淫羊藿素在保护药物性及以铁死亡为基础的肝损伤疾病中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及淫羊藿素在保护药物性及以铁死亡为基础的肝损伤疾病中的新用途。

背景技术

淫羊藿素(Icaritin，ICT)是一种从中草药淫羊藿中提取出来的异戊烯基黄酮化合物，在许多动物和细胞模型中都显示出有效的护肝效果。淫羊藿素能够通过AKT/GSK3β通路、PPARα/CPT1a-ACOX1通路以及LKB1/AMPK/ACC通路保护非酒精性肝损伤，也能够通过调节氧化应激来缓解缺血再灌注肝损伤等部分肝损伤疾病。

RSL3((1S,3R)-RSL3)是一种谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的抑制剂，可以通过在硒代半胱氨酸位点直接与GPX4共价结合从而抑制其活性，从而诱导铁死亡。

对乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)是常见的解热镇痛非处方药物，被批准应用于多种抗感冒药物中，但由于人们对其毒副作用认识不足、或交叉服用多种含APAP成分的药物从而导致APAP过量，会造成严重的肝损伤。

目前已有研究表明，酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、肝纤维化以及药物性肝损伤均存在铁稳态失调等铁死亡特征，且对于包括非酒精性脂肪肝病在内的肝损伤疾病尚无针对性疗法。另外，目前淫羊藿素保护肝损伤疾病的研究主要集中于非酒精性脂肪肝、缺血再灌注肝损伤以及肝纤维化等方向，而针对APAP诱导的肝损伤等疾病的保护功效尚不明确。因此，如何针对肝损伤疾病及其中涉及的铁死亡机制发现新的治疗方法和药物、提高治疗效果成为急需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供淫羊藿素在保护APAP急性肝损伤和铁死亡相关的肝损伤疾病中的新用途。所述应用中，所述具体细胞可为人正常肝细胞。

本发明第一个方面是提供淫羊藿素在铁死亡诱导剂RSL3诱导的肝细胞铁死亡模型中发挥的保护作用；在一个具体的实施例中，所述的保护是通过降低肝细胞内的亚铁离子、脂质过氧化物和ROS的水平从而保护肝细胞铁死亡；在另外一个具体的实施例中，所述的保护是通过促进肝细胞PRDX6的上调实现对肝细胞的保护；在另外一个具体的实施例中，所述的保护是通过抑制肝细胞HO-1的上调实现对肝细胞的保护；上述的具体实施例中，所述的肝细胞为人正常肝细胞。

本发明的第二个方面是提供淫羊藿素在制备保护APAP急性肝损伤制剂中的应用；在一个具体的实施例中，所述的保护是抑制药物性肝损伤引起的血清中谷丙转氨酶(简称ALT)和谷草转氨酶(简称AST)的升高；优选的，所述的肝损伤为药物性肝损伤，最优选的为APAP诱导的急性肝损伤。

本发明中所使用的RSL3(CAS：1219810-16-8)结构式见式(I)；淫羊藿素(CAS：118525-40-9)结构式见式(II)；APAP(CAS：103-90-2)结构式见式(III)；

本发明的有益效果是1)本发明首次揭示了淫羊藿素具有保护RSL3诱导的正常肝细胞铁死亡的作用，对导致铁死亡的亚铁离子、脂质过氧化物和ROS水平的异常升高有较好的抑制作用，可调节PRDX6/Nrf2/HO-1通路；2)本发明首次揭示了淫羊藿素具有保护APAP诱导的急性肝损伤的作用；3)本发明为研制以淫羊藿素为基础的保护APAP急性肝损伤及铁死亡相关的肝损伤疾病药物提供了科学依据，具有重大的应用价值。

附图说明

图1RSL3对正常肝细胞存活率的影响；

图2铁死亡抑制剂验证RSL3诱导的肝细胞死亡形式；

图3凋亡抑制剂等验证RSL3诱导的肝细胞死亡形式；

图4淫羊藿素对正常肝细胞的影响；

图5淫羊藿素对RSL3诱导的肝细胞死亡的保护作用；

图6RSL3对肝细胞中亚铁离子水平的影响及淫羊藿素的保护作用；

图7RSL3对肝细胞中脂质过氧化物水平的影响及淫羊藿素的保护作用；

图8RSL3对肝细胞中ROS水平的影响及淫羊藿素的保护作用；

图9蛋白质组学结果显示RSL3和淫羊藿素对肝细胞中PRDX6表达水平的影响；

图10RSL3和淫羊藿素对肝细胞PRDX6、Nrf2和HO-1蛋白的影响；

图11APAP和淫羊藿素对小鼠肝脏组织形态的影响；

图12APAP和淫羊藿素对小鼠ALT、AST的影响。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例，对本发明的具体实施方案和技术方案作进一步的详述，需明确：本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下述实施例中所使用的的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

