再扫描光学系统和方法

技术领域

本公开涉及再扫描光学系统和方法，特别涉及此类系统和方法，其中再扫描系统的所谓静态样本光路设有棱镜和/或其中光学系统包括用于在静态样本光路中产生至少两个焦点的一个或多个光学元件。

背景技术

从2013年10月25日发布的De Luca GM、Breedijk RM、Brandt RA等人所著的Re-scan confocal microscopy:scanning twice for better resolution.Biomed OptExpress.2013；4(11):2644–2656.doi:10.1364/BOE.4.002644(下文称为“De Luca”)已知一种再扫描共聚焦显微镜。该显微镜具有两个单元：1)具有带有双重功能的一组扫描镜的标准共聚焦显微镜：扫描激发光和去扫描(de-scanning)样本光，以及2)将通过针孔的光“写入”到相机上的再扫描单元。通过控制相应扫描镜和再扫描镜的角振幅比，可以控制显微镜的特性。

在这样的再扫描系统中，重要的是扫描镜和再扫描镜执行同步移动。优选地，扫描镜的每次扫描与再扫描镜的对应扫描恰好同时开始、分别结束。如果扫描和再扫描镜移动不同步，那么获得的图像质量将低。如将理解的，在更高的扫描速度下，反射镜移动得更快并且同步的绝对误差的可接受边际变得更小。由于De Luca的系统中反射镜的同步程度有限，因此扫描速度也有限。

为了克服此类同步问题，可以使用单个扫描镜既用于扫描激发光，更一般地称为照明光，又用于再扫描荧光光，更一般地称为样本光。例如，Roth等人：Optical photonreassignment microscopy(OPRA).Optical Nanoscopy 20132:5(下文中简称为“Roth”)公开了一种光学光子重新指派显微镜。在这种显微镜中，激光发射488nm的照明光，该照明光被指引到二色分束器，该分束器将照明光反射到扫描单元上。扫描单元将照明光扫描到物镜上，该物镜将照明光聚焦到样本上。返回的荧光光然后被指引回扫描单元并被去扫描(de-scanned)。随后，使用二色分束器将荧光光从照明光中分离出来。在这种分离之后，荧光束穿过可调的检测针孔，该检测针孔可以被用于实现共焦切片。针孔定位在两个透镜之间，其中所述两个透镜扩展荧光束。在扩展之后，荧光束使用相同的扫描系统被再扫描，并经由透镜投射到相机。

后一种显微镜设置的缺点是，因为扫描和再扫描使用相同的扫描系统，所以光学设置相当大。即，去扫描的荧光光束一直被引导绕过扫描系统，然后被指引到扫描系统上，该扫描系统将荧光光束再扫描到相机上。因此，本领域中需要更紧凑的光学再扫描系统。

发明内容

因此，本公开的一个方面涉及一种用于在成像系统的成像平面上扫描样本光斑以便形成样本的图像的再扫描光学系统。该系统包括照明光学系统，用于将照明光指引并可选地聚焦在样本处，从而在样本处提供照明光斑。照明光斑引起样本光。该系统还包括检测光学系统，用于将样本光的至少一部分聚焦到成像系统的成像平面上，从而在成像平面上产生样本光斑。该系统还包括光指引元件，用于在样本之上和/或穿过样本扫描照明光斑并且对来自样本的样本光进行去扫描(de-scan)并且在成像系统的所述成像平面之上扫描样本光斑。检测光学系统被配置为沿着从光指引元件延伸的光路将去扫描的样本光指引回光指引元件，使得光指引元件可以在所述成像平面之上执行样本光斑的所述扫描。另外，

-光路设有被配置为倒置和/或逆转样本光的棱镜，和/或

-再扫描光学系统包括将被配置为在所述光路中引起样本光的至少两个焦点的一个或多个光学元件，和/或

-光路设有被配置为偏转样本光而不倒置样本光和/或被配置为偏转样本光而不逆转样本光的样本光偏转棱镜。

如果再扫描光学系统包括将被配置为在所述光路中引起样本光的至少两个焦点的所述一个或多个光学元件，那么优选地，光路设有这一个或多个光学元件，例如在这一个或多个光学元件定位在所述光路中的意义上。

光路可以被理解为被配置为使样本光逆转和/或倒置适当次数，使得样本光斑在成像系统的成像平面之上以正确的方向被扫描。什么是正确的方向将在下面更详细地解释。

在样本之上移动照明光斑也可以被称为扫描。在成像系统的成像平面之上移动样本光斑也可以被称为再扫描。在再扫描光学系统中，使用相同的反射镜进行扫描和再扫描，使得能够防止同步问题。如果两个分离的反射镜分别用于扫描和再扫描，那么这两个反射镜可能由于某种原因不同步，如背景部分中所解释的，这会使获得的图像劣化。

发明人已经意识到不可能在其中扫描镜和再扫描镜不能彼此独立地移动的光学再扫描系统中实现任意数量的反射镜。例如当扫描镜和再扫描镜是同一个反射镜和/或当扫描镜和再扫描镜之间存在某种机械连接时就是这种情况。在扫描镜由多面(例如，双面)反射器的一个反射表面形成并且而再扫描镜由多面(例如，双面)反射器的另一个反射面形成的意义上，扫描镜和再扫描镜可以机械连接。

如下面将要解释的，在再扫描系统中，重要的是样本光斑在成像平面之上以正确的方向被扫描。现在将参考图3解释这个原理。这个图的左手侧示意性地示出了当照明光斑24在其上或通过其被扫描时在样本22处发生的情况。照明光斑24不是无限小，而是具有空间光强分布，除其他因素之外，这是由于照明系统的有限数值孔径造成的。照明光斑的光分布示例在其中心处强度高，并且在远离中心处强度较低。作为示例，曲线图52示意性地示出了沿着线54的强度I。

图3逐行示出照明光斑24如何在粒子56和58之上从左到右被扫描。每行示出在特定时刻t1、t2、t3、t4等，照明光斑相对于粒子56和58的位置。在本文中，t1在t2之前，t2在t3之前，t3在t4之前，等等。首先，粒子56被照亮，然后粒子58被照亮。这些粒子在被照亮后被激发并随后发射样本光28。在实施例中，粒子56和58是荧光粒子并且样本光28是荧光光。

