谷氨酸脱羧酶突变体V6L及其在γ-氨基丁酸生产中的应用

技术领域

本发明属于酶工程和基因工程领域，具体涉及谷氨酸脱羧酶突变体V6L及其在γ-氨基丁酸生产中的应用。

背景技术

γ-氨基丁酸(GABA)是一种4-碳非蛋白质氨基酸，其在食品、农业、医药和其他领域均具有广泛的应用(Xu et al.,2017；Sarasa et al.,Curr.Microbiol,2020,77(4):534-544)。大量研究表明，GABA是一种广泛存在于哺乳动物中枢神经系统中的抑制性神经递质，具有许多重要的生理功能，如利尿、调节血压、镇静作用等(Baritugo,K.A.,MicrobCell Fact,2018,17(1):129)。此外，在生化工业中，GABA也被用于合成工业产品，如2-吡咯烷酮和可生物降解的聚酰胺尼龙4。

目前，γ-氨基丁酸生产包括化学合成法、植物富集法和微生物合成法等。但是受到苛刻的反应条件及昂贵的天然原料的限制，利用化学合成法生产GABA安全性较差、有化学残留；植物富集法虽然安全性好，但制得的GABA浓度太低，无法作为医药、食品添加剂。谷氨酸脱羧酶(GAD)(EC 4.1.1.15)能不可逆地催化L-谷氨酸(盐)转化生成γ-氨基丁酸，是生物转化法合成γ-氨基丁酸的关键酶制剂，具有巨大的市场应用价值。

近些年来，大量不同来源的谷氨酸脱羧酶被克隆并表征，如：大肠杆菌来源的GadB，巨大芽孢杆菌来源的GadB，乳酸杆菌的GadA和GadB等。然而，GAD的嗜酸性和低酶活限制了其在工业上的应用。因此，探索和鉴定性能优良、活性高的新型GADs是非常有必要的。Jun等通过优化GadB(Escherichia coli)的N端结构域，提高了其热稳定性。Fang等通过对短乳杆菌CGMCC No.1306和Thermococcus kodakarensis的GAD同源序列比对，在GAD的13个残基位置引入脯氨酸，获得了耐热性较高的突变酶G364P。但是，目前国内外已报道的谷氨酸脱羧酶一般催化效率较低，尤其是在偏中性条件下，这一特性已经严重影响了其在工业上的应用前景。

因此，通过筛选或定向突变改造谷氨酸脱羧酶，获得在不同pH条件下具有较高催化活力的GAD，并基于此构建高效生物催化系统，为工业化应用于高产γ-氨基丁酸提供基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种谷氨酸脱羧酶突变体V6L，所述突变体为SEQ ID NO.3所示。

本发明的另一个目的在于提供了谷氨酸脱羧酶突变体V6L在催化生产γ-氨基丁酸中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

申请人将来源于大肠杆菌(Escherichia coli str.K-12substr.MG1655NC_000913.3)的野生型谷氨酸脱羧酶第6位氨基酸由缬氨酸V突变为亮氨酸L，得到了本发明的谷氨酸脱羧酶突变体V6L，为SEQ ID NO.3所示。

本发明的保护内容还包括：编码SEQ ID NO.3所示蛋白的基因。

以上所述的基因优选的，为SEQ ID NO.4所示。

表达SEQ ID NO.3所示蛋白的重组菌株。

以上所述的重组菌株，是将谷氨酸脱羧酶突变体V6L的表达载体转化进地衣芽胞杆菌所得。

所述的地衣芽孢杆菌为用于表达外源蛋白的地衣芽胞杆菌；优选的为地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)DW2。

