一种玉米花期调控的转录因子ZmCIB1基因及其应用

技术领域

本发明涉及功能基因和植物基因育种技术领域，具体涉及一种玉米花期调控的转录因子ZmCIB1基因及其应用。

背景技术

玉米是全球重要的粮食作物之一，也是中国种植面积最大的农作物，同时也是重要的工业原料和牲畜饲料，玉米产业的发展对我国国民经济水平的提高具有显著的推动作用。花期是农作物重要的农艺性状之一，影响农作物营养生长到生殖生长的转变，进而影响物质的积累、收获时间、种子脱水率以及轮作方式等，适宜的花期直接影响作物的产量和品质。所以挖掘控制玉米花期基因、揭示玉米花期调控机制，对选育适宜玉米花期种质资源具有重要的理论和实践意义。

bHLH是一类含有basic helix-loop-helix(bHLH)结构域的转录因子，也是真核生物中较大的一类转录因子，能特异性识别并结合基因启动子的E-box(5’-CANNTG-3’)顺式元件。植物中bHLH参与了次生代谢产物的调控、抗盐、抗低温等相关生命进程。目前玉米中关于bHLH调控花期的研究鲜见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可调节玉米开花时间的基因，为培育生育期适当的玉米品种提供依据。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

本发明提供一种玉米花期调控的转录因子ZmCIB1基因，该基因具有如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列，该基因全长1305bp，编码如SEQ ID NO.2所示的434个氨基酸，该基因定位于玉米细胞核中。

本发明提供一种上述玉米花期调控的转录因子ZmCIB1基因在促进玉米花期中的应用。

进一步改进在于，所述转录因子ZmCIB1基因通过促进玉米花期中心基因ZCN8的转录，且蛋白ZmCIB1与花期调控蛋白隐花色素蛋白CRY2互作，进而调控玉米花期。

进一步改进在于，所述玉米品种为Abe2或B73。

本发明提具有如下有益效果：

本研究利用自然群体全基因组关联分析(GWAS)和重组自交系RIL群体的QTL交叉分析，获得一个与玉米花期相关的转录因子ZmCIB1基因。该基因能显著促进玉米花期中心基因ZCN8的转录，且蛋白ZmCIB1能与隐花色素蛋白CRY2互作，该研究结果对丰富玉米种质资源、选育玉米新种质具有重要意义。

附图说明

图1为RIL群体亲本Abe2和B73花期表型(A)和遗传图谱(B)与SLAF分布(C)；

图2为RIL群体花期相关性分析(A)和散粉期QTL位点分析(B)以及散粉期统计分析(C)；

图3为GWAS分析与QTL交叉分析(A)以及overlapping区域基因共表达网络分析(B)；

图4为ZmCIB1的亚细胞定位分析，ZmCIB1定位于烟草细胞核中(A)；ZmCIB1定位于玉米原生质体细胞核中(B)；

图5为ZmCIB1具有转录激活玉米花期基因ZCN8的活性，ZmCIB1在烟草中激活Pro::ZCN8-LUC的表达(A)；Pro::ZCN8-LUC在B73和ABE2原生质体中的差异表达分析(B)；

图6为在酵母双杂交系统中验证ZmCIB1与CRY2相互作用；

图7为在烟草中验证ZmCIB1与CRY2相互作用；

图8为双分子荧光互补系统验证ZmCIB1与CRY2的互作；

图9为Co-IP验证ZmCIB1与CRY2相互作用。

具体实施方式

下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。

1、材料

本实施例所用方法如无特别说明均为本领域技术人员所知晓的常规方法，所用试剂等，如无特别说明，均为市售购买产品。

2、方法

2.1ZmCIB1基因的初定位及效应验证

利用B73与早花品种Abe2构建RIL群体，将F8代群体和亲本种植于海南和合肥(图1A，Abe2已套袋雌穗)，统计群体花期相关性状。利用简化基因组测序技术(SLAF)对268份后代和亲本进行重测序分析(图1B,C)，同时对RIL群体花期进行一年多点相关性分析(图2A)，结果表明海南与合肥两地的抽雄期(HNH,HFH)、吐丝期(HNS,HFS)和散粉期(HNA,HFA)之间高度相关。

利用CIM和ICIM两种作图方法进行QTL分析，发现在7号染色体上存在与散粉期有关的QTL位点(图2B)。对该位点进行基因型与散粉期表型相关性分析(图2C)，结果表明基因型为a(Abe2)的明显比基因型为b(B73)的散粉期提前。对QTL区间进行基因精细定位分析，结果表明控制花期的遗传位点位于M3和M4之间。

