优化SARS-COV-2刺突蛋白S1基因、包含该基因的mRNA及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的说，涉及一种SARS-COV-2刺突蛋白S1优化序列及其应用。

背景技术

SARA-COV-2病毒在人类宿主体内持续进化，导致不同变异株的出现，从原始毒株到Alpha株、Beta株、Gamma株、Delta株及Omicron株，病毒变异株的传播力、免疫逃逸能力及感染力逐渐加强。虽然以比较快的速度开发出的新冠疫苗并已用于接种，但新冠病毒突变株的出现对现有批准应用的疫苗保护力造成了持续的威胁。

刺突蛋白是新冠病毒与宿主细胞结合的重要结构，也是目前疫苗研发的重要靶点，刺突蛋白的基因突变改变了病毒的传染力及致病力，从而影响机体免疫应答的变化。刺突蛋白S蛋白是新型冠状病毒重要的致病靶点蛋白，包含S1和S2两个亚基，S1主要包含有受体结合区(RBD)，冠状病毒正是通过RBD与细胞表面受体结合来感染细胞。

目前，新冠病毒的变异主要主要发生在刺突蛋白，而疫苗的研究则是以全病毒或者病毒的部分元件作为免疫原，毒株的刺突蛋白发生变化后，现有疫苗的保护效力大幅度降低。现在Omicron株的流行及新冠病毒的变异速度快等问题给新冠疫情的防控带来很大的困扰。基于对新冠病毒突变株的研究，刺突蛋白的一些重要位点，比如，K417N、L452R、N460K、N501Y和D614G等的突变造成了对机体免疫系统的逃逸。虽然，疫苗公司针对变异毒株也进行了二代疫苗的研发，针对原始毒株和奥密克戎毒株的二价疫苗以及针对BA.5的加强免疫策略等。但由于新毒株突变导致免疫逃逸能力越来越集中以及RBD的进化速度加快等现象，针对BA.5加强针并不是很好的选择。

发明内容

为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供了一种SARS-COV-2刺突蛋白S1优化序列及其应用，通过对SARS-CoV-2的S1序列进行优化，优化后的S1基因所构建的mRNA能显示更高的细胞内表达量，所获得的mRNA分子在作为现行SARS-CoV-2mRNA S1抗原疫苗使用时，具有更强的体内免疫反应，同时，检测发现抗体反应可以维持更长的时间。

为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：

所述的优化SARS-COV-2刺突蛋白S1基因，其由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成。

编码所述优化SARS-CoV-2刺突蛋白S1的基因。

所述的优化SARS-CoV-2刺突蛋白S1基因，其编码序列是SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

所述的优化SARS-CoV-2刺突蛋白S1基因的构建方法，包括以下步骤：

(1)分段、第一轮Overlap PCR扩增

将SARS-CoV-2刺突蛋白S1基因分为十二段，分别进行Overlap PCR扩增。

十二段分别为S1序列的70-251，223-310，291-479，461-660，642-1032，993-1147，1126-1260，1237-1389，1363-1497，1478-1650，1628-1855，1831-2067。

