一种基于荧光定量PCR技术定量检测杜鹃花类菌根真菌的引物及检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于荧光定量PCR技术定量检测杜鹃花类菌根真菌的引物及检测方法。

背景技术

杜鹃花类菌根真菌(Ericoid mycorrhizal fungi,EMF)是专门定殖于杜鹃花科植物根部的菌根真菌，能够促进植物对营养元素的吸收和利用，增强植株的抗逆性，对杜鹃花科植物具有重要意义。

杜鹃花类菌根真菌属于有隔膜的真菌。丝孢菌类的树粉孢属(Oidiodendron)是经常被分离到的种类之一，其中Oidiodendron maius最早是Tokumasu(1973)在日本从杜鹃花科植物根系中首次分离并报道的。从此以后，在杜鹃花科其他的植物的根系中也相继发现了该菌的共生现象，是北半球常被分离到的杜鹃花类菌根真菌类型。研究表明杜鹃花类菌根真菌Oidiodendron maius利用硝态氮的能力较强，从而促进宿主植物对硝态氮的吸收。

测定菌根菌生物量对综合利用其生物资源、了解和研究菌根菌与其所在生境的各因素的关系、乃至其在生态系统中的生态位以及它在生态系统中物质循环中所起到的作用都有着十分重要的意义。目前，对于生态系统中共生菌生物量定量的相关研究仍处于不成熟阶段，相关调查研究的报道还很少。在研究杜鹃花类菌根真菌生态适应能力中，目前尚未发展出有效定量检测该菌的方法。实时荧光定量依赖于特异性引物和探针，特异地检测靶标菌的特定核苷酸序列，通过核酸数量来反映靶标菌的数量，是当前真菌定量检测的最有效技术手段，在白僵菌或绿僵菌的定量检测应用中已取得成功。杜鹃花类菌根真菌的定量检测技术缺乏，制约了其基础研究的深入，限制了杜鹃花类菌根真菌应用研究的进一步发展。

发明内容

本发明的目的是为了解决杜鹃花类菌根真菌(Oidiodendron maius)目前没有有效的定量检测技术的问题，而提供一种基于荧光定量PCR技术定量检测杜鹃花类菌根真菌的引物及检测方法。

本发明的一种基于荧光定量PCR技术定量检测杜鹃花类菌根真菌的引物，所述的引物序列如下：

上游引物EMS1：5'-TGAGACCAAAGTCCCCTTCAACCAAAA-3'；

下游引物EMS4：5'-TTGGTGGCAATCAA AAGAGATAC-3'。

采用本发明所述的基于荧光定量PCR技术定量检测杜鹃花类菌根真菌的方法，是按照如下方式进行：

步骤一、取活化好的杜鹃花类菌根真菌(Oidiodendron maius)菌丝，进行真菌基因组DNA提取；

步骤二、利用EMS1引物和EMS4引物，对DNA样本进行PCR扩增，得到IGS目的基因片段；

步骤三、阳性质粒的构建：

将IGS目的基因片段与线性化的质粒载体连接，转化入大肠杆菌中进行复制，筛选鉴定，得到阳性质粒；

步骤四、标准曲线的建立：

阳性质粒经紫外分光光度计测定并梯度稀释，进行荧光定量PCR扩增；根据各个浓度梯度的循环阈值采用计算机自动绘制荧光定量PCR标准曲线；

步骤五、取杜鹃花科植物的根部，进行总DNA的提取纯化，得到DNA样本；

步骤六、利用EMS1引物和EMS4引物，对步骤五中得到的DNA样本及阴性对照和阳性对照进行荧光定量PCR扩增，将步骤五的DNA样本的循环阈值与标准曲线对照，得到DNA样本中的IGS区基因片段拷贝数，进而得到样本中杜鹃花类菌根真菌(Oidiodendron maius)的浓度，即完成所述的基于荧光定量PCR技术定量检测杜鹃花类菌根真菌(Oidiodendronmaius)；

其中，阴性对照采用ddH

进一步地，所述的步骤二中所述的PCR反应体系及反应条件，具体为：

PCR反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃终延伸300s。

进一步地，所述的步骤四和步骤六中所述的荧光定量PCR反应体系总体积为20μL，具体为：

荧光定量PCR反应程序为：PCR采用两步法，95℃预变性3min，接着进行40个循环，每个循环为95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸35s。