将实验室保存的340份自交系自然群体种植于海南，并对该群体的花期相关性状进行GWAS分析，结果表明7号染色体上的GWAS位点与QTL存在overlapping区域，该区域内存在一个bHLH类型转录因子基因ZmCIB1(图3A)，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过在线比对玉米共表达网络，该ZmCIB1基因与已报到的影响玉米花期的基因位于同一个模块中(图3B)，说明ZmCIB1基因可能参与了玉米的花期调控。

2.2ZmCIB1基因的亚细胞定位分析

通过构建ZmCIB1:GFP亚细胞定位载体，将其转化烟草中，利用激光显微镜观察GFP信号，结果显示ZmCIB1:GFP荧光信号与核定位marker信号重合，说明ZmCIB1:GFP定位于细胞核中(图4A)；同样将ZmCIB1:GFP载体转化玉米原生质体进行观察，结果发现ZmCIB1:GFP定位于玉米细胞核中(图4B)。

2.3转录激活玉米花期基因的表达功能分析

ZmCIB1是bHLH家族转录因子，为考察其是否具有转录激活玉米花期基因的表达功能，本实施例扩增出玉米ZCN8基因启动子序列(如SEQ ID NO.3所示)，使用双酶切法将ZCN8启动子连接于pGreenII-0800-LUC载体上，构建Pro:ZCN8-LUC转录激活报告系统。如图5A所示，与对照相比，当存在ZmCIB1时，带有Pro:ZCN8-LUC信号显著增强。利用大提质粒试剂盒提取所构建Pro::ZCN8-LUC重组质粒，分别导入B73和Abe2玉米原生质体中，培养24h后提取蛋白，以Rluc为内参，检测LUC酶活。结果显示在Abe2原生质体中的ZCN8启动子的LUC酶活要显著高于B73(图5B)，这说明Abe2对ZCN8启动能力要高于B73。

2.4酵母双杂交验证ZmCIB1基因与CRY2蛋白的相互作用

为筛选与蛋白ZmCIB1(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)的互作蛋白，使用双酶切法将ZmCIB1连接于过表达载体pCambia3301-GFP中，转化玉米后收集T1代阳性转基因玉米叶片，利用TAP蛋白提取buffer(50mM Tris-HCl,pH 8.0,150mM NaCl,0.1％IGEPAL,2.5mMEDTA,10％Glycerol,10mM 2-Mercaptoethanol MCH,1mM PMSF,10μM leupeptin andprotease inhibitor cocktail)进行总蛋白提取，离心取上清进行GFP beads富集，经SDS-PAGE电泳后切胶，开展蛋白质谱分析。结果发现蛋白cryptochromes2(CRY2，DNA序列见SEQID NO.4)存在于蛋白复合体中。前期研究表明拟南芥的开花时间受CRY2的调控，促进开花(Hongtao Liu等,Photoexcited CRY2 Interacts with CIB1 to RegulateTranscription andFloral Initiation inArabidopsis,2008,Science)。

为进一步验证蛋白ZmCIB1与CRY2蛋白的相互作用，利用酵母双杂交(Y2H)和双分子荧光互补(BILC和BiFC)开展实验分析。将CRY2及其同源蛋白CRY1和CRY3(DNA序列见SEQID NO.5和SEQ ID NO.6)的编码基因连接于pGADT7上，ZmCIB1连接于pGBKT7载体上，分别构建pGAD-CRY1、pGAD-CRY2、pGAD-CRY3和pGBK-CIB1，并转入AH109酵母中，分别利用二缺培养基和四缺培养基开展互作筛选，结果显示在酵母中ZmCIB1与CRY1、CRY2和CRY3都能发生相互作用(图6)，但是烟草BILC结果显示ZmCIB1仅与CRY2互作(图7)。

同样，我们使用双酶切法将目的基因连接于pCambia1300-YNE和pCambia1300-YCE构建的ZmCIB1与CRY2共转玉米原生质体，结果发现在激光共聚焦下显现出YFP信号，阴性对照并未显示任何信号(图8)。将ZmCIB1连接于pCambia1305-GFP载体中，同时将CRY2连接于pCambia1300-Flag中，转化农杆菌后侵染到烟草中进行免疫共沉淀(Co-IP)分析，结果证实了这两种蛋白之间的体内相互作用(图9)。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。