一株高效降解多种霉菌毒素的枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物制剂及天然产物应用技术领域，具体涉及一株高效降解多种霉菌毒素的枯草芽孢杆菌及其应用，尤其是一株活性抗菌脂肽高产枯草芽孢杆菌，以及所述高产菌株和抗菌脂肽在降解霉菌毒素中的应用。

背景技术

饲料的质量安全是保障养殖产品安全和食品安全的第一道关口，防止饲料霉变已成为饲料工业普遍关注的问题。据联合国粮农组织(FAO)估算，目前世界上至少有25％的谷物被霉菌毒素污染。我国霉菌毒素的污染状况更是不容乐观，霉菌毒素的污染率高达90％。在各种霉菌毒素中，危害较大的主要是黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮(F2毒素)、以及呕吐毒素和单端孢霉烯酮(T2毒素)。

由山东龙昌动保研究中心出具的《2021年中国饲料和原料霉菌毒素检测报告》对我国各地1088份饲料样品进行检测，发现在所有样品中多种毒素共存现象明显，其中检测到1种霉菌毒素的样品占5％，检测到2种霉菌毒素的样品占20％，检测出3种及以上霉菌毒素的样品占75％。不同类型样品中黄曲霉毒素B

霉菌毒素是由真菌(霉菌)产生的具有毒性的次级代谢产物。黄曲霉毒素由黄曲霉菌产生，黄曲霉毒素能引起肝坏死，降低生产效率，减少牛奶的产量，导致先天性缺陷、肿瘤以及抑制免疫系统。玉米赤霉烯酮毒素和呕吐毒素均由镰刀菌产生，具有多种强烈的毒性，对动物和人体危害极大。玉米赤霉烯酮及其代谢产物能够引起很多种类雌性动物的雌激素过多症和生殖障碍，例如进食污染玉米赤霉烯酮的饲料会引起母猪产生雌激素中毒症，导致假孕、不育、卵巢畸形和流产等一系列的生殖障碍。呕吐毒素可对动物的消化系统、血液系统、中枢系统以及钙磷代谢均产生影响。饲料中低剂量的呕吐毒素会引起动物食欲下降、体重减轻、代谢紊乱等症状，高剂量可导致动物呕吐，猪是对呕吐毒素最敏感的动物。

大量研究表明，霉菌毒素广泛存在于谷物、动物饲料以及农副产品中，特别是在玉米、小麦、水稻、花生等为原料加工食品或生产饲料中的玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素和呕吐毒素污染情况最为严重。虽然某些加工工艺(例如高温调质)可以杀死部分霉菌等微生物，但霉菌代谢所产生的毒素却难以消除。霉菌毒素污染饲料后，不仅直接危害动物的健康和人类健康，更限制粮食在食品医药、饲料及深加工产业中的应用。现有技术中大多采用蒙脱石吸附、酶解等方法消除霉菌毒素污染，但效果均不理想，且成本很高。

近年来，采用微生物益生菌及所产生的活性物质作为饲料添加剂对饲料的防霉起到了关键作用。但目前使用的饲用益生菌添加剂主要仅对单一霉菌毒素具有降解作用，例如，中国专利一株降解玉米赤霉烯酮毒素酵母菌及应用(CN105794963A)、用于降解黄曲霉毒素的枯草芽孢杆菌(CN101705203B)、一株高效降解呕吐毒素的屎肠球菌GXSCU1、微生物菌剂及其制备方法和应用(CN114437983A)。

饲料由于受原料来源和储存环境的影响，往往会受到多种霉菌毒素的影响，迄今为止，尚未发现一种微生物能够同时且不可逆的降解多种霉菌毒素。本发明通过筛选得到一株枯草芽孢杆菌，并对其次级代谢产物进行提取、分析，发现所述枯草芽孢杆菌及其分泌的活性抗菌脂肽能同时高效降解至少三种霉菌毒素，且解毒活性高、特异性强、作用效果温和，在饲料添加剂领域具有广阔的应用前景。

发明内容

由于霉菌毒素污染谷物和饲料的范围广、危害大，且现阶段单一使用可降解霉菌毒素的微生物作为菌剂或者制备饲用添加剂时存在降解效率较低的问题，不适合实际生产。为此，本发明针对现有技术中存在的不足，提供一种有益微生物(枯草芽孢杆菌)，所述微生物及其分泌的活性代谢产物(抗菌脂肽)能够高效降解饲料中或者加工原料中的多种霉菌毒素，尤其是能够降低黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素对人或动物的毒害，提高饲料或者食品加工原料的营养价值，为开发出高效、安全、环保，且能够降解霉菌毒素的微生态制剂奠定基础。