进一步地，PCR完成后，按0.1℃·S

本发明具有以下有益效果：

1)特异性好、鉴定快速

引物包括杜鹃花类菌根真菌(Oidiodendron maius)的特异性序列，检测特异性高。环境中，特别是杜鹃花科植物根际微生物种类繁多，不容易进行分离培养后检测，本发明克服了这一不足之处，并且检测快速。

2)准确定量，灵敏度高

与普通PCR检测相比，本发明可以准确定量，目标DNA在200ng-200fg/μL浓度范围，都有良好的线性关系；同时检测具有重复性好的特点。

3)实用性好、应用范围广

可以定量检测植物根部的杜鹃花类菌根真菌(Oidiodendron maius)，为杜鹃花类菌根真菌(Oidiodendron maius)的相关研究提供技术支撑。

附图说明

图1是引物对EMS1/EMS4特异性检测杜鹃花类菌根真菌(Oidiodendron maius)的PCR扩增结果图；M为DL2000 bp DNAMarker(TaKaRa公司)，1-2的模板为杜鹃花类菌根真菌(Oidiodendron maius)DNA；

图2实施例2荧光定量PCR扩增的标准曲线图；纵轴为Cq，横轴为DNA拷贝数；标准误为0.993；

图3实施例2杜鹃花类菌根真菌接种处理后，笃斯越橘根部真菌DNA拷贝数；纵轴为DNA拷贝数；横轴为接种处理时间(一周，两周，一个月，两个月，三个月)。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面将详细叙述本发明所揭示内容的精神，任何所属技术领域技术人员在了解本发明内容的实施例后，当可由本发明内容所教示的技术，加以改变及修饰，其并不脱离本发明内容的精神与范围。

本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

实施例1

用于杜鹃花类菌根真菌(Oidiodendron maius)荧光定量PCR检测引物对的合成如下：

依据杜鹃花类菌根真菌(Oidiodendron maius)的IGS区核酸序列(如序列表SeqIDNo：3所示)，结合已经发表在GenBank上的不同国家和地区杜鹃花类菌根真菌(Oidiodendron maius)基因的IGS区段序列信息，通过比对分析，设计一对特异性引物，上游引物EMS1：5'-TGAGACCAAAGTCCCCTTCAACCAAAA-3'；下游引物EMS4：5'-TTGGTGGCAATCAAAAGAGATAC-3'，PCR反应体系以及反应条件如下：

PCR反应体系

PCR反应条件

扩增片段长度为468bp(图1)。引物使用时用双蒸灭菌水稀释至10μmol/L。

实施例2杜鹃花类菌根真菌(Oidiodendron maius)接种越橘根部，杜鹃花类菌根真菌(Oidiodendron maius)定殖数量的动态检测。

以笃斯越橘为实验材料，将杜鹃花类菌根真菌(Oidiodendron maius)接种笃斯越橘，利用已经构建好的荧光定量PCR技术体系对菌根真菌的定殖量进行动态检测。利用接种一周，两周，一个月，两个月，三个月后植株根部组织为实验材料，提取DNA，进行荧光定量PCR反应。

荧光定量PCR反应体系总体积为20μL。

所述的TB Green Premix Ex Taq(内含TaKaRa Ex Taq HS，dNTP Mixture，Mg

荧光定量PCR反应程序为：PCR采用两步法，95℃预变性3min，接着进行40个循环，每个循环为95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸35s，在72℃采集荧光。

循环结束后，分析扩增结果，计算待测样品杜鹃花类菌根真菌(Oidiodendronmaius)DNA含量。结果表明标准品具有极好的线性关系，相关系数为0.993(图2)；待测样品有明显的荧光信号增加，并且具有很好的动力学曲线。

杜鹃花类菌根真菌(Oidiodendron maius)定殖量在接种后最初的一个月内差异不显著。随着时间的增加，定殖量呈上升趋势。在接种2个月时，定殖量最高，而呈后下降趋势(图3)。

通过本检测技术对笃斯越橘根部样本的检测，可以准确分析分离的杜鹃花类菌根真菌(Oidiodendron maius)的定殖量，对杜鹃花类菌根真菌的研究及应用具有重要意义。