设计引物将优化的基因位点引入，同时设计20bp同源臂序列，分别克隆获得十二段单独序列。表1十二个片段的扩增引物

(2)第二轮PCR扩增

将第一段和第二段序列PCR拼接：以步骤(1)的70-251和223-310片段的扩增产物为模板，1-F和2-R为引物扩增，获得基因序列1。

将第三段和第四段序列PCR拼接：以步骤(1)的291-479和461-660片段的扩增产物为模板，3-F和4-R为引物进行扩增，获得基因序列2。

将第五段和第六段序列PCR拼接：以步骤(1)642-1032和993-1147片段的扩增产物为模板，5-F和6-R为引物扩增，获得基因序列3。

将第七段和第八段序列PCR拼接：以步骤(1)1126-1260和1237-1389片段的扩增产物为模板，7-F和8-R为引物扩增，获得基因序列4。

将第九段和第十段序列PCR拼接：以步骤(1)1363-1497和1478-1650片段的扩增产物为模板，9-F和10-R为引物扩增，获得基因序列5。

将第十一段和第十二段序列PCR拼接：以步骤(1)1628-1855和1831-2067片段的扩增产物为模板，11-F和12-R为引物扩增，获得基因序列6。

(3)第三轮PCR扩增

将基因序列1和基因序列2进行PCR拼接：以步骤(2)的基因序列1和基因序列2为模板，1-F和4-R为引物扩增获得基因序列7。

将基因序列3和基因序列4进行PCR拼接：以步骤(2)的基因序列3和基因序列4为模板，5-F和8-R为引物扩增，获得基因序列基因序列8。

将基因序列5和基因序列6进行PCR拼接：以步骤(2)的基因序列5和基因序列6为模板，9-F和12-R为引物扩增，获得基因序列9。

(4)第四轮PCR扩增

将基因序列7和基因序列8进行PCR拼接：以步骤(3)的基因序列7和基因序列8为模板，1-F和8-R为引物扩增，获得基因序列10。

将基因序列8和9进行PCR拼接：以步骤(3)的基因序列8和基因序列9为模板，5-F和12-R为引物扩增，获得基因序列11。

(5)以基因序列10和基因序列11为模板，13-F和12-R为引物，通过Overlap PCR拼接成，获得优化S1基因。

引物13-F核苷酸序列：5'-gccaccatggagaccgataccctgctgctgtgggtgctgctgctgtgggtgcctggctctaccggcgacgtaaacctgagaaccagaacccagc-3'。

一种SARS-COV-2刺突蛋白mRNA，该刺突蛋白mRNA的S1基因为上述的优化S1基因。

所述刺突蛋白mRNA，其构建方法包括以下步骤：

(1)以5’-UTR做为主要的mRNA翻译调控元件，在其后加装一个Kozak序列gccacc；同时，在SARS-COV-2的S1基因之前加装具有分泌信号功能的IgK信号肽序列，在靶基因S1的TAA终止子后，加装3’-UTR。

(2)设计分段式的PolyA尾。

(3)HindIII和BamHI重组插入修饰构建的pVAX载体中。

(4)经克隆筛选、测序后获得转录表达稳定mRNA的质粒pMu-6。

(5)制备pMu-6质粒DNA，以BamHI酶切线性化，按程序进行体外mRNA转录；

(6)转录完成后，经RNase处理，过柱纯化，获得mRNA。

进一步，所述5’-UTR为yellow fever virus 17D株基因的5’-UTR；所述3’-UTR为人类线粒体基因中的核糖体基因的3’-UTR。

所述分段式的PolyA尾的序列如SEQ ID NO.4所示，SEQ ID NO.4：

aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagcttatgactaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaccgcgtgctgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa。

所述的IgK信号肽序列为5’-atggagaccgataccctgctgctgtgggtgctgctgctgtgggtgcctggctctaccggcgac-3’。

所述的mRNA在用于制备预防或治疗新冠病毒感疫苗中的应用。

一种预防或治疗新冠病毒感染的疫苗，包含上述mRNA。

本发明的有益效果：

本发明通过对SARS-CoV-2刺突蛋白S1基因进行优化，相比于不经优化的S1基因：本发明优化后的S1基因所构建的mRNA能显示更高的细胞内表达量，所获得的mRNA分子在作为现行SARS-CoV-2mRNA S1抗原疫苗使用时，具有更强的体内免疫反应，同时，检测发现抗体反应可以维持更长的时间。

附图说明

图1是本发明实施例2的mRNA构建方法示意图；

图2是本发明实施例2的mRNA的质粒转录表达效果对比；

图3是本发明实施例2的mRNA转染293细胞表达效果对比；

图4是本发明的实施例4所构建S1 mRNA免疫小鼠后体液及细胞免疫反应对比。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的说明，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下多获得的其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了更清楚说明本发明，下面通过以下实施例进行详细说明。

实施例1

一种优化SARS-CoV-2刺突蛋白S1基因，其构建方法包括以下步骤：

(1)分段、第一轮Overlap PCR扩增

将SARS-CoV-2刺突蛋白S1基因分为十二段进行PCR扩增，PCR体系：模板(30ng)1μL，上下游引物(10pM)各1μL，Taq聚合酶2μL，10xPCR缓冲液2μL，dNTP混合物(2mM)2μL，无RNA酶水11μL；PCR扩增程序：98℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸(1kb/min)，34个循环。

十二段分别为S1序列的70-251，223-310，291-479，461-660，642-1032，993-1147，1126-1260，1237-1389，1363-1497，1478-1650，1628-1855，1831-2067。