如所述的，照明光斑24拥有空间光强度分布，在这个示例中，该光强分布在其中心具有较高的强度而在其边缘具有较低的强度。因此，当这个照明光斑24在荧光粒子之上移动时，这个粒子将首先以较低强度被照亮，然后以高强度被照亮，然后再次以较低强度被照亮。

该图的右手侧示意性地示出了在每个时刻在成像系统46的成像平面44上可能发生的情况的三个不同示例A、B、C。每行针对特定时刻示出了存在于成像平面上的样本光28。原则上，粒子被照亮的强度越低，从这个粒子产生的样本光的强度就越低。这在图3中反映出来，因为结果所得的样本光28a(t1)具有比样本光28b(t3)更低的强度。较浅的色调在图中指示较低的强度。

图3还示出了成像平面上照明光斑24的图像60。这个图像也可以被称为照明光斑图像。照明光斑图像60定位在成像平面44上，如果照明光没有被仅使样本光通过的过滤器阻挡，那么来自样本的照明光斑的反射将定位在该成像平面44上。在图1和2中，此类过滤器被实施为二向色镜12。“照明光斑的图像”不应当被理解为照明光确实入射在成像系统46的成像平面44上。照明光斑图像60的中心62指示图像的中心，并且因此可以被理解为照明光斑24中高强度中心区域的“图像”。

另外，中心62也是本文中可以被称为样本光斑63的中心。为了清楚起见，样本光斑63仅在列B中以截断的形式指示。给定时间的样本光斑可以被理解为覆盖成像平面上的区域，其中如果样本的整个被照亮部分将在该给定时间发射样本光，那么成像平面上的该区域将接收该样本光。样本光斑不是无限小，并且也呈现空间光强度分布。另外，应当理解的是，这个光强度分布随着照明光斑24在样本之上和/或通过样本移动而变化。为了说明，如果照明光斑24没有照亮任何光激发粒子，那么样本光斑的强度在其空间分布中是处处为零的。这种情况例如发生在时间t1，此时照明光斑24尚未到达粒子56。另一方面，如果照明光斑24以其最大强度照亮样本中的粒子，即，如果照明光斑24的高强度部分(例如，中心)覆盖了粒子，那么样本光斑具有相对高的强度。这例如发生在照明光斑24的中心照亮粒子56的时间t3和照明光斑24的中心照亮粒子58的时间t6。另外，在时间t2，照明光斑24微弱地照亮粒子56，这在成像平面中产生所谓的离轴样本光28。在t2，样本光斑63在样本光28d不与样本光斑63同心的意义上表现出不对称的光强度分布。在再扫描光学系统中，照明光斑的图像60所在的方向以及因此样本光斑在成像平面之上移动的方向的选择应当考虑如下：照明光斑在样本之上和/或通过样本的移动方向以及照明光斑60的图像在成像平面44处的朝向(这也可以被称为样本光斑的朝向)。

在成像平面之上扫描样本光斑63(以及因此照明光斑图像60)，在示例A中从左到右并且在示例B和C中从右到左。箭头61用作眼睛的引导，以便示出样本光斑在成像平面之上以恒定速度移动。

在任何给定时间，如果照明光斑24正在接近(或正在远离)在那个给定时间被照亮的任意粒子，这在那个给定时间导致在成像平面中的特定位置处的样本光28，那么照明光斑(和样本光斑63)的图像60也应当接近(或远离)那个特定位置。在本文中，在给定时间被照亮的任意粒子通常由照明光强度分布的低强度边缘照亮。

因此可以理解的是，在任何给定时间，照明光斑相对于在该给定时间在成像平面中的特定位置处引起样本光的被照亮粒子的移动方向因此应当基本上与照明光斑(和样本光斑63)的图像60相对于成像平面中的所述特定位置的移动方向相同。

如果照明光斑24的中心接近或远离粒子，那么照明光斑24可以被理解为接近或远离粒子。类似地，如果照明光斑图像60和样本光斑63的中心62接近或远离成像平面中的位置，那么照明光斑图像60(和样本光斑63)可以被理解为接近或远离那个位置。一个元件接近或远离另一个元件可以被理解为从一个元件到另一个元件的减少或增加它们之间的距离的任何相对移动。因此，“接近粒子”不应当被解释为仅限于“直接朝着粒子移动”。照明光斑将将经过(pass by)处于一定距离处的粒子，意味着照明光斑的中心不会覆盖那个粒子，也可以被称为照明光接近那个粒子。

示例A(从左到右)和C(从右到左)中样本光斑的63的移动方向是正确的，而示例B(从右到左)是错误的。这可以基于以上原则来确定。在示例A中，在t2，照明光斑24照亮粒子56。因此，在成像平面44处，样本光28a出现在成像平面的某个位置处，该位置在t2位于(照明光斑图像60和样本光斑63的)中心62的右侧。在t2，照明光斑24正在接近粒子56。因此，照明光斑图像60和样本光斑63在成像平面中的正确移动方向是朝着样本光28a出现的位置，即，向右。

对于每个示例，示出了成像平面44中的总空间强度分布64。用于A的聚合空间强度分布64A示出图像没有遭受显著的失真。但是，从结果64A中区分两个粒子56与58可能会有问题，因为在聚合光分布64A的中心似乎只有单个高强度区域，而不是两个分开的高强度区域。示例A与De Luca中所描述的其中光学系统表现出扫描因子M＝1的情况对应，如De Luca的图1B/1C中所示。

示例B与示例A的不同之处在于照明光斑图像60在相反方向上(从右到左)移动，而照明光斑图像60的朝向(以及因此样本光斑63的朝向)对于示例A和B是相同的。因此，聚合光强度分布64B高度失真。当然，当同时照亮许多粒子时，这种效果会更糟。

