，已有大量的研究表明，lncRNA可以通过不同的作用模式参与细胞增殖、凋亡、迁移及分化的调控。

卵母细胞、颗粒细胞和膜细胞组成了卵泡的主要结构。在卵泡的发育过程中，卵泡发育最为显著的形态变化特征为颗粒细胞的增殖和卵泡腔的形成。原始卵泡时期，卵母细胞被单层扁平状的颗粒细胞所包裹，随着卵泡的发育，颗粒细胞逐渐增殖至数层，形态由扁平状变为柱状，并在卵泡成熟排卵前形成包裹卵母细胞的卵丘颗粒细胞和紧贴卵泡内壁的壁层颗粒细胞。此外，大量的研究普遍认为，卵泡的发育、排卵过程和颗粒细胞的增殖分化有着密切联系，而颗粒细胞的过度凋亡会引起卵泡闭锁。

发明内容

为解决相关问题，本发明的首要目的在于提供一种长链非编码RNA。

本发明的另一目的在于提供上述长链非编码RNA在猪卵巢颗粒细胞中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种长链非编码RNA，命名为lncRNA IFA，其核苷酸序列如SEQID NO：1所示。

上述长链非编码RNA相关的生物材料，为下述生物材料中的任意一种或多种组合：

1)编码所述长链非编码RNA的DNA分子；

2)含有1)中所述DNA分子的表达盒；

3)含有1)中所述DNA分子的重组载体，或含有2)中所述表达盒的重组载体；

4)抑制所述长链非编码RNA表达的小干扰RNA片段；

5)含有1)中所述DNA分子的重组细胞，或含有2)中所述表达盒的重组细胞，或含有3)所述重组载体的重组细胞，或含有4)中所述小干扰RNA片段的重组细胞。

进一步地，1)中所述DNA分子通过如下方式制备得到：提取猪卵巢颗粒细胞的RNA，将其逆转录成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，得到目的片段。

更进一步地，PCR扩增所用引物如下所示：

lncRNA IFA F：5’-GGCGATGCCTGGGTACATGG-3’；

lncRNA IFA R：5’-GAGACCGCGTCCACTCCGCC-3’。

进一步地，3)中所述重组载体通过如下方式制备得到：将所述DNA分子连接到用限制性内切酶BamHI和Xba I酶切后的pcDNA3.1载体上，得到重组载体。

进一步地，4)中所述小干扰RNA片段的靶向序列为：5’-TGACCTGGGCGACGTAGCA-3’。

上述长链非编码RNA或上述长链非编码RNA相关的生物材料在猪卵巢颗粒细胞中的应用，体外环境下，所述的长链非编码RNA正调控细胞增殖、细胞凋亡、细胞活性、细胞周期进程中的任意一种或多种功能表型。

进一步地，增加外源性lncRNA IFA，促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、提高细胞活性和/或加快细胞周期进程；抑制lncRNA IFA表达，抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、降低细胞活性和/或阻滞细胞周期进程中。

上述长链非编码RNA或DNA分子或表达盒或重组载体在制备药物中的应用，所述的药物为下述药物中的任意一种或多种组合：

Ⅰ.促进猪卵巢颗粒细胞增殖的药物；

Ⅱ.抑制猪卵巢颗粒细胞凋亡的药物；

Ⅲ.提高猪卵巢颗粒细胞活性的药物；

Ⅳ.加快猪卵巢颗粒细胞的细胞周期进程的药物；

Ⅴ.促进卵泡发育的药物。

LncRNA IFA(Inhibitor of Follicular Atresia，暂命名)为针对猪卵巢颗粒细胞进行RNA-seq所获得的lncRNA，其核苷酸序列如SEQID NO：1所示，其在卵巢颗粒细胞的增殖、凋亡、调控过程中可能发挥重要作用。