设计引物将优化的基因位点引入，同时设计20bp同源臂序列，分别克隆获得十二段单独序列；

在引物设计时将优化的基因位点引入，分别克隆获得十二段单独序列。

表2十二个片段的引物

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(2)第二轮PCR扩增

①将第一段和第二段序列PCR拼接，获得基因序列1。

PCR体系：模板(第一段70-251和第二段223-310扩增产物各30ng)2μL，上下游引物1-F/2-R(10pM)各1μL，Taq聚合酶2μL，10xPCR缓冲液2μL，dNTP混合物(2mM)2μL，无RNA酶水10μL。PCR扩增程序：98℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸(1kb/min)，34个循环。

②将第三段和第四段序列PCR拼接，获得基因序列2。

PCR体系：模板(第三段291-479和第四段461-660扩增产物各30ng)2μL，上下游引物3-F/4-R(10pM)各1μL，Taq聚合酶2μL，10xPCR缓冲液2μL，dNTP混合物(2mM)2μL，无RNA酶水10μL。PCR扩增程序：98℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸(1kb/min)，34个循环。

③将第五段和第六段序列PCR拼接，获得基因序列3。

PCR体系：模板(第五段642-1032和第六段993-1147扩增产物各30ng)2μL，上下游引物5-F/6-R(10pM)各1μL，Taq聚合酶2μL，10xPCR缓冲液2μL，dNTP混合物(2mM)2μL，无RNA酶水10μL。PCR扩增程序：98℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸(1kb/min)，34个循环。

④将第七段和第八段序列PCR拼接，获得基因序列4。

PCR体系：模板(第七段1126-1260和第八段1237-1389扩增产物各30ng)2μL，上下游引物7-F/8-R(10pM)各1μL，Taq聚合酶2μL，10xPCR缓冲液2μL，dNTP混合物(2mM)2μL，无RNA酶水10μL。PCR扩增程序：98℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸(1kb/min)，34个循环。

⑤将第九段和第十段序列PCR拼接，获得基因序列5。

PCR体系：模板(第九段1363-1497和第十段1478-1650扩增产物各30ng)2μL，上下游引物9-F/10-R(10pM)各1μL，Taq聚合酶2μL，10xPCR缓冲液2μL，dNTP混合物(2mM)2μL，无RNA酶水10μL。PCR扩增程序：98℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸(1kb/min)，34个循环。

⑥将第十一段和第十二段序列PCR拼接，获得基因序列6。

PCR体系：模板(第十一段1628-1855和第十二段1831-2067扩增产物各30ng)2μL，上下游引物11-F/12-R(10pM)各1μL，Taq聚合酶2μL，10xPCR缓冲液2μL，dNTP混合物(2mM)2μL，无RNA酶水10μL。PCR扩增程序：98℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸(1kb/min)，34个循环。

(3)第三轮PCR扩增

①将基因序列1和基因序列2进行PCR拼接，获得基因序列7。

PCR体系：模板(基因序列1和基因序列2各30ng)2μL，上下游引物1-F/4-R(10pM)各1μL，Taq聚合酶2μL，10xPCR缓冲液2μL，dNTP混合物(2mM)2μL，无RNA酶水10μL。PCR扩增程序：98℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸(1kb/min)，34个循环。

②将基因序列3和基因序列4进行PCR拼接，获得基因序列基因序列8。

PCR体系：模板(基因序列3和基因序列4各30ng)2μL，上下游引物5-F/8-R(10pM)各1μL，Taq聚合酶2μL，10xPCR缓冲液2μL，dNTP混合物(2mM)2μL，无RNA酶水10μL。PCR扩增程序：98℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸(1kb/min)，34个循环。

③将基因序列5和基因序列6进行PCR拼接，获得基因序列9。

PCR体系：模板(基因序列5和基因序列6各30ng)2μL，上下游引物9-F/12-R(10pM)各1μL，Taq聚合酶2μL，10xPCR缓冲液2μL，dNTP混合物(2mM)2μL，无RNA酶水10μL。PCR扩增程序：98℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸(1kb/min)，34个循环。

(4)第四轮PCR扩增

①将基因序列7和基因序列8进行PCR拼接，获得基因序列10。

PCR体系：模板(基因序列7和基因序列8各30ng)2μL，上下游引物1-F/8-R(10pM)各1μL，Taq聚合酶2μL，10xPCR缓冲液2μL，dNTP混合物(2mM)2μL，无RNA酶水10μL。PCR扩增程序：98℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸(1kb/min)，34个循环。