示例C与示例A的不同之处在于样本光斑60在相反方向上(从右到左)移动并且样本光斑63的朝向不同。在示例C中，样本光斑的朝向相对于示例A的样本光斑逆转(或倒置，具体取决于水平面的定义方式)。这使得样本光28c定位在样本光斑的中心62的左侧，而对于A，样本光28a定位在样本光斑的中心62的右侧。示例C在图像质量方面产生与示例A相同的结果。但是，聚集光分布64C相对于聚集光分布64A逆转/倒置。示例C也与D Luca中描述的其中系统表现出扫掠因子M＝1的情况对应。

综上所述，清楚的是，照明光斑图像60在成像平面44处的朝向起着重要的作用。毕竟，成像平面44中的照明光斑图像可以相对于由样本生成的样本光逆转和/或倒置。样本光斑63的朝向影响样本光28相对于样本光斑63的位置，特别是相对于样本光斑63的中心62的位置。样本光28可以例如定位在中心62的右侧或左侧，这取决于逆转的数量。逆转，也称为x翻转，可以被理解为绕垂直线旋转180度。例如，样本光可以定位在样本光斑中心的下方或上方，具体取决于逆转的次数。倒置，也称为y翻转，可以理解为绕水平线旋转180度。如上面所解释的，给定照明光斑的特定移动方向，样本光相对于照明光斑图像的位置确定了照明光斑图像应当朝哪个方向移动。

当再扫描光学系统包括单独可控的扫描和再扫描镜时，例如De Luca中所示的系统，那么可以容易地实现适当的扫描和再扫描方向。如果结果所得的图像高度失真，那么可能是照明光斑图像移动不正确。在这种情况下，只需简单地逆转其中一个反射镜的移动即可实现正确、高质量的成像。

遗憾的是，当不能单独控制扫描镜和再扫描镜时，这种校正是不可能的，例如因为系统包括既用作扫描镜又用作再扫描镜的反射镜。如果单独的控制是不可能的，那么照明光斑在样本之上和/或通过样本的特定移动与照明光斑图像在成像系统的成像平面之上的移动一一对应。

典型的再扫描系统有两条动态路径和两条静态路径。第一动态路径可以被理解为从扫描镜到样本再回到扫描镜的光路。第二动态路径可以被理解为从再扫描镜到成像平面的光路。第一静态光路可以被称为静态照明路径并且可以被理解为照明光所遵循的从光源到扫描镜的光路。第二静态光路可以被称为静态样本光路并且可以被理解为样本光所遵循的从扫描镜再次到达再扫描镜的光路。因此，在同一反射镜用于扫描和再扫描的情况下，静态路径是样本光所遵循的从(再)扫描镜再次回到(再)扫描镜的路径。如果在本公开中提及“光路”，那么除非另有说明或除非从上下文清楚地表示另一条光路，否则它是指静态样本光路。

如果发现包括单个反射镜作为扫描和再扫描镜的再扫描系统在错误的方向上移动样本光斑，那么在系统的动态路径中添加反射镜并不能解决问题。毕竟，如果在动态路径中添加反射镜，那么不仅会使得这个反射镜对样本光斑进行附加的朝向改变，而且还会翻转(再)扫描方向。清楚的是，(i)扫描方向和(ii)样本光斑的朝向的不正确的对(incorrectpair)不能通过逆转样本光斑的扫描方向和朝向来纠正。

基于以上关于样本光的朝向和扫描方向的考虑，重新设计Roth的光学设置以减小其尺寸并不简单。例如，不可能简单地重新设计静态路径并移除反射镜。如上面所解释的，这将产生失真的图像，因为它改变了照明光斑图像60在成像平面中的朝向而并不改变照明光斑图像60在成像平面中的移动方向。因此，照明光斑图像60的移动方向将是不正确的。

发明人已经意识到，通过实现用于在静态样本光路中形成至少两个焦点的棱镜和/或一个或多个光学元件和/或被配置为偏转样本光而不倒置和/或逆转样本光的样本光偏转棱镜，有可能实现更紧凑的光学设置。即，这些措施避免了在静态样本光路中实现第三个反射镜的需要，并实现了紧凑的光学设置。应当认识到的是，当然，理论上，可以将反射镜靠得很近放置，以使光学系统更紧凑。但是，在实践中，这非常麻烦并且在技术上具有挑战性。在实践中，如果许多反射镜彼此非常靠近地定位，那么常常一个反射镜的支撑结构阻挡从另一个反射镜反射的光束。而且，静态路径中存在的反射镜越多，正确对准它们就越困难。为了说明，如果静态样本光路中的样本光从第一反射镜反射，然后从第二反射镜反射，然后从第三反射镜反射到再扫描反射镜，那么第三反射镜的正确朝向取决于第一反射镜的朝向和第二反射镜的朝向两者。如果代替第三反射镜，例如在第二反射镜或一对透镜之后实现棱镜，那么只需正确对准第一和第二反射镜即可，并且棱镜或透镜对可以简单地放置在第二反射镜和再扫描镜之间的光路中。优选地，在入射在棱镜/透镜对上的光在命中棱镜/透镜对时与离开棱镜/透镜对时具有相同的传播方向的意义上，此类棱镜或透镜对不改变样本光的方向。因此，实现棱镜和/或光学元件(诸如用于创建至少两个焦点的透镜)使得能够减小再扫描光学系统的尺寸并同时简化光学设置。

优选地，样本光在其沿着静态样本光路的整个旅程中被逆转偶数次，例如零次或两次或四次或六次，而不是奇数次，例如，不是三次，如果此类逆转使得样本光斑的朝向围绕垂直于样本光斑的扫描方向的线翻转，那么所述线位于成像系统的成像平面中。

优选地，样本光在其沿着静态样本光路的整个旅程中被倒置偶数次，例如零次或两次或四次或六次，而不是奇数次，例如，不是三次，如果此类逆转使得样本光斑的朝向围绕垂直于样本光斑的扫描方向的线翻转，那么所述线位于成像系统的成像平面中。