本发明通过基因工程和细胞工程技术，首先明确lncRNA IFA的全部序列及lncRNAIFA是否具有编码蛋白的能力，进而确定lncRNA IFA在卵巢颗粒细胞增殖与凋亡调控中的应用。

本发明的验证结果如下：

1、本发明通过5’/3’RACE实验获取lncRNA IFA的全长序列(图1中a)；生物信息学网站(CPC 2.0)预测结果显示lncRNA IFA不具有蛋白编码能力(图1中b)；通过NCBI网站的ORF finder工具对lncRNA IFA序列进行分析，发现其序列中存在3个ORF(图1中c)。

2、本发明通过质粒转染及荧光成像检测到，转染pcDNA3.1-EGFP质粒的颗粒细胞中可以检测到绿色荧光，而转染pcDNA3.1、pcDNA3.1-Mut EGFP及pcDNA3.1-ORF+Mut EGFP质粒的颗粒细胞无法检测到绿色荧光(图2中b)。

3、本发明通过EdU(5-Ethynyl-2'-deoxyuridine)实验证明，在体外环境下，过表达lncRNA IFA可以促进卵巢颗粒细胞的增殖(P<0.01)，而干扰lncRNA IFA则抑制卵巢颗粒细胞的增殖(P<0.05)(图3)。

4、本发明通过CCK8(Cell Counting Kit-8)实验证明，在体外环境下，过表达lncRNA IFA后卵巢颗粒细胞的细胞活性显著增强(P<0.01)，而干扰lncRNA IFA后卵巢颗粒细胞的细胞活性被显著抑制(P<0.01)(图4中b)。

5、本发明通过流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)实验证明，在体外环境下，过表达lncRNA IFA可显著抑制卵巢颗粒细胞的凋亡(P<0.01)，并加快卵巢颗粒细胞的细胞周期进程(P<0.05)，干扰lncRNA IFA后，卵巢颗粒细胞凋亡率显著下降(P<0.001)，且细胞周期进程被显著抑制(P<0.01)(图5、图4中a)。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明以一新发现的长链非编码RNA——lncRNA IFA为研究对象，采用分子细胞生物学方法，首先扩增出lncRNA IFA的全部序列，并证实lncRNA IFA不具有编码蛋白质的能力；随后研究了lncRNA IFA对卵巢颗粒细胞增殖、细胞凋亡、细胞活性、细胞周期的影响，证实了lncRNA IFA可以促进卵巢颗粒细胞的增殖、抑制凋亡，同时增强卵巢颗粒细胞的细胞活性，加快卵巢颗粒细胞的细胞周期进程。

附图说明

图1是lncRNA IFA的5’/3’RACE及开放阅读框、蛋白编码潜力预测结果图；其中，a为5’/3’RACE产物凝胶电泳结果，b为NCBI ORF finder开放阅读框预测结果，c为CPC 2.0网站预测结果；

图2是lncRNA IFA蛋白编码能力验证图；其中，a为蛋白编码能力验证载体的结构示意图，b为转染四种载体后的颗粒细胞绿色荧光采集照片；

图3是EdU检测细胞增殖结果及分析图；

图4是细胞周期和细胞活性检测结果及分析图；其中，a为细胞周期检测结果及分析图，b为CCK8检测细胞活性结果及分析图；

图5是细胞凋亡检测结果及分析图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。实施例中除特殊说明外，均为本领域常规试剂和方法步骤。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。