进一步的，本发明的目的还在于提供所述枯草芽孢杆菌在制备抗菌脂肽中的应用。

进一步的，本发明的目的还在于提供所述枯草芽孢杆菌或抗菌脂肽在降解多种霉菌毒素中的应用。

为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：

一株活性抗菌脂肽高产菌株，该菌株菌种为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，所述菌株是从大连长海海参深海养殖基地的深水海泥中筛选分离得到的；为便于记录和管理，发明人将其命名为：枯草芽孢杆菌BYA-KC-4；该菌株的形态特征表现为：菌落呈圆形，表面光滑，隆起，不透明，乳白色，边缘整齐，有一定黏度，直径l～2cm；革兰氏染色阳性；芽孢0.6～0.9(宽)×1.0～1.5μm(宽)，椭圆或卵圆形，芽孢形成后菌体无明显膨大。

该菌株已由发明人于2022年9月19日进行了保藏，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌株保藏号为：CGMCC No.25758。

进一步的，本发明还提供了所述枯草芽孢杆菌在制备抗菌脂肽中的应用，通过生物发酵方法用于制备抗菌脂肽。

进一步的，本发明还提供了一种利用所述枯草芽孢杆菌发酵生产抗菌脂肽的方法，包括以下步骤：

(1)菌种活化：将枯草芽孢杆菌接种于LB固体培养基中，于28～32℃培养12～24h，得到活化菌种；

(2)种子培养：将活化菌种接种至LB液体培养基，于28～32℃培养16～18h，得到一级种子液；

(3)扩大培养：取一级种子液接种至LB液体培养基，并于28～32℃培养16～18h，得到扩培种子液；

(4)发酵培养：取扩培种子液接种至发酵培养基，于28～32℃培养12～48h，得到发酵液；

(5)将步骤(4)的发酵液离心，得到发酵上清液，再用酸液调节发酵上清液的pH至2.5，产生沉淀，然后静置2h～24h使沉淀完全，弃去部分上清液，得到悬浊液，离心，得到沉淀物；

(6)将步骤(5)所得的沉淀物用无水乙醇抽提，得到提取液，过滤除杂，并在50-60℃条件下减压蒸馏乙醇溶剂，得到固体产物即为抗菌脂肽。

具体的，所述LB液体培养基的组成为：每升培养基中，胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g；使用时调节pH至7.0～7.2，并于121℃灭菌20min。

所述LB固体培养基为液体培养基中加入琼脂粉制备而成；具体组成为，每升培养基中，胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g，琼脂粉18.0g；使用时调节pH至7.0～7.2，并于121℃灭菌20min。

具体的，所述发酵培养基的组成为：每升培养基中，葡萄糖10.0g，牛骨蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，K