为了说明，如果样本光斑仅在一个方向上被扫描，例如如下情况，如果照明光斑是线形状并且覆盖整个待研究样本，并且如果逆转(或倒置)静态样本光路中的样本光使得样本光斑的朝向绕垂直于所述扫描方向的线翻转，所述线位于成像系统的成像平面中，并且如果倒置(或逆转)在静态样本光路中的样本光使得样本光斑的朝向绕平行于所述扫描方向的第二条线翻转，所述第二条线也位于成像平面上，那么静态样本光路中的样本光的逆转(或倒置)的次数应当是偶数，例如零次或二次，并且静态样本光路中的倒置(或逆转)的次数可以是任意次数。

作为另一个示例，如果样本光斑在两个方向，x和y，上被扫描，例如如下情况，如果照明光斑是圆形并且在x和y方向上在待研究样本之上被扫描，并且如果静态样本光路中的样本光的逆转(或倒置)使得样本光斑的朝向绕垂直于x方向的线翻转，所述线位于成像系统的成像平面中，并且如果静态样本光路中的样本光的倒置(或逆转)使得样本光斑的朝向绕垂直于y方向的第二条线翻转，所述第二条线也位于成像平面中，那么静态样本光路中样本光的逆转的次数应当是偶数，例如零次或二次，并且静态样本光路中的倒置的次数也应当是偶数。

静态样本光路中的逆转(或倒置)例如通过样本光从反射镜的反射来实现。静态样本光路中的点焦点造成样本光的逆转和倒置。静态样本光路中的线焦点造成样本光的或者逆转或者倒置，具体取决于线焦点的朝向并假设线焦点未定向成使得它绕与扫描方向成非90度、非零度角的线翻转样本光斑的朝向。这种线焦点可以例如通过提供具有两个柱面透镜的静态路径来实现。优选地，由一个或多个光学元件造成的至少两个焦点造成至少两次逆转或造成至少两次倒置。例如，如果有两个并且只有两个由光学元件造成的焦点，那么一个焦点可以是线焦点而另一个焦点可以是点焦点。这两个焦点例如也可以是两个线焦点，它们都造成样本光的逆转。这两个焦点例如可以是两个线焦点，它们都造成样本光的倒置。两个焦点也可以是两个点焦点。

光指引元件可以是被配置为反射照明光和样本光的可移动反射器，诸如可移动反射镜。反射器在其可以绕旋转轴旋转的意义上可以是可移动的。附加地或可替代地，光指引元件可以是声光调制器(AOM)或电光调制器(EOM)。此类偏转器可以被用作具有可控反射方向的反射器。

光指引元件可以被理解为被配置为在样本之上和/或通过样本扫描照明光斑并且同时对来自样本的样本光进行去扫描(de-scan)并且同时在成像系统的所述成像平面之上扫描样本光斑。注意的是，在成像平面之上扫描样本光斑可以被称为再扫描。当然，如本文所使用的，由于光速不是无限大并且例如由于样本中光激发的分子在它们衰变并发射光子之前保持激发一段时间，因此如果两个事件，诸如扫描照明光斑和再扫描(由扫描照明光斑而产生的)样本光斑，被说成是同时发生的，那么实际上这两个事件可能一个发生在另一个之后不久。这是例如扫描和再扫描的情况，因为样本光必须经由静态路径从样本行进到再扫描镜。

应当认识到的是，至少两个焦点中的一个或多个(例如，全部)可以是线焦点。附加地或可替代地，至少两个焦点中的一个或多个(例如，全部)可以是点焦点。点焦点可以被理解为逆转和倒置样本光两者，而线焦点仅逆转或仅倒置样本光，这取决于线焦点的朝向。

优选地，被配置为倒置和/或逆转样本光的棱镜是被配置为提供样本光的直列倒置或逆转的棱镜。这可以被理解为命中棱镜的样本光的传播方向与离开棱镜的样本光的传播方向相同和/或离开棱镜的样本光的传播方向相对于命中棱镜的样本光的传播方向未横向位移。“横向”可以被理解为垂直于光的传播方向的方向。

优选地，一个或多个光学元件还提供直列倒置和/或逆转。另外，优选地，在它们至少透射感兴趣的波长(即，样本光的波长)的意义上，一个或多个光学元件是透射光学元件。

本文描述的任何光学元件，诸如被配置为偏转样本光的样本光偏转棱镜，可以被理解为改变样本光的传播方向。这可以被理解为样本光刚好在命中光学元件之前具有第一传播方向，而当它刚离开光学元件时具有不同于第一传播方向的第二传播方向。

可选地，再扫描系统包括光源，例如本文所述的光源。可选地，再扫描光学系统包括显微镜系统，例如本文所述的显微镜系统。可选地，再扫描光学系统包括成像系统，例如本文所述的成像系统。

在实施例中，光路设有

-两个，而且只有两个，透镜，以及

-两个，而且只有两个，用于反射样本光的反射镜，以及

-所述棱镜被配置为倒置和/或逆转样本光。

这个实施例有利地确保样本光斑在正确的方向上被扫描。

在实施例中，被配置为倒置和/或逆转样本光的棱镜是Dove棱镜。这是有利的，因为它可以容易地对准并且Dove棱镜不改变光路的方向。

在实施例中，被配置为倒置和/或逆转样本光的棱镜是Pechan棱镜。

被配置为倒置和/或逆转样本光的棱镜也可以是Schmidt-Pechan棱镜、Abbe-Koenig棱镜、Porro-Abbe棱镜或双Porro棱镜。

在实施例中，光路设有样本光偏转棱镜，该棱镜被配置为偏转样本光而不逆转样本光和/或被配置为偏转样本光而不倒置样本光。这个实施例的优点在于它使得能够减少静态光路中的光学元件的数量。为了说明，代替被配置为倒置和/或逆转样本光的反射镜和(直列)棱镜，可以使用偏转样本光而不逆转或倒置它的单个样本光偏转棱镜。这允许甚至更紧凑的光学设置。这种样本光偏转棱镜可以是例如Bauernfeind棱镜或五棱镜。应当认识到的是，光路可以包括多个样本光偏转棱镜，这些棱镜被配置为偏转样本光而不逆转样本光和/或被配置为偏转样本光而不倒置样本光。