实施例1：构建lncRNA IFA超表达载体

BioEdit软件分析发现lncRNA IFA序列中无BamH I和Xba I两种限制性内切酶的酶切位点，而pcDNA3.1载体(购自Invitrogen公司，货号V79020)序列中存在BamH I和Xba I酶切位点。通过NCBI primer blast在线工具设计lncRNA IFA的全长序列引物，并在其上下游引物序列(lncRNA IFA F：5’-GGCGATGCCTGGGTACATGG-3’(SEQ ID NO.12)；lncRNA IFAR：5’-GAGACCGCGTCCACTCCGCC-3’(SEQ ID NO.13))中分别加上BamH I和Xba I酶切位点序列。提取猪的卵巢颗粒细胞系RNA并逆转录，获得cDNA文库，再以cDNA为模板，通过PCR扩增目的片段(序列如SEQ ID NO.1所示)，经纯化回收、双酶切、连接至pcDNA3.1载体、转化、筛选、测序鉴定正确后抽提无内毒素质粒(无内毒素质粒小量提取试剂盒购自Magen公司)，所获重组载体命名为pcDNA3.1-lncRNA IFA。

本发明所用的lncRNA IFA的序列(SEQ ID NO.1)：

GGCGATGCCTGGGTACATGGTGGTGCCACCCGACAGCACCGTGTTGGCGTAGAGGTCCTTGCGGATGTCGACGTCGCACTTCATGATGGAGTTGAAGGTAGTTTCGTGGATGCCGCAGGATTCCATGCCCAGGAAGGAGGGCTGGAAGAGCGCCTCGGGGCAGCGGAAGCGCTCGTTGCCGATGGTGATGACCTGGCCGTCGGGCAGCTCGTAGCTCTTCTCCAGGGAGGAGGAGGACGCGGCAGTGGCCATCTCCTGCTCGAAGTCCAGGGCGACGTAGCACAGCTTCTCCTTGATGTCCCGCACGATCTCCCGCTCGGCCGTGGTGGTGAAGCTGTAGCCCCGCTCCGTCAGGATCTTCATGAGGTAGTCGGTGTGGTGCCAGATCTTCTCCATGTCGTCCCAGTTGGTGACGATGCCGTGCTCGATGGGGTACTTGAGGGTCAGGATGCCTCTCTTGCTCTGGGCCTCGTCCCCCACGTAGGAGTCCTTCTGGCCCATGCCCACCATCACGCCCTGGTGTCGGGGGCGCCCCACGATGGAGGGGAAGACGGCCCGGGGAGCATCGTCGCCCGCAAAGCCGGCCTTGCACATGCCGGAGCCGTTGTCGACCACGAGCGCAGCAATATCGTCATCCATGGCGAACTGGTAGCGGTGTAGACCGGCGGCGAAGGCGGAGCGGCAAGGGCGAGGGGCCTGTGCTGGCGGAGTGGACGCGGTCTC。

实施例2：lncRNA IFA蛋白编码能力及ORF的预测

使用CPC 2.0生物信息学网站在线预测lncRNA IFA的蛋白编码能力，使用通过NCBI网站的ORF finder工具在线预测lncRNA IFA序列中存在的开放阅读框。

CPC 2.0：http://cpc2.gao-lab.org/

NCBIORF finder：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/。

本发明所用的lncRNA IFA的ORF序列：

ORF1(SEQ ID NO.2)：

ATGTCGACGTCGCACTTCATGATGGAGTTGAAGGTAGTTTCGTGGATGCCGCAGGATTCCATGCCCAGGAAGGAGGGCTGGAAGAGCGCCTCGGGGCAGCGGAAGCGCTCGTTGCCGATGGTGATGACCTGGCCGTCGGGCAGCTCGTAG

ORF2(SEQ ID NO.3)：

ATGTCGTCCCAGTTGGTGACGATGCCGTGCTCGATGGGGTACTTGAGGGTCAGGATGCCTCTCTTGCTCTGGGCCTCGTCCCCCACGTAG

ORF3(SEQ ID NO.4)：

ATGCCCACCATCACGCCCTGGTGTCGGGGGCGCCCCACGATGGAGGGGAAGACGGCCCGGGGAGCATCGTCGCCCGCAAAGCCGGCCTTGCACATGCCGGAGCCGTTGTCGACCACGAGCGCAGCAATATCGTCATCCATGGCGAACTGGTAG