②将基因序列8和9进行PCR拼接，获得基因序列11。

PCR体系：模板(基因序列8和基因序列9各30ng)2μL，上下游引物5-F/12-R(10pM)各1μL，Taq聚合酶2μL，10xPCR缓冲液2μL，dNTP混合物(2mM)2μL，无RNA酶水10μL。PCR扩增程序：98℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸(1kb/min)，34个循环。

(5)将基因序列10和基因序列11为模板，13-F和12-R为引物，通过Overlap PCR拼接成优化后的S1基因(其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)。

PCR体系：模板(基因序列10和基因序列11各30ng)2μL，上下游引物13-F/12-R(10pM)各1μL，Taq聚合酶2μL，10xPCR缓冲液2μL，dNTP混合物(2mM)2μL，无RNA酶水10μL。PCR扩增程序：98℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸(1kb/min)，34个循环。

实施例2(本实施例中SARS-CoV-2刺突蛋白S1基因为实施例1优化后的S1基因)

将实施例1所得S1基因构建到mRNA中，构建方法包括以下步骤：

(1)选取yellow fever virus 17D株基因的5’-UTR作为mRNA的其中一个翻译调控元件，在YFV 17D 5'-UTR后通过PCR扩增加装一个Kozak序列gccacc：上下游因为分别为引物-1F：5'-agtaaatcctgtgtgctaattga-3'，引物-1R：5'-ggtggcgttctggtcagttctctgctaa-3'；PCR程序:98℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸(1kb/min)，34个循环；PCR体系：yellowfever virus 17D株基因的5’-UTR为模板(30ng)1μL，上下游引物(10pM)各1μL，Taq聚合酶2μL，10xPCR缓冲液2μL，dNTP混合物(2mM)2μL，无RNA酶水11μL。

同时，在SARS-COV-2的S1基因和Kozark序列之间通过PCR扩增的方法，引入具有分泌信号功能的IgK信号肽序列：5’-atggagaccgataccctgctgctgtgggtgctgctgctgtgggtgcctggctctaccggcgac-3’，上下游引物分别为引物-2F：5'-gaactgaccagaacgccaccATGGAGACCGATACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCTGGCTCTACCGGCGACGTGAACCTGACAACCAGAACCCAGC-3'、引物-2R:TTATCTAGCTCTTCTAGGGCTATTG，PCR扩增程序：98℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸(1kb/min)，34个循环。PCR扩增体系：SARS-COV-2的优化后S1基因为模板(30ng)1μL，上下游引物(10pM)各1μL，Taq聚合酶2μL，10xPCR缓冲液2μL，dNTP混合物(2mM)2μL，无RNA酶水11μL。IgK信号肽序列为5’-atggagaccgataccctgctgctgtgggtgctgctgctgtgggtgcctggctctaccggcgac-3’。

在靶基因S1的TAA终止子后，加装人类线粒体基因中的核糖体基因的3’-UTR：引物-3F：5'-GTGAACCTGACAACCAGAACCCAG-3'，引物-3R：5'-TTAACTAAGCTATACTAACCCCAGGGTTGGTCAATTTCGTGCCAGCCACACCTTTATCTAGCTCTTCTAGGGCTATTG-3'，引物-4R：5'-CACGGGAAACAGCAGTGATTAACCTTTAGCAATAAACGAAAGTTTAACTAAGCTATACTAACCCCAG-3'，引物-5R：5'-CAAGCACGCAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTAGCCTAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGTGATTAACCT-3'。首先以引物-3F和3R进行第一轮PCR扩增，获得产物序列3，然后以产物序列3为模板，-3F和4R为引物，进行第二轮PCR扩增，获得产物序列4，最后以产物4为模板，-3F和5R为引物进行第三轮PCR扩增，获得产物5，产物5为加装有人类线粒体基因中核糖体的3'-UTR的S1序列。三轮PCR扩增程序和扩增体系均相同，扩增程序：98℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸(1kb/min)，34个循环；扩增体系：模板(30ng)1μL，上下游引物(10pM)各1μL，Taq聚合酶2μL，10xPCR缓冲液2μL，dNTP混合物(2mM)2μL，无RNA酶水11μL。