具体的，步骤(3)中扩大培养的接种量(体积分数)为1-2％。

具体的，步骤(3)中得到的扩培种子液，浓度为1x10

具体的，步骤(4)中发酵培养的接种量(体积分数)为2-5％。

具体的，步骤(5)中所述酸液为浓度5-8mol/L的盐酸溶液。

具体的，步骤(6)中沉淀物与无水乙醇的固液比为1g:20mL。

进一步的，基于一个总的发明构思，本发明还提供了所述枯草芽孢杆菌在降解霉菌毒素中的应用。

进一步的，基于一个总的发明构思，本发明还提供了所述抗菌脂肽在降解霉菌毒素中的应用。

具体的，所述抗菌脂肽能够同时降解多种霉菌毒素，所述霉菌毒素包括但不限于玉米赤霉烯酮毒、呕吐毒素、黄曲霉毒素B

进一步的，基于一个总的发明构思，本发明还提供了利用所述抗菌脂肽降解霉菌毒素的方法，包括以下步骤：

将制备得到的抗菌脂肽稀释，离心，得到上清液，将上清液与霉菌毒素溶液混合进行反应，调节反应体系至酸性，在35～38℃反应2～72h。

具体的，反应时调节反应体系的pH值为6.2。

具体的，所述霉菌毒素为玉米赤霉烯酮毒、呕吐毒素和/或黄曲霉毒素B

具体的，所述霉菌毒素溶液为玉米赤霉烯酮毒水溶液、呕吐毒素水溶液和黄曲霉毒素B

具体的，所述上清液浓度为50～100μg/mL。

具体的，所述霉菌毒素溶液浓度为200～10000ppb。

具体的，所述上清液与霉菌毒素溶液的体积比为(3～12)：1。

优选的，所述上清液与霉菌毒素溶液的体积比为10：3或4:1。

进一步优选的，所述上清液体积为1000～1200μL，霉菌毒素溶液的体积为100～300μL。

进一步的，本发明还提供了所述枯草芽孢杆菌或抗菌脂肽在制备霉菌毒素降解药剂中的应用。

进一步的，本发明还提供了所述枯草芽孢杆菌或抗菌脂肽在制备降解霉菌毒素饲用添加剂中的应用。

具体的，将所述枯草芽孢杆菌制备成菌粉作为饲用添加剂添加至饲料中，具体的添加量为每公斤饲料中添加3～5克。

进一步的，本发明还提供了一种降解霉菌毒素的菌剂，所述菌剂的活性成分包括枯草芽孢杆菌BYA-KC-4或其衍生的突变菌株，所述枯草芽孢杆菌BYA-KC-4的保藏编号为：CGMCC No.25758。

具体的，所述菌剂为液态菌剂或固态菌剂。

具体的，所述菌剂中枯草芽孢杆菌BYA-KC-4的菌浓度为1×10

进一步的，本发明还提供了所述降解霉菌毒素的菌剂的制备方法，包括以下步骤：

1)菌种活化：将枯草芽孢杆菌接种于LB固体培养基中，于28～32℃培养12～24h，得到活化菌种；

2)种子培养：将活化菌种接种至LB液体培养基，于28～32℃培养16～18h，得到一级种子液；

3)扩大培养：取一级种子液接种至LB液体培养基，并于28～32℃培养16～18h，得到扩培种子液；

4)发酵培养：取扩培种子液接种至发酵培养基，于28～32℃培养12～48h，得到发酵液即为液体菌剂。

具体的，步骤3)中扩大培养的接种量(体积分数)为1-2％。

具体的，步骤3)中得到的扩培种子液，浓度为1x10

具体的，步骤4)中发酵培养的接种量(体积分数)为2-5％。

进一步优选的，所述菌剂为复合菌剂，所述菌剂包括枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌、植物乳酸杆菌、酿酒酵母菌；各菌的用量配比为3:3:2:2。

与现有技术相比较，本发明的有益效果在于：

1、本发明经反复筛选得到一株对黄曲霉菌具有显著抑制作用的菌株，该菌株能够分泌较高产量的活性抗菌脂肽；经液质分析，可以得出，该菌株分泌的抗菌脂肽中主要成分为杆菌霉素D(Bacillomycin D)。有研究表明，目前为止，杆菌霉素D是唯一从微生物中得到且经鉴定具有抗黄曲霉菌和多种霉菌、以及霉菌毒素抗性的次级代谢产物，因此，本发明筛选得到的菌株能够用于降解多种霉菌毒素。

2、经试验验证，本发明筛选得到的枯草芽孢杆菌BYA-KC-4分泌的活性抗菌脂肽对玉米赤霉烯酮毒素的降解率为90％以上，对呕吐毒素的降解率为80％以上，对黄曲霉毒素B

3、本发明的枯草芽孢杆菌BYA-KC-4还能分泌脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶等多种酶类，且酶活性较高，这些消化酶对养殖动物的健康非常有益，该菌适合作为动物饲料添加剂或菌剂，促进动物生长发育，提高饲料利用率。

4、本发明的枯草芽孢杆菌BYA-KC-4还具有很好的抗逆性能，可耐受强酸强碱，具有良好的热稳定性和pH稳定性，适合添加到饲料加工过程中直接生产益生菌饲料。

5、本发明的枯草芽孢杆菌BYA-KC-4兼具多重优良特性，非常适合作为饲料添加剂使用，能高效降解多种霉菌毒素，能分泌多种消化酶，且抗逆性强，对动物无毒无害。因此，该菌用于开发新型生物脱毒剂、饲料添加剂等，降低饲料或者加工原料受霉菌毒素的污染，提高饲料利用率及营养价值，在饲料生产及养殖产业具有很好的应用价值及市场推广前景。