在实施例中，一个或多个光学元件包括至少三个透镜，优选地至少四个透镜。使用三个透镜，当适当地定位并具有适当的焦距时，可以轻松创建两个样本光焦点。

在实施例中，光路设有

-四个，而且只有四个，透镜，以及

-两个，而且只有两个，反射样本光的反射镜。

对于四个透镜，设计产生两个焦点的设置可能更简单，因为这样就可以在静态路径中实现简单的两个望远镜，每个望远镜由两个透镜形成。这些望远镜之一可以被用于将样本光聚焦在针孔或光学狭缝上。在这个实施例中，优选地，光路不包括被配置为倒置和/或逆转样本光的棱镜。有利地，四个透镜提供关于如何实现再扫描光学系统具有期望的光学放大倍率的灵活性。

在实施例中，光指引元件被配置为在第一扫描方向上在成像平面之上扫描样本光斑。在这种实施例中，样本光在所述光路中的逆转或倒置可以被理解为使得成像平面中样本光斑的朝向绕垂直于所述第一扫描方向并且位于成像系统的成像平面中的线翻转。在这个实施例中，所述光路被配置为在所述光路中造成样本光的偶数次逆转或倒置。

在这个实施例中，光指引元件还可以被配置为在成像平面之上不同于第一扫描方向的第二扫描方向(例如垂直于第一扫描方向)上对样本光斑进行扫描。在这种实施例中，样本光在所述光路中的倒置或逆转可以被理解为造成成像平面中样本光斑的朝向绕垂直于所述第二扫描方向并且位于成像系统的成像平面内的线翻转。在这个实施例中，所述光路被配置为在所述光路中造成样本光的偶数次逆转或倒置。

应当认识到的是，光学元件造成静态路径中的样本光的逆转和/或倒置，并且通过在静态光路中适当地组合这些光学元件，可以实现适当数量(即，偶数)的逆转(并且如果在两个维度中扫描样本光斑，也需要适当数量的倒置)。为了说明，透镜对通常造成样本光的一次逆转和一次倒置，(因此，单个透镜可以被理解为造成样本光的0.5次逆转和0.5次倒置)一对球面镜造成三次逆转(因此一个球面镜可以被理解为造成1.5次逆转)，反射镜造成一次逆转，五棱镜不会造成任何逆转或倒置但会偏转样本光，用作反射镜的棱镜造成样本光的一次逆转，Porro棱镜不会造成样本光的任何逆转或倒置，一对柱面镜可以被理解为造成样本光的三次逆转(因此柱面可以被理解为造成1.5次逆转)。另外，Dove棱镜造成样本光的一次逆转(或倒置，取决于其朝向)，Pechan棱镜造成样本光的一次逆转和一次导致，Abbe-Koenig棱镜造成样本光的一次逆转和一次倒置，Porro-Abbe棱镜造成样本光的一次逆转和一次倒置，双Porro棱镜造成样本光的一次逆转和一次倒置，并且柱面透镜可以被理解为造成0.5次逆转(或0.5次倒置，取决于它的朝向)。如所述的，可以在静态光路中适当地组合此类构建块以便实现偶数次逆转，并且如果需要，那么实现偶数次倒置。这将参考图1-2F更详细地解释。

在实施例中，照明光斑是线形状的照明光斑。这个实施例使得能够快速扫描样本。

在实施例中，该系统包括分光器，该分光器被配置为将照明光与样本光分离。分光器例如被配置为将照明光朝着样本反射并让样本光通过或者反射样本光并让照明光通过。优选地，过滤器定位在光路中。

在实施例中，分光器是用于将样本光与照明光分离的二向色过滤器，诸如二向色镜。

在实施例中，光路设有针孔和/或光学狭缝。这个实施例改进了系统的光学切片能力。针孔和/或光学狭缝优选地被配置为阻挡来自样本中未在扫描透镜的焦点上的区域的样本光。优选地，光路设有被配置为将样本光聚焦在针孔或光学狭缝处的光学元件。

在实施例中，成像系统被配置为随时间对入射在成像平面的样本光进行积分。成像系统可以被配置为在样本的单次扫描期间对入射在成像平面上的样本光进行积分。然后，优选地，成像系统被配置为在等于单次扫描的持续时间的时间段内对入射样本光进行积分。成像系统可以被配置为在样本的多次(例如，重复)扫描期间对入射在成像平面上的样本光进行积分。然后，优选地，成像系统被配置为在比单次扫描的持续时间更长的时间段内(例如，等于五个扫描周期)对入射样本光进行积分。成像系统可以被配置为在样本的扫描的一部分期间对入射在成像平面上的样本光进行积分。然后，优选地，成像系统被配置为在比单次扫描的持续时间短的时间段内对入射样本光进行积分。如本文使用的样本的单次扫描可以被理解为照亮样本上或样本中的感兴趣区域的每个位置一次的照明光斑，而例如样本的两次扫描可以被理解为照亮感兴趣区域的每个位置两次的照明光斑，等等。

在实施例中，再扫描光学系统被配置为以第一速度将照明光斑移动到样本之上和/或通过样本并且以第二速度将样本光斑移动到成像平面之上，使得第二速度不同于，优选地高于，更优选地大约基线速度的两倍。在本文中，基线速度被定义为第一速度乘以再扫描光学系统的光学放大倍率。这个实施例允许增加获得的图像的分辨率，如De Luca中所解释的。

在实施例中，该系统包括物镜，该物镜被配置为从样本收集样本光并将样本光聚焦在再扫描显微镜系统的主成像平面上。在这种实施例中，检测光学系统可以被配置为将主成像平面中的图像成像到成像系统的成像平面上，优选地具有大约0.5的光学放大倍率，这将意味着样本光斑在主图像平面(参见图1和2中的主图像平面16)中的图像是成像系统的成像平面44处的样本光斑的图像的两倍大。这个实施例允许实现M＝2的扫掠因子，同时以相等速度在主成像平面之上扫描照明光并在成像平面44之上扫描样本光。

本公开的一个方面涉及一种用于在成像系统的成像平面之上扫描样本光斑以便使用如本文所述的再扫描光学系统形成样本图像的方法。该方法包括使光指引元件在样本之上和/或穿过样本扫描照明光斑，并且对来自样本的样本光进行去扫描，并且在成像系统的所述成像平面之上扫描样本光斑。附加地或可替代地，这种方法包括指引样本光通过光路。