实施例3：构建验证lncRNA IFA蛋白编码能力的载体

删除增强型绿色荧光蛋白(EGFP)序列中的起始密码子(ATG)，将删除ATG后的EGFP序列其命名为EGFPMut；删除lncRNA IFA的开放阅读框序列中的终止密码子(TAG)，将删除TAG后的开放阅读框序列连接至EGFP Mut序列前，将所获之组合序列命名为ORF+EGFP Mut(EGFP、EGFP Mut、ORF+EGFP Mut由广州科易达生物科技有限公司合成)。

使用BioEdit软件分析EGFP、EGFP Mut、ORF+EGFP Mut序列中酶切位点的分布情况，并结合pcDNA3.1载体图谱，选择Nhe I和Hind III作为构建lncRNA IFA蛋白编码验证载体的酶切位点。

BioEdit软件分析发现分析EGFP、EGFP Mut及ORF+EGFP Mut序列中不含Nhe I和Hind III两种限制性内切酶的酶切位点，而pcDNA3.1载体(购自Invitrogen公司，货号V79020)存在Nhe I和Hind III酶切位点。利用NCBI primer blast在线工具设计扩增EGFP、EGFP Mut及ORF+EGFP Mut序列的引物，其上下游分别加上Nhe I和Hind III酶切位点序列。PCR扩增目的片段，经纯化回收、双酶切、连接pcDNA3.1载体、转化、筛选、测序鉴定正确后抽提无内毒素质粒(无内毒素质粒小量提取试剂盒购自Magen公司)，所获质粒分别命名为pcDNA3.1-EGFP、pcDNA3.1-EGFP Mut、pcDNA3.1-ORF+EGFP Mut。

扩增EGFP、EGFP Mut及ORF+EGFP Mut序列的引物信息如下：

EGFP-F：5’-GCTAGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’(SEQ ID NO.5)；

EGFP-R：5’-AAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’(SEQ ID NO.6)；

EGFP Mut-F：5’-GCTAGCGTGAGCAAGGGCGAGGAGCT-3’(SEQ ID NO.7)；

EGFP Mut-R：5’-AAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’(SEQ ID NO.8)；

ORF+EGFP Mut-F：5’-GCTAGCATGTCGACGTCGCACTTCAT-3’(SEQ ID NO.9)；

ORF+EGFP Mut-R：5’-AAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTCCA -3’(SEQ ID NO.10)。

实施例4：卵巢颗粒细胞的培养

(1)取屠宰场采集的猪卵巢组织放入含1％(w/w)双抗的PBS或生理盐水中，置于冰上迅速带回实验室；

(2)将采集的卵巢在无菌培养室用PBS或生理盐水(含1％(w/w)双抗)清洗3遍后，迅速转入超净工作台，并用1mL无菌一次性注射器浅插入卵巢有腔卵泡中吸取卵泡液；

(3)吸取的卵泡液置于含有适量DMEM培养基的离心管中，800rpm室温离心5min；

(4)弃去上清，再用DMEM培养基重悬、离心，重复清洗细胞2次；配制DMEM完全培养基：89％(w/w)高糖DMEM培养基+10％(w/w)FBS+1％(w/w)双抗；