附图说明

图1为实施例1复筛的抑菌结果；

图2为实施例1复筛得到的菌株BYA-KC-4所产活性抗菌脂肽对黄曲霉菌作用的抑菌图；其中，标号1为乙醇对照，标号2为活性抗菌脂肽的乙醇溶液；

图3为实施例1使用液质联用分析仪对菌株BYA-KC-4所产的次级代谢产物进行分析的液相色谱图；

图4为本发明实施例1中菌株BYA-KC-4传代的遗传稳定性测定图；

图5为菌株BYA-KC-4的菌落形态图；

图6为本发明实施例4中枯草芽孢杆菌BYA-KC-4所产活性抗菌脂肽降解玉米赤霉烯酮毒素随时间变化曲线；

图7为本发明实施例5中枯草芽孢杆菌BYA-KC-4所产活性抗菌脂肽降解呕吐毒素随时间变化曲线；

图8为本发明实施例6中枯草芽孢杆菌BYA-KC-4所产活性抗菌脂肽降解黄曲霉毒素B

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步说明本发明，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例，凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

实施例中涉及到的培养基及试剂如下：

LB固体培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g，琼脂粉18.0g，加去离子水至1.0L；pH 7.0～7.2，121℃灭菌20min。

LB液体培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g，加去离子水至1.0L；pH 7.0～7.2，121℃灭菌20min。

PDA培养基：马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g，加去离子水至1.0L；自然pH，115℃灭菌30min。

发酵培养基：葡萄糖10.0g，牛骨蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，K

无菌生理盐水的制备：NaCl 8.5g，溶于少量蒸馏水中，再加蒸馏水至1000mL；121℃灭菌20min。

PBS(0.01mol/L)缓冲液的制备：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na

实施例1菌株的筛选方法

实施例1提供了一种具有霉菌毒素抗性的枯草芽孢杆菌的筛选方法，具体步骤如下：

1.菌株的分离：

从大连长海海参深海养殖基地的深水海泥中，取海泥样品1g，加入10mL无菌生理盐水，充分震荡混匀，得到样液，将样液进行梯度稀释(10

2.抗黄曲霉菌菌株的筛选

2.1黄曲霉菌的培养及孢子液的制备：将实验室保存的黄曲霉菌接种到PDA斜面上，于28℃培养6d；待孢子充分形成后，加入4mL无菌生理盐水将斜面上的黄曲霉孢子轻轻刮下，得到孢子悬浮液，并移至新的无菌管中，充分震荡后用血球计数板计数，并调制浓度为10

2.2抗黄曲霉菌菌株的初筛：取100μL步骤2.1得到的霉菌孢子液均匀涂布于PDA平板上；再将步骤1分离纯化得到的菌落点种到平板上，每个平板点种数量适中，每个菌落做两个平行；于28℃培养48h后观察试验菌菌落周围是否存在抑菌圈并进行筛选，得到初筛菌株，经过初筛得到两个菌株抑菌效果较好，分别编号为B-301、B-332；

2.3抗黄曲霉菌菌株的复筛：用接种环取一环步骤2.2初筛得到的有抑菌活性的菌株，接入LB液体培养基中，于37℃、180r/min振荡培养24h后，将培养液经8000r/min离心10min，收集上清液待用；

取100μL步骤2.1制备得到的霉菌孢子液均匀涂布于PDA平板上，每个板上放置三个牛津杯，分别做加入100μL和200μL步骤2.3上清液的试验组，以及加入100μL生理盐水的对照组；最后将所有平板置于28℃培养箱中培养48～72h，观察试验菌株周围是否有抑菌圈并测量抑菌圈直径大小，得到复筛结果，具体的复筛结果如表1和图1所示，可以看出编号为B-332的菌株抑菌圈较大。

表1

3.抗菌脂肽高产菌株的筛选

用接种环取一环步骤2.3复筛出的抑菌圈最大的菌株(编号为B-332)，并接入LB液体培养基中，于37℃、180r/min振荡培养18h后，再按2％接种量(体积分数)接入发酵培养基中，在30℃，180r/min的条件下发酵培养48h；将发酵后的发酵液离心、收集上清液，然后取1mL上清液加10μL浓度为6mol/L盐酸溶液，调节pH为2～2.5，搅拌混合均匀，发现有沉淀产生，再于4℃静置12h；离心收集沉淀物并用甲醇溶解，然后用0.2μm滤膜过滤，将过滤后的滤液采用液质联用分析仪(高效液相色谱/2695控制面板2998PDA，美国Waters公司)分析其中组分，其中液相色谱条件为：进样体积：15μL；柱温：30℃；DAD检测器检测范围：190-640nm；检测波长：200nm；流动相：超纯水和乙腈，其中A项为超纯水，B项为乙腈；梯度洗脱条件为：0-1min，5％B-5％B；1-20min，5％B-95％B；20-25min，保持95％B；质谱条件为：离子源：电喷雾电离(ESI)；雾化气温度：350℃；喷雾压力：35psig；正负离子毛细管电压：3500V；干燥气体流速：8L/min；离子扫描范围(m/z)：100-2000；