(2)设计分段式的PolyA尾；PolyA尾序列如SEQ ID NO.4所示，在3'-UTR序列后加装分段式的PolyA尾：引物6R：5'-ttttttttttttttttttttttttttttttttttttcagcacgcggttttttttttttttttttttttttttttttttttttagtcataagcttttttttttttttttttttttttttttttttttttcaagcacgcagcaatgcagctc-3'，以产物5为模板，以-3F和6R为引物，进行第四轮PCR扩增，获得带有3'-UTR和分段式PloyA尾的S1序列(产物6)。PCR扩增程序：98℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸(1kb/min)，34个循环。PCR扩增体系:模板(产物5，30ng)1μL，上下游引物(10pM)各1μL，Taq聚合酶2μL，10xPCR缓冲液2μL，dNTP混合物(2mM)2μL，无RNA酶水11μL。

最后以产物1、产物2和产物6为模板，1F和6R为引物，通过搭桥PCR(PCR扩增程序：98℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸(1kb/min)，34个循环)，扩增体系：模板(产物1、产物2和产物6各30ng)3μL，上下游引物(10pM)各1μL，Taq聚合酶2μL，10xPCR缓冲液2μL，dNTP混合物(2mM)2μL，无RNA酶水9μL。

扩增获得带有5'-UTR-Kozak序列-Igκ信号肽-S1-3'-UTR-Poly A的目的序列。

本实施例所用引物序列如表3所示

表3所用引物序列

(3)将载体pVAX1利用限制性内切酶HindIII和BamHI酶切成线性片段(37℃，酶切6h，酶切体系：模板DNA5μg(1μg/μL)，10x酶切缓冲液5μL，限制性内切酶各3μL，无菌无酶水34μL)，载体片段经胶柱回收后，将目的片段和载体片段按照摩尔比3:1进行16℃连接过夜插入pVAX1载体中。

(4)经转化、涂板、挑选单克隆、扩增、测序后获得转录表达稳定mRNA的质粒pMu-6。

(5)制备pMu-6质粒DNA，以BamHI酶切线性化(酶切体系：模板pMu-6质粒DNA2μg，限制性内切酶BamHI 2μL，酶切10x缓冲液5μL，无菌无酶水41μL,37℃下酶切5h)，经柱纯化回收后的线性化片段在37℃下和10x反应缓冲液(2μL)、T7 RNA聚合酶(2μL)、酵母无机焦磷酸酶(0.4μL)、RNA抑制剂(0.5μL)、线性化的模板DNA(1μg)和底物(25mM NTP混合物4.5μL)反应16h进行体外mRNA转录，其制备体系见表4。

(6)转录完成后，经RNase处理，过柱纯化，获得mRNA(序列如SEQ ID NO.3所示)。

表4.mRNA体外转录体系

实施例3

用实施例2相同的方法以普通的SARS-CoV-2刺突蛋白S1基因构建mRNA。

实施例4

利用实施例3和实施例4所得mRNA翻译表达体系诱导动物免疫反应

免疫程序如下：

A：分为两组进行免疫Balb/c小鼠，每组5只，分别免疫原始S1 mRNA(实施例3所得mRNA)和我们序列优化后的S1 mRNA(实施例2所得mRNA)，每组免疫剂量为10μg/只，肌肉注射。

B：分别在0、21天进行免疫，一免后21天，二免后14天、28天、90天、180天、270天取血检测抗SARS-CoV-2结合抗体与中和抗体。

结合抗体：使用抗Wuhan株、Beta株、Delta株、Omicron株的Elisa试剂盒平行检测。

中和抗体：使用抗Wuhan株、Beta株、Delta株、Omicron株的假病毒中和抗体检测体系，以及真病毒，包括Wuhan株、Delta株、Omicron株病毒用Vero细胞体系检测中和抗体。

上述工作表面，SARS-CoV-2S1序列优化后免疫小鼠具有更强的免疫反应(附图4)，其中包括针对不同变异株的良好的结合抗体反应和中和抗体反及细胞免疫反应，较目前现行的SARS-CoV-2S1序列免疫效果更为显著。同时，检测发现抗体反应可以维持较长时间(附图4)。这些资料提示，我们优化设计的SRAS-CoV-2S1序列在小鼠体内具有良好的交叉保护效果。

最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

SEQ ID NO.1

SARS-CoV-2刺突蛋白S1氨基酸序列

SEQ ID NO.2

SARS-CoV-2刺突蛋白S1核苷酸序列

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SEQ ID NO.3

mRNA核苷酸序列

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SEQ ID NO.4

PolyA尾

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