(5)用完全培养基重悬细胞，接种于75mL培养瓶；置于37℃，5％CO

所述的双抗为青霉素和链霉素。

实施例5：卵巢颗粒细胞的接种和转染

(1)猪卵巢颗粒细胞汇合度达到70～90％左右时，弃培养基，用预热的PBS清洗细胞3遍；

(2)加入0.25％胰蛋白酶消化，放入培养箱3min左右，显微镜下观察至大部分细胞漂起，立即加入等量终止液(DMEM完全培养基；)终止消化；

(3)PBS清洗2遍，期间800rpm离心5min；

(4)用完全培养基轻轻重悬细胞沉淀，均匀分到每个孔中，用完全培养基补充体积，轻轻摇匀，放培养箱中培养；

(5)24h左右，观察猪卵巢颗粒细胞状态，待细胞汇合度达70～90％左右时准备转染；

(6)转染方法按Invitrogen公司的

(7)转染后的细胞置于37℃，5％CO

(8)根据实验目的在转染2h4或48h后收集细胞。

实施例6：RNA抽提及反转录

细胞总RNA提取参照Takara公司TRIzol操作说明书，具体操作步骤如下：

(1)猪卵巢组织用液氮研磨后，按每50～100mg的组织量加入1mL TRIzol，并反复吹打几次；从贴壁猪卵巢颗粒细胞中提取总RNA时，按每10cm

(2)冰上静置10min以充分裂解组织/细胞，12000rpm离心5min，弃沉淀吸上清于新1.5mL RNase-free管中；

(3)加入200μL氯仿(每1mL TRIzol)剧烈震荡15～30s，冰上静置15min，4℃12000rpm离心15min；

(4)吸取上层水相置于新的1.5mL RNase-freeEP管中；

(5)加入500uL异丙醇(每1mL TRIzol)，轻轻地上下颠倒混匀后在冰上静置10min，4℃12000rpm离心10min；

(6)弃上清后置于室温，沿管壁加入1mL 75％乙醇-DEPC水以洗涤RNA，4℃12000rpm离心5min后弃上清；

(7)真空干燥5～10min，注意避免RNA沉淀干燥过度；

(8)加入DEPC水以溶解RNA沉淀。

mRNA反转录参照TaKaRa公司的PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect RealTime)cDNA反转录试剂盒进行。