对滤液中的组分进行结构鉴定，并经过文献(1、李宝庆,鹿秀云,郭庆港,等.枯草芽孢杆菌BAB-1产脂肽类及挥发性物质的分离和鉴定[J].中国农业科学,2010,43(17):3547-3554.；2、Jasim B,Sreelakshmi K S,Mathew J,et al.Surfactin,iturin,andfengycin biosynthesis by endophytic Bacillus sp.from Bacopa monnieri[J].Microbial Ecology,2016,72(1):106-119.)比对，确认得到的化合物为杆菌霉素D(Bacillomycin D)，同时比较液相峰面积大小，筛选测出高产抗菌脂肽(杆菌霉素D)的菌株。经过复筛后的菌株菌液保存于-80℃。

4.最终筛选结果

经过上述筛选过程，最终得到一株对黄曲霉菌具有显著抑制作用的菌株，该菌株具有高产抗菌脂肽(杆菌霉素D)的性能。为便于记录和管理，发明人将其命名为：菌株BYA-KC-4。

本实施例步骤2.3复筛得到的菌株BYA-KC-4所产活性抗菌脂肽对黄曲霉菌作用的抑菌图如图2所示，图2中标号1为体积分数95％的乙醇对照，标号2为活性抗菌脂肽的乙醇溶液(其中，溶剂为体积分数95％的乙醇)，从图2中可以看出所制备的抗菌脂肽对黄曲霉菌有显著的抑制作用。

图3为步骤3中使用液质联用分析仪对菌株BYA-KC-4所产的次级代谢产物进行分析的液相色谱图，根据液质数据分析结果，可以得出，在16-20min内的a、b、c三个强吸收峰主要为相差一个亚基的杆菌霉素D(Bacillomycin D)的C

进一步的，发明人还进行了菌株BYA-KC-4产抗菌脂肽遗传稳定性测试，测试结果如图4所示，发明人将该菌株连续传代培养9次，发现其菌种性能仍然稳定，抑菌活性和抗菌脂肽(杆菌霉素D)的生产能力仍然不变。

实施例2菌株BYA-KC-4的形态特征和分子生物学鉴定

(一)形态特征：

将经过复筛得到的菌株BYA-KC-4菌液进行稀释100～1000倍，并涂布于LB平板上，于37℃培养24h，得到菌落，如图5所示；经观察发现，菌株BYA-KC-4的菌落呈圆形，表面光滑，隆起，不透明，乳白色，边缘整齐，有一定黏度，直径l～2cm；革兰氏染色阳性；芽孢0.6～0.9(宽)×1.0～1.5μm(宽)，椭圆或卵圆形，芽孢形成后菌体无明显膨大。

(二)生理生化特征：

该菌株接触酶反应、VP反应均呈阳性，能够还原硝酸盐，水解淀粉、明胶。在含1％～7％NaCl的液体培养基中均可正常生长，具体生理生化特征见下表2。

表2生理生化指标测定结果

注：+，表示结果为阳性：-，表示结果为阴性。

(三)分子生物学鉴定：

取培养后的菌株BYA-KC-4菌液进行PCR扩增得到16S rDNA基因序列，在NCBI上进行Blast比对，在GenBank数据库中检索，并做序列同源性分析，测序结果参见序列SEQIDNO.1，结果确定菌株BYA-KC-4为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

所述枯草芽孢杆菌BYA-KC-4已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2022年9月19日，保藏编号为CGMCC No.25758。

该菌的16S rDNA测序结果如SEQ ID NO.1所示，具体为：

1-60acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt cgagcggaca gatgggagct tgctccctga

61-120tgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ctgtaagactgggataactc

121-180cgggaaaccg gggctaatac cggatggttg tttgaaccgc atggttcagacataaaaggt

181-240ggcttcggct accacttaca gatggacccg cggcgcatta gctagttggtgaggtaacgg241-300ctcaccaagg cgacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacactgggactgag

301-360acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatggacgaaagtc

361-420tgacggagca acgccgcgtg agtgatgaag gttttcggat cgtaaagctctgttgttagg421-480gaagaacaag tgccgttcaa atagggcggc accttgacgg tacctaaccagaaagccacg

481-540gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtccggaattatt541-600gggcgtaaag ggctcgcagg cggtttctta agtctgatgt gaaagcccccggctcaaccg

601-660gggagggtca ttggaaactg gggaacttga gtgcagaaga ggagagtggaattccacgtg

661-720tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga acaccagtgg cgaaggcgactctctggtct

721-780gtaactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagataccctggtagtc

781-840cacgccgtaa acgatgagtg ctaagtgtta gggggtttcc gccccttagtgctgcagcta841-900acgcattaag cactccgcct ggggagtacg gtcgcaagac tgaaactcaaaggaattgac

901-960gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcgaagaaccttac

961-1020caggtcttga catcctctga caatcctaga gataggacgt ccccttcgggggcagagtga

1021-1080caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaagtcccgcaacg

1081-1140agcgcaaccc ttgatcttag ttgccagcat tcagttgggc actctaaggtgactgccggt

1141-1200gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatgacctgggcta

1201-1260cacacgtgct acaatggaca gaacaaaggg cagcgaaacc gcgaggttaagccaatccca

1261-1320caaatctgtt ctcagttcgg atcgcagtct gcaactcgac tgcgtgaagctggaatcgct

1321-1360agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg

实施例3利用枯草芽孢杆菌BYA-KC-4实现抗菌脂肽高产的方法

1.枯草芽孢杆菌BYA-KC-4的培养

1.1菌种活化：从-80℃冰箱中取出保存枯草芽孢杆菌BYA-KC-4的甘油冷冻管，于冰浴中将其冻融，用接种环将融化后的菌液接种于LB固体斜面培养基中，于30℃培养24h，进行菌种活化；

1.2种子培养：经斜面培养后，用接种环取一环斜面菌苔接种至10mL的LB液体培养基(使用容积为50mL的三角摇瓶)，于30℃、摇床180r/min培养16～18h，得到一级种子液；

1.3扩培种子：取1mL一级种子液接种至50mL的LB液体培养基(使用容积为250mL的三角摇瓶)，即接种量(体积分数)为2％，并于30℃、摇床180r/min培养16～18h，得到扩培种子液，其中枯草芽孢杆菌BYA-KC-4浓度为1x10

1.4发酵培养：取10mL扩培种子液接种至200mL的发酵培养基(使用容积为1L的三角摇瓶)，即接种量(体积分数)为5％，并于30℃、摇床180r/min培养48h，得到200mL发酵液，发酵液中菌浓度大约为10％(体积分数)。

2.利用枯草芽孢杆菌BYA-KC-4产活性抗菌脂肽的方法

2.1取上述枯草芽孢杆菌发酵液于8000r/min转速条件下离心10min，除去菌体沉淀，合并收集发酵上清液；

2.2取1L发酵上清液，用浓度为6mol/L的盐酸溶液调节上清液的pH至2.5，此时有沉淀产生，置于4℃冰箱过夜使其沉淀完全；次日再将部分上清液轻轻地倒掉，剩余的悬浊液于8000r/min转速条件下离心10min，收集沉淀物，其中1L发酵上清液中大约有8～10g沉淀物；

2.3将所得到的沉淀物用50mL无水乙醇反复溶解和提取3次，合并提取液；再选用0.22μm的微孔滤膜(混合膜，混合纤维微孔滤膜水系/尼龙过滤膜有机系，规格50mm*0.22μm，厚度0.8μm，购自上海新亚净化器件厂)对乙醇提取液进行过滤除杂，得到澄清的提取液(大约120～130mL)；

2.4将上述提取液经旋转蒸发仪在55℃条件下减压蒸馏乙醇溶剂，直到被完全蒸干；之后将旋蒸瓶壁上的固体物质刮下并研磨成粉末，得到抗菌脂肽提取物，经计算每1L发酵上清液中提取物产量为550～780mg，同时通过液相色谱峰面积归一化计算，可以得出提取物中，所鉴定的抗菌脂肽含量为96.57％；

进一步的，通过采用大孔树脂和硅胶柱层析的方法对提取物进行目标组分的分离纯化，经液相和质谱鉴定，可以得出，所鉴定的抗菌脂肽中杆菌霉素D成分达到93％以上，具体为93.36％，说明本实施例的方法能够实现高产抗菌脂肽(杆菌霉素D)的制备。