一种高效生产γ-氨基丁酸的方法，包括下述步骤：

100mL全细胞催化缓冲液中、加入4～5g/L全细胞催化用菌泥，底物谷氨酸浓度为1～2mol·L

所述的全细胞催化用菌泥中的有效菌株为表达SEQ ID NO.3所示蛋白的重组菌株；所述的全细胞催化缓冲液为磷酸吡哆醛(PLP)0.1mmol·L

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明通过定点突变的方式，将谷氨酸脱羧酶分子N端结构域的第6位缬氨酸突变为亮氨酸(本发明命名为突变体V6L)，显著提高了谷氨酸脱羧酶的酶活力，能够大大提高其产γ-氨基丁酸的能力，通过谷氨酸脱羧酶的活性测定分析，发现相较于野生型谷氨酸脱羧酶，本发明的谷氨酸脱羧酶突变体V6L在不同pH条件下都表现出明显提高的酶活性，提示其更适合工业化生产。通过实验表明，基于表达谷氨酸脱羧酶突变体的地衣芽胞杆菌重组菌株具有优良的γ-氨基丁酸生产能力，1M底物全细胞催化反应4h后，转化液中γ-氨基丁酸的含量可达93g/L，底物摩尔转化率约90％，相比于含有未突变谷氨酸脱羧酶基因的重组菌具有更好的工业化应用前景。

附图说明

图1为突变体和野生型不同条件下的催化活性比较。

图2为突变体工程菌全细胞催化后产物含量。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。为使本发明技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明作进一步的详细说明，但并不构成对本发明的限制。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB液体培养基：酵母粉5g·L

LB固体培养基：酵母粉5g·L

TB液体培养基：酵母粉24g·L

全细胞催化缓冲体系：磷酸吡哆醛(PLP)0.1mmol·L

实施例1：

重组质粒pHY-P43-gadB的构建：

用gadB-F和gadB-R从大肠杆菌(Escherichia coli str.K-12substr.MG1655NC_000913.3)中克隆得到谷氨酸脱羧酶gadB基因(SEQ ID NO.2所示，编码SEQ ID NO.1所示蛋白)。以Bacillus subtilis 168基因组为模板，P43-F和P43-R为引物扩增获得P43启动子；TamyL-F和TamyL-R为引物扩增获得淀粉酶终止子TamyL。P43-F和TamyL-R为引物将P43、gadB、TamyL三个片段进行SOE-PCR获得融合片段P43-gadB-TamyL。以质粒pHY300PLK为模板，pHY-T5-F和pHY-T5-R为引物进行全质粒PCR扩增，获得线性化pHY300PLK载体。以上扩增产物经电泳检验后，采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收。通过ClonExpress II一步克隆试剂盒，将融合片段与线性化载体pHY300PLK进行融合，得到重组质粒pHY-P43-gadB。将融合的重组质粒pHY-P43-gadB转化至感受态E.coli DH5α，用含四环青霉素的LB平板筛选阳性菌落。37℃摇床过夜培养后提取质粒pHY-P43-gadB，并进行测序验证。

其中，引物的序列为：

P43-F:TTTTTATAACAGGAATTCTGATAGGTGGTATGTTTTCG

P43-R:TAATCTCCTACTGTATACATTGATCCTTCCTCCTTTAGA

gadB-F:GTATACAGTAGGAGATTAATGGATAAGAAGCAAGTA

gadB-R:ATGATTTATTTTGTTCAGTCAGGTATGTTTAAAGCT

TamyL-F:CTGAACAAAATAAATCATAAAAGAGCAGAGAGGACGGATT

TamyL-R:TTTGCCCAAGCTTCTAGAAGCGCAATAATGCCGTCGCACT

pHY-T5-F:GAATTCCTGTTATAAAAAAAGGATC

pHY-T5-R:TCTAGAAGCTTGGGCAAAGCGTTTT

实施例2：

谷氨酸脱羧酶野生菌(WT)的制备及酶活测定：

将实施例1中测序正确的质粒pHY-P43-gadB，转化至Bacillus licheniformisDW2中。挑选转化子验证正确后接种到LB培养基中，37℃，培养12h；转接到TB液体培养基，接种量为3％，37℃培养24h，离心收集菌体，利用PBS洗涤菌体两次，用含有0.1mmol·L