实施例7：卵巢颗粒细胞增殖检测

颗粒细胞的增殖检测采用EdU法，操作过程参照Cell-Light EdU Apollo 567Invitro Kit说明书进行(以48孔细胞培养板为例)：

(1)每孔加入150μL浓度为50μM的EdU培养基至细胞培养板内，置于细胞培养箱内孵育2h，弃培养基，PBS清洗细胞2次；

(2)加150μL/孔细胞固定液(含80％丙酮的PBS)室温孵育30min，弃固定液。PBS清洗细胞2次；

(3)加150μL/孔渗透剂(含0.5％Triton X的PBS)透化细胞3min，PBS清洗细胞3次；

(4)加150μL/孔的1×Apollo染色反应液，避光、室温孵育30min，弃染色反应液。PBS脱色摇床清洗6次，每次5min；

(5)加150μL/孔DAPI染色液，室温避光孵育30min后，弃染色反应液，加150μL/孔PBS清洗3次；

(6)染色完成后，用荧光显微镜进行照片采集。

实施例8：卵巢颗粒细胞凋亡检测

颗粒细胞凋亡检测参照Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒说明书进行：

(1)将细胞培养板放置在室温，用PBS轻轻润洗培养板内细胞，弃PBS；

(2)加入胰酶消化细胞，放入培养箱3min左右，显微镜下观察至大部分细胞漂起，立即加入等量终止液(完全培养基)终止消化；

(3)1000xg离心5min收集细胞，弃上清，用预冷PBS清洗细胞两次；调整每管细胞数为0.2～1.0×10

(4)样品每管依次加入5μL的FITC-Annexin V，室温避光反应15min；

(5)再依次加入10μL的PI，轻轻混匀后，4℃避光反应5min；

(6)反应完成后立即用流式细胞仪检测分析。

实施例9：卵巢颗粒细胞活性检测

颗粒细胞活性检测参照Biosharp公司的Cell Counting Kit-8试剂盒说明书进行(以96孔细胞培养板为例)：

(1)吸弃细胞培养板内的培养基，用PBS润洗细胞，弃PBS

(2)用完全培养基稀释CCK8溶液，使之终浓度为10％；

(3)每孔加入100μL的10％的CCK8溶液，培养板放入培养箱孵育1-4h；

(4)吸取孵育完后的CCK8溶液，用酶标仪测定在450nm处的吸光值。

实施例10：卵巢颗粒细胞周期检测

颗粒细胞活性检测参照凯基公司的PI/RNase Staining Buffer说明书进行：

(1)将细胞培养板放置在室温，用PBS轻轻润洗培养板内细胞，弃PBS；

(2)加入胰酶消化细胞，放入培养箱3min左右，显微镜下观显微镜下观察至大部分细胞漂起，立即加入等量终止液(完全培养基)终止消化；

(3)1000xg离心5min收集细胞，弃上清，用预冷PBS清洗细胞两次；

(4)每管细胞样品中加入0.5毫升PI/RNase Staining Buffer，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光温浴30min；

(5)反应完成后立即用流式细胞仪检测分析。

结果分析

1、通过CPC 2.0及NCBI ORF finder生物信息学网站在线预测lncRNA IFA的蛋白编码能力和开放阅读框。预测结果显示lncRNA IFA不具有编码蛋白的能力，但其序列中存在3个开放阅读框(图1中b和c)。

2、pcDNA3.1-EGFP、pcDNA3.1-EGFP Mut、pcDNA3.1-ORF+EGFP Mut三种质粒转染至卵巢颗粒细胞内，24h后使用荧光相机拍照。结果显示，转染pcDNA3.1-EGFP质粒的颗粒细胞中可以检测到绿色荧光，而转染pcDNA3.1、pcDNA3.1-Mut EGFP及pcDNA3.1-ORF+Mut EGFP质粒的颗粒细胞无法检测到绿色荧光(图2中b)。上述实验结果说明lncRNA IFA序列中的开放阅读框在卵巢颗粒细胞内无法进行翻译。

3、在卵巢颗粒细胞内分别转染pcDNA3.1-lncRNA IFA和si-lncRNA IFA，在转染12h、24h、36h、48h后，分别检测颗粒细胞活性。结果显示，与对照组相比，转染pcDNA3.1-lncRNA IFA的颗粒细胞活性显著提高(P<0.001)，而转染si-lncRNA IFA的颗粒细胞活性则显著下降(P<0.01)(图4中b)。本研究在此可以确定lncRNA IFA对卵巢颗粒细胞活性具有促进作用。

小干扰RNA片段靶向序列(si-LncRNA IFA)：5’-TGACCTGGGCGACGTAGCA–3’(SEQ IDNO.11)。

上述小干扰RNA片段由广州市锐博生物科技有限公司合成；对照组NC来自广州市锐博生物科技有限公司，下同(NC为该公司通用阴性对照产品)。

4、在卵巢颗粒细胞内分别转染pcDNA3.1-lncRNAIFA和si-lncRNAIFA，在转染48h后收集细胞，通过流式细胞术检测卵巢颗粒细胞的凋亡比率及细胞周期进程的变化。结果显示，与对照组相比，转染pcDNA3.1-lncRNA IFA的颗粒细胞凋亡比率显著降低(P<0.001)，S期细胞比率显著提高(P<0.05)；而转染si-lncRNA IFA的颗粒细胞凋亡比率显著升高(P<0.001)，S期细胞比率显著下降(P<0.01)(图5、图4中a)。说明lncRNA IFA可以抑制卵巢颗粒细胞凋亡、加快细胞周期进程。

5、在卵巢颗粒细胞内分别转染pcDNA3.1-lncRNA IFA和si-lncRNA IFA ，转染24h后检测颗粒细胞的增殖率，结果显示，与对照组相比，转染了pcDNA3.1-lncRNA IFA的颗粒细胞增殖比率显著升高(P<0.001)，而转染si-lncRNA IFA的颗粒细胞增殖比率显著下降(P<0.05)(图3)。说明lncRNA IFA可以促进卵巢颗粒细胞的增殖。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述的实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。