除非另有明确说明，否则针对特定实施例或关于特定实施例所讨论的元素和方面可以适当地与其它实施例的元素和方面组合。将参考附图进一步说明本发明的实施例，附图将示意性地示出根据本发明的实施例。将理解的是，本发明不以任何方式限于这些具体实施例。

附图说明

将参考附图中所示的示例性实施例更详细地解释本发明的各方面，其中：

图1示出了根据实施例的包括棱镜的再扫描光学系统；

图2示出了包括一个或多个元件的再扫描光学系统，这些元件在静态样本光路中产生至少两个焦点；

图2A-2C图示了根据相应的进一步实施例的进一步的再扫描光学系统，其中光路设有被配置为倒置和/或逆转样本光的棱镜；

图2D-2F图示了根据相应的进一步实施例的进一步的再扫描光学系统，其中光路设有棱镜，该棱镜被配置为偏转样本光而不逆转样本光和/或被配置为偏转样本光而不倒置样本光；

图3图示了根据实施例的照明光斑的扫描和样本光斑的再扫描；

图4图示了根据实施例的具有较高扫掠因子的照明光斑的扫描和样本光斑的再扫描；

图5图示了根据实施例的线形状照明光斑的扫描和样本光斑的再扫描。

具体实施方式

在图中，完全相同的附图标记指示完全相同或相似的元件。

图1图示了根据实施例的用于形成样本22的图像的再扫描光学系统2，例如再扫描显微镜系统2。这个光学系统2包括被配置为生成照明光6的光源4。但是，应当认识到的是，再扫描光学系统本身不包括光源。再扫描光学系统例如包括用于接收照明光的部件，诸如用于提供照明光的光纤的输入连接。光源4可以是激光器，诸如固态激光器或二极管激光器。光源4可以包括准直器(未示出)，该准直器被配置为产生具有相对大直径的平行光束，其中光束的横截面优选地具有均匀的强度分布。准直器可以包括一个或多个负透镜和一个或多个正透镜以生成扩展的准直光束。这种准直器在图6A中示出(参见附图标记70)。在示例中，由光源4生成的光束的直径为10mm。样本光6通常是激发样本22中的光子的光，因此也可以被称为激发光。但是，样本光也可以由其它效应产生，诸如反射、Raman效应、Billouin辐射等。照明光6从反射镜8反射并命中柱面透镜10，柱面透镜10将照明光聚焦到光指引元件14上，从而在反射镜14处造成水平线。在本文中，水平可以被理解为平行于所指示的x-z平面。柱面透镜10与光源4的孔径之间的光路距离优选地尽可能接近柱面透镜10的焦距

在照明光6入射在光指引元件14之前，它从二向色镜12反射。优选地，二向色镜12相对于传入的照明光6的传播方向以45度角定位，使得照明光6的传播方向在反射时改变90度。

光指引元件14将照明光6朝着扫描透镜15反射，该扫描透镜15被配置为将样本光聚焦在包括管透镜18和物镜20的显微镜17的主图像平面16(也称为界面平面16)上。再扫描光学系统本身不包括显微镜。它可以例如被配置为与显微镜建立光学连接。在所描绘的实施例中，扫描透镜15在主图像平面16处创建垂直线。在本文中，垂直可以被理解为平行于所指示的y轴。扫描透镜15与光指引元件14之间的距离大约等于扫描透镜15的焦距。在示例中，扫描透镜15的有效焦距大约为75mm。扫描透镜15例如具有2英寸的直径。

每个显微镜对于管透镜18可以具有不同的焦距。主图像平面16与管透镜之间的距离优选地等于管透镜的焦距。

在如本文所述的再扫描显微镜系统中，类似地对于任何显微镜系统，物镜20优选地是整个光学系统的NA限制组件。NA代表数值孔径。

物镜20被配置为将照明光聚焦到样本22上，从而在样本22上或样本22中产生照明光斑24。照明光斑24从样本22产生样本光28。这个样本光28可以是从样本反射的照明光。但是，通常，照明光6在样本中引起光致发光，例如荧光和/或磷光，并且一般而言，样本光28是光致发光，诸如荧光光和/或磷光。

物镜20被配置为捕获来自样本的样本光28。在返回途中，从物镜20到二向色过滤器12，样本光28沿着与照明光6在到达样本的路径上相同的路径行进。换句话说，从物镜20到二向色过滤器12，样本光路与照明光路基本相同。

在这个实施例中，样本光28穿过过滤器12。同时，过滤器反射已从样本22反射的任何照明光。因此，过滤器12可以被理解为将照明光6与样本光28分离。

在通过过滤器12之后，样本光入射在透镜30上。优选地，透镜30与光指引元件14之间的距离大约等于透镜30的焦距。在示例中，透镜30的焦距为80mm。

透镜30经由反射镜32将样本光28聚焦在光学狭缝34处。在示例中，光学狭缝具有大约50微米的宽度和2-3cm的长度。在样本光28通过光学狭缝34之后，它从反射镜36反射并与透镜38相遇。光学狭缝34与透镜38之间的光学距离优选地等于透镜38的焦距。透镜38可以与透镜30完全相同。

在透镜38之后，样本光入射在棱镜40上，该棱镜40倒置和/或逆转样本光。这个棱镜可以是如图1中所示的Dove棱镜。可替代地，它可以是任何其它类型的棱镜，诸如Pechan棱镜、Schmidt-Pechan棱镜、Abbe-Koenig棱镜、Porro-Abbe棱镜、双Porro棱镜。这些其它类型的棱镜可以定位在透镜38和再扫描镜14之间，就像Dove棱镜40一样。以使样本光斑在正确方向上移动的方式，棱镜40被配置为逆转和/或倒置样本光，因此也逆转和/或倒置成像平面44中的样本光斑63。