人正常肝细胞L02来自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库且已验证。

实施例1淫羊藿素保护RSL3诱导的肝细胞死亡。

试验方法：分别用0.01～2μM RSL3、5μM Fer-1和Lip-1、25μMDFO、2μM Z-VAD-FMK以及0.01～10μM淫羊藿素等单独或共同处理L02细胞24小时，用结晶紫染色法检测细胞存活率。

以细胞活力为评价标准，由图1-图3可知，RSL3能够剂量依赖性的诱导L02细胞死亡，且能够被铁死亡抑制剂Fer-1、Lip-1和DFO所抑制，但是凋亡抑制剂Z-VAD-FMK并不能够逆转L02细胞的死亡，说明RSL3在L02细胞中诱导的死亡形式为铁死亡；由图4、5可知，淫羊藿素对L02细胞无毒性，且能够显著提高L02细胞的存活率，并呈现浓度依赖效应。

实施例2淫羊藿素能够降低RSL3引起的细胞中亚铁离子、脂质过氧化物和ROS水平的上升。

试验方法：用0.5μM RSL3和5μM淫羊藿素单独或共同处理L02细胞，用Liperfluo、FerroOrange和DCFH-DA探针分别孵育细胞，用流式细胞仪或荧光显微镜检测细胞中亚铁离子、脂质过氧化物以及ROS水平的变化。

图6-8所示结果表明，RSL3能够提高L02细胞中亚铁离子、脂质过氧化物和ROS水平，而淫羊藿素与RSL3共同处理后能够显著改善上述指标的变化。

实施例3淫羊藿素能够通过PRDX6/Nrf2/HO-1通路来缓解RSL3引起的L02细胞铁死亡。

试验方法：用0.5μM RSL3和5μM淫羊藿素单独或共同处理L02细胞，取细胞，液氮冻存后送样完成蛋白质组学实验；另取细胞提取总蛋白，进行蛋白免疫印迹检测。蛋白免疫印迹检测中，用于检测PRDX6的一抗为抗PRDX6(Proteintech，13585)，用于检测Nrf2的一抗为抗Nrf2(CST，12721)，用于检测HO-1的一抗为抗HO-1(CST，43966)，二抗为兔二抗(MBL，458)。最后使用ECL发光试剂盒进行显影。

图9结果表明，RSL3处理之后，L02细胞中的PRDX6蛋白水平显著下调，而RSL3和淫羊藿素共同处理后PRDX6蛋白水平可上调至正常水平，且淫羊藿素单独处理不会影响PRDX6的变化。图10的结果表明，经蛋白免疫印迹检测结果可知，RSL3处理后，PRDX6的水平显著降低，Nrf2和HO-1的水平显著升高，而淫羊藿素能够抑制这些蛋白的变化。

实施例4淫羊藿素能够保护对乙酰氨基酚诱导的肝损伤。

试验方法：雄性C57BL/6N小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，24只，6周龄，将小鼠随机分为空白对照组、APAP肝损伤模型组，淫羊藿素处理组和APAP与淫羊藿素联合处理组。给予APAP的前四天，空白对照组和APAP模型组给予相应的溶剂，淫羊藿素处理组和APAP与淫羊藿素联合处理组以每天20mg/kg的剂量灌胃给药，在给予APAP的前一天，所有处理组禁食过夜，保持充足饮水。给予APAP当天，空白对照组和淫羊藿素处理组给予相应的溶剂，APAP肝损伤模型组和APAP与淫羊藿素联合处理组按相应体积腹腔注射300mg/kg的APAP。给予APAP后六小时，重新投掷鼠粮。腹腔注射APAP 24h后，取血和肝脏。肝脏一部分在10％的福尔马林中储存，剩余部分液氮急冻后冻存在-80℃。

以肝脏颜色和组织形态、血清ALT和AST作为评价标准，由图11可知APAP肝损伤模型组的肝脏呈现白色点状，而APAP与淫羊藿素共同处理组的肝脏组织形态与对照组相似，且由图12可知，APAP肝损伤模型组的ALT和AST显著升高，而淫羊藿素保护组能够显著降低ALT和AST水平。结果表明，在APAP诱导的肝损伤模型中，淫羊藿素处理对APAP诱导的肝损伤具有良好的保护效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。