实施例4利用所述枯草芽孢杆菌BYA-KC-4获得的活性抗菌脂肽降解玉米赤霉烯酮毒素

1.样品处理：

取实施例3制备的活性抗菌脂肽0.7g溶于6.3mL PBS(0.01mol/L)缓冲液中，在10000r/min条件下离心10min，收集上清液作为样品溶液；取1200μL样品溶液加入300μL(浓度为2500ppb)玉米赤霉烯酮毒素作为试验组进行反应，对照组为1200μL PBS缓冲液中加入300μL(浓度2500ppb)玉米赤霉烯酮毒素；将反应体系的pH值调至6.2，试验组和对照组分别在37℃反应2h、5h、12h、24h、48h和72h取样，每次取样200μL。

2.玉米赤霉烯酮毒素含量检测(ELISA法，以下试剂盒为北京勤邦的ELISA玉米赤霉烯酮毒素试剂盒，其中各试剂用量及检测方法参见试剂盒中的具体使用方法)：

2.1将试剂盒从4℃冰箱中取出，置于室温30min；在96孔板上，将样品和标准品对应的微孔进行编号，每个孔做2孔平行。

2.2吸取20μL标准品或样品分别加至相应的微孔中，然后各加入100μL酶结合物工作液，轻轻震荡混匀，用盖板膜盖板后置于25℃避光环境中反应15min。

2.3小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干；每孔加入250μL去离子水，充分洗涤4-5次，每次间隔10s，泼掉板孔内洗涤液，用吸水纸拍干；拍干后若有气泡，用灭菌后的枪头戳破。

2.4每孔加入底物A液50μL，再加底物B液50μL，轻轻震荡混匀，于25℃避光反应5min；反应后可看到深浅不一的蓝色，颜色越深，代表毒素浓度越小，如整体颜色较浅，可延长反应时间到7min。

2.5每孔加入50μL终止液，轻轻震荡混匀，终止反应。

2.6用酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值。

3.标准曲线的制作：

配制玉米赤霉烯酮毒素标准品溶液，其浓度分别为0ppb、20ppb、80ppb、240ppb、1000ppb；所获得的玉米赤霉烯酮毒素每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值(E

百分吸光度值(％)＝E

以标准品百分吸光率为纵坐标，以玉米赤霉烯酮毒素标准品浓度(ppb)的对数为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程；将样品百分吸光率带入方程，得到样品中的玉米赤霉烯酮毒素浓度。

4.降解率计算公式：

玉米赤霉烯酮毒素降解率(％)＝(A

A

A(ppb):对应每小时玉米赤霉烯酮毒素浓度平均值；

5.检测结果：

如图6所示，可以看出，利用本发明枯草芽孢杆菌BYA-KC-4产的活性抗菌脂肽对玉米赤霉烯酮毒素进行降解时，降解作用随时间变化而增大；反应2h，枯草芽孢杆菌BYA-KC-4的活性抗菌脂肽对玉米赤霉烯酮毒素的降解率为27％；反应5h，对玉米赤霉烯酮毒素的降解率为58％；反应12h，对玉米赤霉烯酮毒素的降解率为77％；反应24h，对玉米赤霉烯酮毒素的降解率为84％；反应48h，对玉米赤霉烯酮毒素的降解率为90％；反应72h，对玉米赤霉烯酮毒素的降解率为92％。

实施例5利用所述枯草芽孢杆菌BYA-KC-4获得的活性抗菌脂肽降解呕吐毒素

1.样品处理：

取实施例3制备的活性抗菌脂肽0.7g溶于6.3mL PBS(0.01mol/L)缓冲液中，在10000r/min条件下离心10min，收集上清液作为样品溶液；取1200μL样品溶液加入300μL(浓度10000ppb)呕吐毒素作为试验组进行反应，对照组为1200μL PBS缓冲液中加入300μL(浓度10000ppb)呕吐毒素；将反应体系的pH值调至6.2，试验组和对照组分别在37℃反应2h、5h、12h、24h、48h和72h取样，每次取样200μL。