在棱镜40之后，样本光再次入射在光导向元件14上。透镜38与光指引元件14之间的光学距离优选地接近(例如，等于)透镜38的焦距。在这个实施例中，样本光28以与照明光6命中光指引元件的角度不同的角度命中光指引元件14。当样本光28命中光指引元件14时，光指引元件14用作在成像系统46的成像平面44之上扫描样本光28的再扫描器。

因此，图1的实施例中的静态样本光路设有

-两个，而且只有两个，透镜，以及

-两个，而且只有两个，用于反射样本光的反射镜，以及

-所述棱镜。

成像系统例如包括相机，诸如CCD相机。成像平面优选地包括以预定方式(例如，以2D格子)布置的多个像素。

在样本光28到达成像平面44之前，样本光28入射在再扫描透镜42上，该再扫描透镜42被配置为将样本光聚焦到成像平面44上。优选地，光指引元件14与透镜42之间的距离等于透镜42的焦距。在实施例中，透镜42与透镜15相同。透镜42可以具有75mm的焦距。

再扫描显微镜系统的光学放大倍率可以被理解为由物镜20和管透镜18的组合提供的光学放大倍率(在De Luca中称为M

应当认识到的是，主图像平面16中样本光斑的图像的速度v_16由第一速度v_1(即，照明光斑24在样本22之上和/或通过样本22的实际速度)与物镜30和管透镜28的组合的光学放大倍率的乘积给出，即，v_16＝v_1xM

然后在所描绘的实施例中，基线速度v_B由v_B＝v_1xM

在一个实施例中，第二速度(即，样本光斑在成像平面44之上移动的速度)大约是基线速度的两倍，v_2≈2xv_B。注意的是，第二速度等于成像平面44中的照明光斑的图像60在成像平面44之上移动的速度。这可以例如通过配置检测光学系统使得其以大约0.5的光学放大倍率，M

如De Luca中所描述的，所谓的扫掠因子M优选地大约等于2。在所描绘的实施例中，扫描和再扫描镜的相应振幅是相同的，当然，因为使用相同的反射镜作为扫描和再扫描镜。因此，在所描绘的实施例中，扫掠因子M由M＝(f_38)/(f_30)给出。

在图1中，照明光学系统包括反射镜8、透镜10、二向色镜12、扫描镜14、扫描透镜15。图1中的检测光学系统包括扫描透镜15、扫描镜14(其在检测的上下文中也可以被称为去扫描镜(de-scanning mirror)14)、二向色镜12、透镜30、反射镜32、光学狭缝34、反射镜36、透镜38、棱镜40、扫描镜14(其在检测的上下文中也可以被称为再扫描镜(re-scanningmirror)14)和透镜42。

单次扫描的持续时间可以在25ms和10秒之间。

在图1的实施例中，透镜30和38造成样本光在静态样本光路中的聚焦，特别是在光学狭缝34处。因此，两个透镜30和38造成样本光的倒置和逆转(因此样本光斑在成像平面44处的逆转和倒置)。另外，反射镜32造成逆转，反射镜36造成逆转并且棱镜40造成样本光的另一次逆转。因此，在静态样本光路中，样本光逆转四次并倒置一次。在所描述的实施例中，我们可以假设逆转使样本光斑在成像平面44中的朝向绕垂直轴翻转，并且倒置使样本光斑的朝向绕水平轴翻转，而样本光斑仅在水平方向中被扫描。因此，静态样本光路中样本光的逆转的次数应当为偶数并且倒置的次数可以为任意次数。由于样本光在静态样本光路中被逆转了四次，因此这是正确的。

图2示出了根据另一个实施例的再扫描光学系统。在这个实施例中，静态样本光路设有四个且仅四个透镜以及两个且仅两个反射样本光的反射镜。在这个实施例中，从光指引元件14返回到光指引元件14的静态样本光路即包括四个透镜30、38、48、49以及两个反射镜32和36。在这个特定实施例中，静态样本光路不包括棱镜。

应当认识到的是，两个附加透镜48和49在静态样本光路中引入了附加倒置和附加逆转，因此也影响了成像平面中样本光斑的朝向。因此，这些透镜使得样本光斑在成像平面44处的扫描方向是正确的。

特别地，四个透镜30、38、48和49在静态样本光路中产生样本光的两个焦点。因此，在所描绘的实施例中，四个透镜一起造成两次逆转和两次倒置并且反射镜32造成逆转并且反射镜36造成逆转。因此，在这条静态路径中，样本光28被逆转四次和倒置两次。在所描绘的实施例中，我们可以假设逆转造成样本光斑绕垂直线的翻转，而样本光斑被水平扫描。因此，综上所述，静态样本光路中样本光的逆转次数应当是偶数，因为静态样本光路中样本光的逆转次数为四次。

在这个实施例中，如De Luca中定义的扫掠因子M由M＝(f_38*f_49)/(f_30*f_48)给出。这个公式示出了附加的两个透镜48和49在如何实现例如M＝2的期望扫掠因子方面提供了灵活性。例如，如果透镜30与38是相同的，那么可以通过选择透镜49的焦距是透镜48的焦距的两倍来获得M＝2的扫掠因子。

在图2中，照明光学系统包括反射镜8、透镜10、二向色镜12、扫描镜14和扫描透镜15。图2中的检测光学系统包括扫描透镜15、扫描镜14(其在检测的上下文中也可以被称为去扫描镜14)、二向色镜12、透镜30、反射镜32、光学狭缝34、反射镜36、透镜38、透镜48、透镜49、扫描镜14(其在检测的上下文中也可以被称为再扫描镜14)和再扫描透镜42。

图2A图示了其中光路设有被配置为倒置和/或逆转样本光的棱镜的实施例。在这个实施例中，使用了Schmidt-Pechan棱镜(仅示意性地示出)。作为旁注，在这个实施例中，使用两个棱镜29a和29b来偏转样本光。如上面所解释的，在这个实施例中静态光路中的逆转次数应当是偶数。静态光路中的倒置次数无关紧要，因为样本光仅在一个方向上被扫描，因为样本光斑是线形状的。透镜对30和38可以被理解为造成一次逆转(因为它们造成狭缝34处的焦点)，棱镜29a造成一次逆转，棱镜29b造成一次逆转，并且Schimdt-Pechan棱镜也造成一次逆转。因此，静态光路中样本光的逆转总次数为四，为偶数，并且因此是正确的。