重组GAD粗酶液酶活性的测定：

底物溶液配制：0.1mol·L

酶活定义：1min催化底物转化生成1μmol GABA所需的酶量为一个活力单位(U)。酶活测定结果显示，野生GAD的酶活为14.4U/mL(图1)。

实施例3：

谷氨酸脱羧酶突变体的制备：

采用定点突变策略，根据待突变的氨基酸位点来设计点突变引物，通过PCR方法获得谷氨酸脱羧酶突变序列。以已构建的pHY-P43-gadB为模板，设计引物进行全质粒PCR扩增，获得线性化带P43启动子和淀粉酶TamyL终止子的pHY300PLK载体。具体为将谷氨酸脱羧酶分子的第6位缬氨酸突变为亮氨酸，把编码gadB的第6位氨基酸的碱基CTC拆分成两部分，引物V6L-F和V6L-R，以实施例1质粒pHY-P43-gadB为模板扩增，使用Dp nI限制性内切酶消化模板质粒，随后转化大肠杆菌感受态并涂布含有四环霉素的筛选平板。筛选获得含有特定突变位点的重组质粒突变体，并进行测序确认，突变质粒命名为pHY-G AD-V6L。

V6L-F：AAACAGCTCACGGACCTTAGAAGCGAA

V6L-R：AAGGTCCGTGAGCTGTTTTTTGTCCATTGTACATTC。

依照上述方法，申请人同时构建了pHY-GAD-K464E，pHY-GAD-F463G，pHY-GAD-S462R质粒：

pHY-GAD-K464E为将谷氨酸脱羧酶分子的第464位赖氨酸突变为谷氨酸后制备的表达质粒；

pHY-GAD-F463G为将谷氨酸脱羧酶分子的第463位苯丙氨酸突变为甘氨酸后制备的表达质粒；

pHY-GAD-S462R为将谷氨酸脱羧酶分子的第462位丝氨酸突变为精氨酸后制备的表达质粒。

实施例4：

谷氨酸脱羧酶突变菌株的制备及酶活测定：

将实施例3中测序正确的突变体质粒，转化进Bacillus licheniformis DW2。挑选转化子验证正确后接种至LB培养基中，37℃，培养12h；转接到TB液体培养基中，接种量为5％，37℃培养24h。

按照实施例2中的方法检测重组菌株的酶活，实验结果表明与WT菌株比较，V6L突变体酶活为23.5U/mL(图1)，是WT菌株酶活的1.6倍。同时检测了偏中性条件下(pH6.0)的酶活，结果显示V6L突变体的酶活为8.5U/mL，相比对照4.8U/mL的酶活也有显著的提高(图1)。但是其余突变体酶活在pH 4.5和pH 6.0条件下相比对照组均降低(表1)。

表1野生型和突变体在不同条件下的酶活比较

实施例5：

构建全细胞催化系统高效生产γ-氨基丁酸

将构建的表达谷氨酸脱羧酶野生型和谷氨酸脱羧酶突变体的重组菌株，在纯水相体系中直接加入L-谷氨酸底物，开发生物转化法高效生产γ-氨基丁酸的工艺。优选的具体实施方案，在250mL三角锥形瓶中加入100mL全细胞催化缓冲液、加入4g/L全细胞催化用菌泥，底物谷氨酸浓度为1mol·L

对样品进行衍生化后HPLC测定样品中的γ-氨基丁酸的含量以及转化率。对照组的实验条件与实验组保持一致。转化液中γ-氨基丁酸的含量可达93g/L，底物摩尔转化率为90％。相比于含有未突变谷氨酸脱羧酶基因的重组菌，本发明的谷氨酸脱羧酶基因突变体的重组菌的转化率提高显著(图2)，因而具有更好的工业化应用前景。

转化率的计算方法：GABA实际生成的摩尔数/谷氨酸转化生成GABA的理论摩尔数×100。