2.呕吐毒素含量检测(ELISA法，以下试剂盒为北京勤邦的ELISA呕吐毒素试剂盒，其中各试剂用量及检测方法参见试剂盒中的具体使用方法)：

2.1将试剂盒从4℃冰箱中取出，置于室温30min；在96孔板上，将样品和标准品对应的微孔进行编号，每个孔做2孔平行。

2.2吸取20μL标准品或样品分别加至相应的微孔中，然后各加入100μL酶结合物工作液，轻轻震荡混匀，用盖板膜盖板后置于25℃避光环境中反应15min。

2.3小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干；每孔加入250μL去离子水，充分洗涤4-5次，每次间隔10s，泼掉板孔内洗涤液，用吸水纸拍干；拍干后若有气泡，用灭菌后的枪头戳破。

2.4每孔加入底物A液50μL，再加底物B液50μL，轻轻震荡混匀，于25℃避光反应5min；反应后可看到深浅不一的蓝色，颜色越深，代表毒素浓度越小，如整体颜色较浅，可延长反应时间到7min。

2.5每孔加入50μL终止液，轻轻震荡混匀，终止反应。

2.6用酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值。

3.标准曲线的制作：

配制呕吐毒素标准品溶液，其浓度分别为0ppb、150ppb、500ppb、1500ppb、5000ppb。所获得的呕吐毒素每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值(E

百分吸光度值(％)＝E

以标准品百分吸光率为纵坐标，以呕吐毒素标准品浓度(ppb)的对数为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程；将样品百分吸光率带入方程，得到样品中的呕吐毒素浓度。

4.降解率计算公式：

呕吐毒素降解率(％)＝(B

B

B(ppb):对应每小时呕吐毒素浓度平均值；

5.检测结果：

如图7所示，可以看出，利用本发明枯草芽孢杆菌BYA-KC-4产的活性抗菌脂肽对呕吐毒素进行降解时，降解作用随时间变化而增大；反应2h，枯草芽孢杆菌BYA-KC-4的活性抗菌脂肽对呕吐毒素的降解率为23％；反应5h，对呕吐毒素的降解率为34％；反应12h，对呕吐毒素的降解率为55％；反应24h，对呕吐毒素的降解率为61％；反应48h，对呕吐毒素的降解率为67％；反应72h，对呕吐毒素的降解率为81％。

实施例6利用所述枯草芽孢杆菌BYA-KC-4获得的活性抗菌脂肽降解黄曲霉毒素B

1.样品处理：

取实施例3制备的活性抗菌脂肽0.7g溶于6.3mL PBS(0.01mol/L)缓冲液中，在10000r/min条件下离心10min，收集上清液作为样品溶液；取1200μL样品溶液加入300μL(浓度200ppb)黄曲霉毒素B

2.黄曲霉毒素B

2.1将试剂盒从4℃冰箱中取出，置于室温30min；在96孔板上，将样品和标准品对应的微孔进行编号，每个孔做2孔平行。

2.2吸取20μL标准品或样品分别加至相应的微孔中，然后各加入100μL酶结合物工作液，轻轻震荡混匀，用盖板膜盖板后置于25℃避光环境中反应15min。

2.3小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干；每孔加入250μL去离子水，充分洗涤4-5次，每次间隔10s，泼掉板孔内洗涤液，用吸水纸拍干；拍干后若有气泡，用灭菌后的枪头戳破。

2.4每孔加入底物A液50μL，再加底物B液50μL，轻轻震荡混匀，于25℃避光反应5min；反应后可看到深浅不一的蓝色，颜色越深，代表毒素浓度越小，如整体颜色较浅，可延长反应时间到7min。

2.5每孔加入50μL终止液，轻轻震荡混匀，终止反应。

2.6用酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值。

3.标准曲线的制作：

配制黄曲霉毒素B

百分吸光度值(％)＝E

以标准品百分吸光率为纵坐标，以黄曲霉毒素B

4.降解率计算公式：

黄曲霉毒素B

C

C(ppb):对应每小时黄曲霉毒素B

5.检测结果：

如图8所示，可以看出，利用本发明枯草芽孢杆菌BYA-KC-4产的活性抗菌脂肽对黄曲霉毒素B

综上所述，本发明经试验证明了所筛选得到的枯草芽孢杆菌BYA-KC-4具有高效降解多种霉菌毒素的能力，并且具有高产活性抗菌脂肽的性能，基于此，该菌在用于开发新型生物脱毒剂、饲料添加剂等，降低饲料或者加工原料受霉菌毒素的污染等方面具有很好的应用价值。

上述实施例为本发明实施方式的举例说明，尽管以用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它任何未背离本发明精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

SEQ ID NO.1为该菌的16S rDNA测序结果

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