图2B图示了其中光路设有被配置为倒置和/或逆转样本光的棱镜的实施例。在这个实施例中，使用Abbe-Koenig棱镜39b(仅示意性地示出)。在这个实施例中，凸面镜29c和规则镜36被用于使样本光偏转。逆转次数为四次：凸面镜与透镜38一起造成两次逆转，反射镜36造成一次逆转，并且Abbe-Koenig棱镜39b造成样本光的一次逆转。当然，在这个实施例中可以使用造成样本光的一次逆转的任何其它棱镜。

图2C图示了其中光路设有被配置为倒置和/或逆转样本光的棱镜的实施例。在这个实施例中，使用Abbe-Koenig棱镜39b(仅示意性地示出)。在这个实施例中，凸面镜29c和凸面镜29d被用于使样本光偏转。逆转次数为四次：凸面镜29c和29d造成样本光的三次逆转，并且Abbe-Koenig棱镜39b造成样本光的一次逆转。当然，在这个实施例中可以使用造成样本光的一次逆转的任何其它棱镜。

图2D图示了其中静态光路设有样本光偏转棱镜35的实施例，该样本光偏转棱镜35被配置为偏转样本光而不逆转样本光和/或被配置为偏转样本光而不倒置样本光。在这个实施例中，样本光偏转棱镜35是Bauernfeind棱镜。这种棱镜偏转样本光而不逆转或倒置样本光。样本光在静态光路中总共逆转两次：透镜对30和38造成一次逆转，棱镜35不造成逆转，并且反射镜36造成一次逆转。

图2E图示了其中静态光路设有样本光偏转棱镜37的实施例，该样本光偏转棱镜37被配置为偏转样本光而不逆转样本光和/或被配置为偏转样本光而不倒置样本光。在这个实施例中，样本光偏转棱镜37是五棱镜。这种棱镜偏转样本光而不逆转或倒置样本光。样本光在静态光路中总共逆转两次：透镜对30和38造成一次逆转，棱镜37不造成逆转，并且反射镜32造成一次逆转。

图2F是与图2E相同的实施例，唯一的区别在于透镜对在反射镜32处产生样本光的焦点并且该狭缝存在于反射镜上。

图4示意性地图示了如果De Luca中提到的扫掠因子M等于2(M＝2)时会发生什么。如图3中所示，该图的左手侧示出样本22上发生了什么。照明光斑24在样本之上扫描并照亮第一粒子56，然后照亮粒子58。另外，列D、E和F说明了可能发生在成像平面44处的情况，取决于在成像平面44之上样本光斑的移动方向(以及因此照明光斑图像60的移动方向)，并取决于样本光斑的朝向(以及因此取决于照明光斑的图像60的朝向)。

列D和F说明了照明光斑图像的移动方向是正确的相应示例。列E说明了其中照明光斑图像60的移动方向是不正确的示例。获得的列E的图像64E高度失真。但是，互为镜像图像的结果64D和64F各自清楚地示出了分别与粒子56和58对应的两个高强度区域。这说明高于1的扫掠因子，优选地大约为2的扫掠因子(参见De Luca)，在清晰度方面产生更好的图像。用M＝2获得的图像64D和64F优于用M＝1获得的图像64A和64C。但是在图像64A和64C中不能区分两个单独的高强度区域，这两个区域将与两个粒子56和58对应，而在图像64D和64F中可以区分两个高强度区域。

图5图示了照明光斑24是线形状照明光斑的实施例。这种照明光斑例如由图1和2中所示的实施例形成。线形状照明光斑的优点是使得能够快速扫描样本。

这种线形状照明光斑24也具有空间强度分布。附图标记52指示沿着线54的照明光24中的光强度。

与图3和4中类似，图5的右手侧在三列G、H和I中指示在成像系统46的成像平面44处可能发生什么。特别地，样本光28的位置在不同的时刻t1-t7示出。还指示了线形状照明光斑24的高强度区域在成像平面44中的图像62。图像62指示如果反射的照明光没有被过滤器(例如，二向色镜12)阻挡，那么已经从样本22反射的照明光(的高强度区域)在成像平面44中所处的位置。进一步示出的是(线形状)样本光斑63。点划线指示样本光斑63的边界。为清楚起见，样本光斑63仅在列H中以截断的形式示出。应当注意到的是，63是照明光斑图像(图5中未指示)和样本光斑63两者的中心区域。

图6A图示了图1的再扫描光学系统的光学系列。图6A的顶部部分示出了照明光的光学系列并且图6A的底部部分示出了样本光的光学系列。在本文中，6a和6b分别描绘了从两个正交方向观察到的照明光。这些视图不同，因为柱面透镜10在14中引起线焦点，而不是点焦点，这最终在样本处产生线形状照明光斑。

在这个实施例中，平面14(即，光指引元件)是显微镜17的后焦平面72的共轭平面。另外，平面19、16、34(孔径狭缝)是显微镜17的焦平面(即，照明光聚焦的平面)的共轭平面。

图6B图示了来自样本的离轴样本光的光学系列。光轴由76指示。

本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并且不旨在限制本发明。如本文所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”旨在也包括复数形式，除非上下文清楚地另有指示。还将理解的是，术语“包括”和/或“包含”在本说明书中使用时指定所陈述的特征、整数、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但不排除一个或多个其它特征、整数、步骤、操作、元素、组件和/或其组的存在或添加。

以下权利要求中的所有部件或步骤加功能元素的对应结构、材料、动作和等同物旨在包括与如特别要求保护的其它要求保护的元素组合以执行功能的任何结构、材料或动作。本发明的实施例的描述是为了说明的目的而呈现的，但并不旨在是详尽的或限于所公开的形式的实施方式。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，许多修改和变化对本领域的普通技术人员来说是显而易见的。选择和描述实施例是为了最好地解释本发明的原理和一些实际应用，并使本领域的其他普通技术人员能够理解本发明的各种实施例以及适于预期特定用途的各种修改。